文章编号:042727104(2008)0320301205
收稿日期:2007207213
作者简介:尹 隽(1969—),女,讲师;通讯联系人钟 江,男,教授,E 2mail:jzhong@https://www.doczj.com/doc/126195376.html,.
Tn5转座子插入p95基因不影响
AcMNPV 的复制
尹 隽,胡志鹏,宋大新,钟 江
(复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系,上海200433)
摘 要:从Tn5转座子介导的AcMNPV 随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP 2P95in.PCR 确认p95基因中插入了Tn5转座子;Westernblot 也证实A 2cApra41和AcGFP 2P95in 感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95ku 变为55ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的.
关键词:杆状病毒;突变体;复制;基因表达
中图分类号:Q812 文献标识码:A
杆状病毒(Baculoviridae )是一类主要感染节肢动物的病毒,基因组为双链环状DNA,大小约为80～180kb [1].一方面它们作为基因表达载体已被广泛地用于生产各种蛋白质,另一方面它们也可以作为生物杀虫剂使用.在所有的杆状病毒中,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Auto gra pha cali fornica multiplenucle 2opolyhedrovirus,AcMNPV )是被研究得最为深入的一种病毒,该种病毒的基因组大小为133894b p,包括156个潜在的阅读框[2].尽管有一些基因已经被研究得很清楚,比如病毒的结构蛋白,必需的顺式作用因子等[327],但还是有许多基因的功能尚不清楚.为了能高效地研究这些未知基因,我们用Tn5转座子介导的随机插入突变法构建了AcMNPV 突变库(李惠等[8],尹隽等,待发表).
本文研究了从突变体库中筛选到的一株p95基因带有插入突变的突变体.研究结果提示完整的P95蛋白对病毒在细胞中的复制是非必须的.
1 材料和方法
1.1 细胞、病毒和菌株
草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞用TNM 2FH 培养基(Sigma 2Aldrich,MO,USA
)补充10%的小牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素培养.带有AcMNPV 基因组的质粒(bacmid )来源于Bac 2to 2Bac 系统(Invitro gen,CA,USA ),保存于大肠杆菌中,它转染Sf9细胞后可以复制产生感染性的AcMNPV [9].以在病毒多角体启动子下游插入绿色荧光蛋白基因(gfp )的bacmid (bacGFP )作为起始病毒基因组,利用体外转座系统构建了AcMNPV 随机插入突变体库(尹隽,发表中). E.coli BJ5183(RecA +)作为重组用菌
株,E.coli EC100(Epicentre,WI,USA
)用于保存bacmid.用于培养含bacmid 菌株的抗生素浓度分别为:卡那霉素(Kan )50m g/mL,庆大霉素(Gen )7m g/mL,阿普拉霉素(Apra )20m g/mL.
1.2 Tn5转座子插入定位
参见李惠等[8],简单介绍如下.根据AcMNPV 基因组序列,全基因组每隔1.5kb 沿同一方向设计了88个引物(分别命名为v1～v88,具体序列略).在转座子上设计两个引物Tn 2u p (5′2GTCTCCGACCT 2
第47卷 第3期
2008年6月复旦学报(自然科学版)JournalofFudanUniversit y (NaturalScience )Vol.47No.3Jun.2008
GATG 2CAGCTC 23′)和Tn 2down (5′2ACGACTACGCACTAGCCAACA 23′
)(图1).用v1～v88分别和Tn 2up,Tn 2down 组对作为引物,以突变体bacmidDNA 作为模板进行PCR 扩增,结果v45和Tn 2down 得到阳性PCR 产物.产物割胶回收后进行DNA 序列分析(上海英俊生物技术公司),得到转座子插入位置的上游一侧的序列.在距离上游插入位点约500b p 处再设计一个引物p95down (5′2CGGCGTCGGTCGTTTGAA 23′
),以p95down 和Tn 2up 作为引物再进行PCR,得到的产物同样测序,得到转座子插入位置下游一侧的序列(图1)
.
图1 转座子插入位置及引物示意图
Fig.1 Diagramofthelocusoftrans posoninsertionandsitesof primers
Orf 81,Ac 2TLP ,p 95:AcMNPV 编码基因;hr3:AcMNPV 基因组同源序列3,Tn5:Tn5
转座子;A pra :阿普拉霉素基因;v45,p95up,p95down,Tn 2up,Tn 2down:实验中所用
引物的位置和方向.数字代表在AcMNPV 上的相对位置
1.3 定向重组构建bacGFP 2P95in 重组病毒
在距离p95down 上游1kb 处设计引物p95up (5′2CTGATAACGTGCATCAACCG 23′
)(图1),以bacmidDNA 为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增,得到2.6kb 的片段,包括1.6kb 转座子序列和位于转座子序列两侧各0.5kb 的基因组序列.将该片段转化带有bacGFP 的大肠杆菌BJ5183菌株(BJ51832bacGFP ),让片段与bacGFP 发生同源重组.由于片段中的转座子序列含有Apra 抗性基因及启动子,用Kan/Gen/A pra 抗性平板筛选得到的就是同源重组后的bacmid 重组子.抽提重组bacmidDNA,以之为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR,并对扩增产物进行电泳检测.如果能得到2.6kb 产物,即为转座子插入p95基因的正确克隆.取同源重组bacmidDNA 电转化 E.coli EC100感受态细胞,得到的同源重组bacmid 命名为bacGFP 2P95in.抽提bacGFP 2P95inDNA,用Cellfectin (Invitro gen )转染Sf9细胞,得到重组病毒AcGFP 2P95in.同样以bacGFP 转染Sf9细胞,得到对照病毒AcGFP.
1.4 重组病毒AcGFP 2P95in 的鉴定
为了确定重组病毒的正确性,分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 病毒感染Sf9细胞(感染复数MOI=5
pfu/cell ),3d 后收取上清,分别抽取病毒基因组DNA.500μ
L 抽提液(20%PEG80001.6mol/LNaCl )与500μL 病毒上清混合,室温放置30min 后,15000r/min 离心15min.沉淀用20μLddH 2O 溶解后,加入
80μL 裂解液(10mmol/LTris
pH8.0,10mmol/LEDTA,20m g/mLRNaseA,0.25%SDS,80μg 蛋白酶K ).50℃反应1h 后,用等体积酚抽提.水相加入1/10体积3mol/LNaAc 及2倍体积的无水乙醇沉淀,即得到子代病毒的基因组DNA.以此为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增:94℃30s,58℃30s,72℃150s,共30个循环.
1.5 Westernblot 检测P95蛋白在Sf9细胞中的表达
24孔板中每孔接种大约2×105个细胞,同时加入适量病毒液使MOI 约为5pfu/cell.27℃培养72h 后,将贴壁细胞吹打下来,5000r/min 离心5min,沉淀用1×PBS 漂洗后,加入40μL2×SDS 样品缓冲液,进行SDS 2PAGE (10%)电泳分析和Westernblot 检测.一抗为用原核pET 系统表达的P95蛋白自制的鼠抗P95抗体(稀释倍数为1∶500),二抗为碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG 抗体(Sigma 公司,稀释比例为1∶30000).以BCIP/NBT 为底物,进行显色反应.
203 复旦学报(自然科学版)第47卷
1.6 重组病毒AcGFP 2P95in 生长曲线测定
以MOI=5
分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 感染Sf9细胞,在不同的时间取上清,按标准方法测
TCID50[10].2 结 果
2.1 Apra41筛选和转座子在基因组中的定位
从一个Tn5介导的杆状病毒随机插入突变体库中,抽提bacmidDNA 转染Sf9细胞,从中挑选出一株复制完全正常的突变体病毒AcApra41.该突变体能在细胞中产生明显的细胞病理效应,能形成子代病毒,且其极晚期启动子能启动报道基因gfp 的表达.通过对全基因组进行PCR 扩增,确定转座子插入位置(参见李惠等[8]),发现引物v45和Tn 2down 配对进行PCR 扩增可以得到1.3kb 的阳性条带,表明转座子反向插入病毒p95基因的编码区.测序结果证实转座子上游插在p95基因编码区的69304位点.在距离69304下游约500b p 处设计引物p95down,用p95down 和Tn 2up 进行PCR,得到0.5kb 产物,测序结果表明转座子下游与病毒基因组的交界在p95基因编码区的69294位点(图1).转座子插入造成11b p 的正向重复,破坏了p95基因的编码序列.
2.2 定向重组构建转座子插入p95的重组病毒
为了排除AcApra41中除了p95位点转座子插入外还有其他突变的可能性,用同源重组法构建了p95位点定向突变的bacmidbacGFP 2P95in,转染Sf9细胞得到重组病毒AcGFP 2P95in.同样用bacGFP 转染Sf9细胞得到对照病毒AcGFP.抽提AcGFP 2P95in 和AcGFP 感染细胞后产生的子代病毒DNA,通过PCR 验证定向重组病毒的正确性,结果如图2所示.以p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增时,AcGFP 产生1.0kb 片段,而AcGFP 2P95in 产生一个2.6kb 的片段(图2),表明有1.6kb 的转座子插入.这些与预期完全一致.以p95up 和Tn 2down,及p95down 和Tn 2up 引物对进行PCR 扩增,仅AcGFP 2P95in 可以得到约0.7kb 的产物(图2),而AcGFP 没有产物,这些也与预期结果完全一致.
为了进一步检验突变体病毒p95基因被破坏
.用抗P95蛋白N 端的抗体检测AcGFP,AcGFP 2P95in 和AcApra41感染的Sf9细胞中P95蛋白的表达,发现AcGFP 感染的细胞中有一条95ku
的条带(图3).AcGFP 2P95in 和AcApra41感染的细胞中缺少该条带,但均有一条约55ku 的条带,表明P95蛋白由于转座子的插入而截断了(图3).
图2 PCR 检验定向重组病毒AcGFP 2P95in
Fig.2 ConfirmationofrecombinantvirusAcGFP
2P95in
withtar getedinsertionofTn5图3 病毒感染Sf9细胞中P95蛋白的Westernblot 检测Fig.3 Westernblotanal ysisofP95proteininSf9cells infectedb yrecombinantviruses 2.3 AcGFP 2P95in 在Sf9细胞中的复制
分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 感染Sf9细胞,MOI=5.测定感染5,24,48和72h 后培养上清中的病毒效价,并用荧光显微镜(Nikon,FX35A )观察感染72h 后细胞表达GFP 的情况.结果表明,AcGFP 2
303
第3期尹 隽等:Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV 的复制
P95in 与AcGFP 有类似的病毒生长曲线(图4),且两株病毒由极晚期多角体启动子表达外源基因的水平也相当(图5).表明转座子插入p95基因并未造成AcGFP 2P95in 病毒的复制和基因表达发生明显的变化
.
图4 病毒感染细胞后胞外病毒增长的动态
Fig.4 Thekineticsofextracellularvirustitreincells
infectedb
yAcGFP 2P95inandAcGFP 图5 AcGFP 2P95in 和AcGFP 表达绿色荧光蛋白基因的比较(200×)Fig.5 ComparisonofGFPex pressioninvirusinfectedcells byfluorescentmicrosco py
左图:亮场显微镜;右图:荧光显微镜(200×
)3 讨 论
本研究从Tn5转座子随机插入杆状病毒突变库中分离到一个复制正常的突变体病毒AcApra41,确定该突变体中转座子位于病毒基因组69294～69304b p 处,破坏了p95基因的完整性.为了确保重组病毒的表型是由转座子的插入引起的,应用同源重组的方法构建了定向重组病毒AcGFP 2P95in.生长曲线测定表明重组病毒的复制状况与对照病毒类似,报告基因GFP 的表达也一致,说明p95基因的完整性对病毒复制并不是必须的.
AcMNPV p95基因编码一个由846个氨基酸组成的蛋白质,理论分子量为95ku.该基因的同源基因在BmNPV,O pMNPV 等多种杆状病毒中都有编码[11212].实验表明该蛋白是病毒核衣壳的结构蛋白[2,12].同源性分析表明该蛋白还带有几丁质结合域,但它们与蛋白功能的关系还不清楚.
本研究得到的p95基因插入突变的突变体,插入位置位于基因中间偏后位置,插入后破坏该基因,可以编码产生一个截短型P95蛋白.用抗P95蛋白N 端序列的抗体进行Westernblot 证实P95蛋白确实由野生型的95ku 变为一个约55ku 的蛋白.试验结果表明,转座子的插入并不影响病毒的正常复制和基因表达,这有三种可能:1)P95虽然是组成病毒粒子的结构蛋白,但对病毒的结构和在细胞中的复制并不是必须的;2)P95蛋白对病毒复制是必须的,但其N 端的序列已经能够发挥作用,不需要C 端的序列;3)P95的C 端序列对病毒复制也是必须的,在感染的细胞中它也能由某未知启动子驱动表达,但由于West 2ernblot 所用的抗体是针对N 端序列的,故无法检测到.虽然本研究的结果提示前两个可能性更大,但由于C 端尚有一段1.1kb 的长序列,目前尚不能完全排除第三种可能性.有研究表明BmNPV p95基因能转录出大小不同的两个mRNA [11],预示AcMNPVP95基因也可能存在这种情况.
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403 复旦学报(自然科学版)第47卷
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InsertionalDisru ptionofAcMNPV p95Genedidnot
AffectVirusRe plicationinSf9Cells
YINJuan,HUZhi2pen g,SONGDa2xin,ZHONGJian g
(Department of Microbiolo gy and Microbial Engineerin g,School of Li fe Sciences,
Fudan Universit y,Shan ghai200433,China)
Abstract:Are plication2competentmutantvirus,AcA pra41,wasisolatedfromalibrar yofAcMNPVrandominsertional mutantsconstructedwithTn5trans posonmediatedmuta genesis.TheTn5trans posonwasdeterminedtobelocatedinthe
p95geneofAcMNPV genome.Toexcludethe possibilitythatAcA pra41containedothermutations,arecombinantvirus, AcGFP2P95in,whichhadtar getedinsertionofTn5in p95geneinexactl ythesamewa yasinAcA pra41,wasconstructed byhomolo gousrecombination.TheinsertionofTn5trans posonwasconfirmedwithPCR.Theinsertionoftrans posonre2 sultedinthea ppearanceofatruncatedformofP95proteinof55kuincellsinfectedwithAcGFP2P95inasshownb y Westernblotusin gantibod ya gainsttheN2terminal partofP95protein,incontrastwiththefulllen gthP95proteinof95 kuincellsinfectedwithwildt ypevirus.Virusre plicationcurveandfluorescentmicrosco picobservationindicatedthat AcGFP2P95inre plicatedandex pressedviral genesnormall yaswildt ypevirusinSf9cells.Theresultsindicatedthatafull2 lengthP95proteinwasnotessentialforvirusre plication.
Ke ywords:Baculovirus;mutants;re plication;geneex pression 503
第3期尹 隽等:Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV的复制
The following protocols take MLCK (myosin light chain kinase) as an example. General steps: 1.BAC extraction (It is necessary for us to identify the BAC by PCR) 2.Transform BAC to EL350 ( Cm+) 3.Retrieving (Cm+ Amp+) 4. Targeting 1st lox P (Amp+ Amp+ and K+) 5. Transform MLCK 1st lox P to EL350 to get purify MLCK 1st lox P ( Amp+ and K+) 6. MLCK 1st lox P pop out (Amp+ and K+ AmP+) 7. Transform MLCK 1st lox P pop out to EL250 (Amp+) 8. Targeting 2nd lox P (Amp+ Amp+ and K+) 9. Transform MLCK 2nd lox P to DH-5α or XL1-Blue ( Amp+ and K+) 10. Linearization 1. BAC extraction Solution I: Tris.Cl 0.025 M EDTA 0.01M Glucose 0.05M pH 8.0 Solution II: SDS 1 % NaOH 0.2M fresh prepared (1Volume 2% SDS + 1Volume 0.4M NaOH) Solution III: (120 ml 5 M KAc + 23 ml HAc + 57 ml H2O) / 200 ml
文章编号:042727104(2008)0320301205 收稿日期:2007207213 作者简介:尹 隽(1969—),女,讲师;通讯联系人钟 江,男,教授,E 2mail:jzhong@https://www.doczj.com/doc/126195376.html,. Tn5转座子插入p95基因不影响 AcMNPV 的复制 尹 隽,胡志鹏,宋大新,钟 江 (复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系,上海200433) 摘 要:从Tn5转座子介导的AcMNPV 随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP 2P95in.PCR 确认p95基因中插入了Tn5转座子;Westernblot 也证实A 2cApra41和AcGFP 2P95in 感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95ku 变为55ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的. 关键词:杆状病毒;突变体;复制;基因表达 中图分类号:Q812 文献标识码:A 杆状病毒(Baculoviridae )是一类主要感染节肢动物的病毒,基因组为双链环状DNA,大小约为80～180kb [1].一方面它们作为基因表达载体已被广泛地用于生产各种蛋白质,另一方面它们也可以作为生物杀虫剂使用.在所有的杆状病毒中,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Auto gra pha cali fornica multiplenucle 2opolyhedrovirus,AcMNPV )是被研究得最为深入的一种病毒,该种病毒的基因组大小为133894b p,包括156个潜在的阅读框[2].尽管有一些基因已经被研究得很清楚,比如病毒的结构蛋白,必需的顺式作用因子等[327],但还是有许多基因的功能尚不清楚.为了能高效地研究这些未知基因,我们用Tn5转座子介导的随机插入突变法构建了AcMNPV 突变库(李惠等[8],尹隽等,待发表). 本文研究了从突变体库中筛选到的一株p95基因带有插入突变的突变体.研究结果提示完整的P95蛋白对病毒在细胞中的复制是非必须的. 1 材料和方法 1.1 细胞、病毒和菌株 草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞用TNM 2FH 培养基(Sigma 2Aldrich,MO,USA )补充10%的小牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素培养.带有AcMNPV 基因组的质粒(bacmid )来源于Bac 2to 2Bac 系统(Invitro gen,CA,USA ),保存于大肠杆菌中,它转染Sf9细胞后可以复制产生感染性的AcMNPV [9].以在病毒多角体启动子下游插入绿色荧光蛋白基因(gfp )的bacmid (bacGFP )作为起始病毒基因组,利用体外转座系统构建了AcMNPV 随机插入突变体库(尹隽,发表中). E.coli BJ5183(RecA +)作为重组用菌 株,E.coli EC100(Epicentre,WI,USA )用于保存bacmid.用于培养含bacmid 菌株的抗生素浓度分别为:卡那霉素(Kan )50m g/mL,庆大霉素(Gen )7m g/mL,阿普拉霉素(Apra )20m g/mL. 1.2 Tn5转座子插入定位 参见李惠等[8],简单介绍如下.根据AcMNPV 基因组序列,全基因组每隔1.5kb 沿同一方向设计了88个引物(分别命名为v1～v88,具体序列略).在转座子上设计两个引物Tn 2u p (5′2GTCTCCGACCT 2 第47卷 第3期 2008年6月复旦学报(自然科学版)JournalofFudanUniversit y (NaturalScience )Vol.47No.3Jun.2008
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
转座子及其相关技术的研究 摘要：转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列，转录组的活动对生物体基因组的转录以及演变存在着严重影响，本文就转座子的基因机理及特征、转座子沉默、转座子的标签技术以及其在植物中的运用进行阐述。 转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。MclCintockl’嗜次在玉米中的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。目前认为，多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现的原因源于转座子的可动性，并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化，转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。 1.转座子特征与分类 基因转座时发生的插入作用中受体分子都有一段3-12bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。第二类转座子又称为返座元，在结构和复制上与反转录病毒类似，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。 2转座子相关技术 2.1转座子分离方法 有4种方法用来分离转座子:(l)转座子诱捕法，此法适用于分离具有相当高的整合和切割频率的转座子。(2)Southern杂交法，此种方法需要有适当的探针，用于检测已知的转座子。(3)重复DNA序列鉴定法，适用于高拷贝数的无论是否有活性的转座子。(4)PcR扩增法，对己知序列的转座子可以设计引物直接PCR扩增。
基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
实验六转座子引起的插入突变 一、实验目的 通过实验进一步认识转座子的遗传学效应之一：转座可引起插入突变。 二、实验原理 转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。 复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS 序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 转座作用的遗传学效应有如下几个方面，转座引起插入突变；转座产生新的基因；转座产生染色体畸变；转座引起的生物进化。 常见的大肠杆菌复合转座子的抗药性、大小、末端重复序列和转座特性 转座子抗药性大小（bp）末端重复序列转座特异性转移频率 Tn1 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn2 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn3 Ap 4600 140bp（反向）低一般 低低 Tn4 Su、Sm 20500 140bp （并带有Tn3） Tn5 Kan 5200 1460bp 低 Tn6 Kan 4100 低 Tn7 Tp、Kan 高低 Tn9 Cm 2500 800bp（顺向） （实际上即IS1） Tn10 Tc 9300 1400bp（反向） 一般 （实际上即IS2） Ap：氨苄青霉素抗性 Su：磺胺抗性 Kan：卡那霉素抗性 Sm：链霉素抗性 Cm：氯霉素抗性 Tc：四环素抗性 Tp：甲氨苄氨嘧啶抗性
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
转座子小综述 09生物技术一班汪晨皓 200915070123摘要 转座子又称跳跃因子,其实质是基因组上不必借助于同源序列就可移动 的 DNA片段,它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。自 1951年美国McClintock在玉米中首先发现了 DNA转座子以来, 转座子已成为各种生物基因分析的有效工具之一[ 1]不仅可利用转座子诱变找到原核生物的单性生殖基因, 而且在真核生物中, 转座子的发现和运用极大地促进了果蝇遗传学的发展。人们已经应用各种方法, 在生物界各个领域证实了转座子系统的广泛存在[ 2]。利用转座子特有的转座功能, 将带有标记的转座子插入目的基因或基因组,产生了转座子标签技术、转座子定点杂交技术、转座子基因打靶技术和非病毒载体基因增补技术。人们利用这些技术, 可以确定基因组的功能、基因组间的功能差异;可以改变目的基因的活性, 获得转基因生物; 可以阻断毒力基因, 获得基因疫苗; 可以促进基因整合, 进行基因治疗等。转座子的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识, 打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。转座子插入新的位点后, 该位点附近的基因即受到抑制而呈现隐性的睡美人表型。一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走, 该位点的基因隐性表型又恢复为显性表型, 即睡 美人苏醒。调控转座酶和转座子活性的系统称为青蛙王子( Frog Pri nce) [ 3]。目前,认为多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现都源于转座子的可动性, 并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化。转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。用特异的开放阅读框捕获技术, 可以使自然散在的转座酶编码基因高度表达,人为催化激活转 座子使其苏醒 , 执行插入、黏贴、切除等任务。目前已经应用于微生物、昆虫、植物、动物及人类基因组功能的研究[ 2], 例如蛙类基因组含有水手转座子超家族, 呈自然失活状态, 转座酶与转座增强子序列末端结合, 在蛋白协助下, 激活转座子, 使睡美人转座子苏醒[ 4]。 关链词 睡美人；转座子；相关技术；应用 转座子系统又称“睡美人”转座子系统，因该系统在自然状态下发生转座的能力不足, 大多数突变基因处于抑制“睡眠”状态而得名。由此发展起来的相关技术有转座子标签技术,定点杂交技术,转座子基因打靶技术, 非病毒载体基因增补技术即转座子“睡美人苏醒”技术。本文就转座子及其相关内容做一概要的总结。 转座子又称可移动基因, 跳跃基因, 是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA序列。早在20 世纪50 年代, 首先由McClintock 在玉米中发现,从而改变了人们对基因组序列稳定性的认识,打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。目前生物体中所发现的10%的突变是由于它抑制其他基因的表达而形成的[ 5].转座子在进化上为建立宿主基因特性 起着重要作用。 转座子学说使McClintock荣获1983年诺贝尔生理医学奖[3].然而需要强 调的是, 并不是所有具有转座子基因的个体都可以发生转座子转座,转座能 力个体间有很大差别, 在有转座酶存在的情况下，通常情况受到一个激活因子Ac的控制。当细胞中有Ac时转座子才发生转座, 细胞中无Ac时转座子处于
基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因(胸苷激酶基因)等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。 ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6] ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。[2，3,7] f．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。[8]（见图2）
方法原理优点不足应用 利用同源重组进行基因敲除利用DNA转化技术, 将含有目的基因和靶 基因同源片段的重组 载体导入靶细胞,通 过载体与靶细胞染色 体上同源序列间的重 组,将外源基因整合 入内源基因组内,使 外源基因得以表达。 通过研究靶细胞或者 个体在目的基因插入 前后遗传特性的改 变,达到研究基因功 能的目的。 具有高度特 异性和方向 性，外源片 段也具有可 操作性 1)操作复杂,实验周期长,费用 偏高;(2)在敲除过程中,被破坏 的常常只是靶基因的部分外显 子而并不是整个编码区,残留 的编码序列有可能组合出新的 未知的功能,这将给表型分析 带来麻烦;(3)对于某些必需基 因,敲除后会造成细胞死亡,也 就无法研究这些必需基因的功 能;(4)由于基因功能上的冗余, 敲掉一个基因并不能造成容易 识别的表型;(5)同一个打靶载 体在不同遗传背景下进行基因 敲除,获得的表型差异很大。 噬菌体的 Cre/Loxp系统 和酿酒质粒的 FLP/FRT系统 利用随机插入突变进行基因敲除利用某些能随机插入 基因序列的病毒，细 菌或其他基因载体， 在目标细胞基因组中 进行随机插入突变， 建立一个携带随机插 入突变的细胞库，然 后通过相应的标记进 行筛选获得相应的基 因敲除细胞 效率高、基 因完全失 活、容易分 离鉴定被插 入引起失活 的目的基因 等 1以农杆菌介导的T-DNA插入 突变只适用于那些容易被 T-DNA转化的植物,且常常会引 起的染色体重排现象,使突变 体表型与T-DNA插入无关而难 以进行遗传学分析。 2转座子插入突变要求转座子 本身较短,容易操作,且对任何 拟敲除区域有较高转座效率等 以农杆菌介导 的T-DNA插入 突变 转座子插入突 变 RNA干扰引起的基因敲除是由与生物体内源 靶基因mRNA 同 源的双链RNA 特异性引发的靶ｍ ＲＮＡ降解，导致目 的基因表达沉默的一 种反向遗传学技术。 1)特异性强, 针对同源基 因共有序列 的RNAi则 只能导致同 源基因失 活,不影响 其他内源性 mRNA的表 达;(2)效率 高;(3)穿透 性强 1缺乏有效的siRNA载体 2无法彻底去除目的基因 3在哺乳动物中的应用还处于 探索阶段，实验方法不够成熟。 1对于一些敲 除后小鼠在胚 胎时就会死亡 的基因，可以 在体外培养的 细胞中利用 RNAi技术研究 它的功能。 2由于RNAi能 高效特异的阻 断基因的表 达，它成为研 究信号传导通
利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： 图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。 ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。 ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。 ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。 f．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。（见图2）
基因敲除 基因敲除（knockout）是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。 步骤： 获得干细胞 基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。由于这些远交系遗传背景复杂，所得到的模式小鼠往往不能得到重复性好的实验结果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。另一方面，因为回交次数不一样，也会造成实验结果重复性差。这对生物科研，尤其是医药企业，安评中心，药检部门等，是一个很大的缺点。这对开发制作标准模式动物也是一个很大的缺陷。所以，如果能够直接用C57BL/6 ES细胞进行基因打靶，就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学，神经学，癌症，等几乎所有研究领域。已经有一些公司或科研机构已经开始用C57BL/6遗传背景的胚胎干细胞进行基因打靶。 载体构建 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA 的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除，条件性基因敲除，基因敲进，诱导性基因敲除等打靶载体。 导入基因 将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。 用选择性培养基筛选已击中的细胞 一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。由于用于TK筛选的Gancyclovir对小鼠的种系传递有影响，一般采用DTA(白喉毒素A亚基）进行阴性筛选。
i (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。 刚刚发表在《科学》（Science）（2013年,1,3）的两篇文章，证明Cas9系统能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组（HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统 唯尚立德已经利用CRISPR/Cas9在斑马鱼，哺乳动物细胞上成功实现基因敲除和基因敲入，现推出如下技术服务： 1. 应用CRISPR /Cas9提供稳定细胞系靶向基因敲除、敲入技术服务； 2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务，包括小鼠，大鼠，斑马鱼等； 近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列 （clustered regularly interspaced short palindromic re peat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因 （CRISPR-associated genes, Cas gene）。研究发现，这些CRISPR 序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套 CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统 （adaptive immune system）。后续的遗传学试验和生物化学试验也证实了这种猜测。 虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌
1 (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。 刚刚发表在《科学》（Science）（2013年,1,3）的两篇文章，证明Cas9系统 能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组 （HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统 唯尚立德已经利用CRISPR/Cas9在斑马鱼，哺乳动物细胞上成功实 现基因敲除和基因敲入，现推出如下技术服务： 1. 应用CRISPR /Cas9提供稳定细胞系靶向基因敲除、敲入技术服 务； 2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务，包括小 鼠，大鼠，斑马鱼等； 近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种 细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短 回文重复序列 （clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和 CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。研究发 现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这 套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特 异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统 （adaptive immune system）。后续的遗传学试验和生物化学试验也证 实了这种猜测。 虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的 胞内都只需要一种内切酶（endonuclease）——Cas9就足够了，我们将 这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统（type II systems），如图1所 示。Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行 定点切割，不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序（proto- spacer adjacent motifs，PAM基序）。如果要形成一个有功能的DNA切 割复合体，还需要另外两个RNA分子的帮助，它们就是 CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA（trans - acting CRISPR RNA, tracrRNA)。不过最近有研究发现，这两种RNA可 以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。这个 sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称，在多种 类型的细胞和生物体内，这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使 功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进
PCR targeting system in Streptomyces coelicolor A3(2) Bertolt Gust, Tobias Kieser and Keith Chater, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR47UH, UK, Tel: +44 (0)1603 452751 Fax: +44 (0)1603 456844 Introduction Many bacteria are not readily transformable with linear DNA because of the presence of the intracellular recBCD exonuclease that degrades linear DNA. However, the λ RED (gam, bet, exo) functions promote a greatly enhanced rate of recombination when using linear DNA. By exploiting this, Datsenko and Wanner (2000) made 40 different disruptions on the E. coli chromosome by replacing the wild-type sequences with a selectable marker generated by PCR using primers with 36 nt homology extensions. The strategy for PCR-targeting for mutagenesis of Streptomyces coelicolor is to replace a chromosomal sequence within a S. coelicolor cosmid (Redenbach et al., 1996) by a selectable marker that has been generated by PCR using primers with 39 nt homology extensions. The inclusion of oriT (RK2) in the disruption cassette allows conjugation to be used to introduce the PCR targeted cosmid DNA into S. coelicolor. Conjugation is much more efficient than transformation of protoplasts and it is readily applicable to many actinomycetes (Matsushima et al., 1994). The potent methyl-specific restriction system of S. coelicolor is circumvented by passaging DNA through a methylation-deficient E. coli host such as ET12567 (MacNeil et al., 1992). Vectors containing oriT (RK2; Pansegrau et al., 1994) are mobilisable in trans in E. coli by the self-transmissible pUB307 (Bennett et al., 1977, Flett et al., 1997) or the non-transmissible pUZ8002, which lacks a cis-acting function for its own transfer (Kieser et al., 2000). To adapt the procedure of λ RED mediated recombination for Streptomyces, cassettes for gene disruptions were constructed that can be selected both in E. coli and in Streptomyces (Table 1). After a single disruption with an oriT-containing cassette, further disruptions can be performed on the same cosmid using oriT-free cassettes containing alternative selective markers. The λ RED recombination plasmid pKD20
一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。