一、Transwell小室制备
1. 无基质胶Transwell小室制备
①包被基底膜：
用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
三、接种细胞
①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。
②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。
时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象
在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
四、结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法：
1. 直接计数法
（1）“贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
②染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台?蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570 nm 测其OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
③细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽可能多的视野。
（2）“非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供的经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数，个人认为MTT应该也是可以用的，有兴趣的可以试试看。
2. 间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。
（1）MTT法
①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
②24孔板中加入500 μl含0.5 mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37 ℃4 h后取出。
③24孔板中加入500 μl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10 min，使甲?充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
（2）荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。
（3）结晶紫检测
上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；
Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为8μm；
苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1. 2 趋化因子的制备取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基,37℃,5 %CO2 培养24 h～48h，收集细胞培养上清；4 ℃,12 000rpm 离心,10 min ,取上清；0.22 μm 滤膜过滤除菌；分装,在- 20 ℃保存。
1. 3
transwell 培养板准备所有操作均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel 加入冰预冷的300μl 无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆盖整个聚碳酯
膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell 培养板置于37℃可保存2 周。
1. 4
Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各组细胞用PBS 漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105个细胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95 %。Transwell 培养板上室加入100μl 细胞悬液( 5 ×104 个) 并加入无血清培养基200 ul 。Transwell 培养板下室加入500μl 趋化因子,37℃,5 %CO2 培养24 h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水
(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取6 个视野[1 ] 计数,取平均数。重复实验两次。
2. 1
NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。
2. 2 细胞的准备所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 %。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。
2. 3 擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。
2. 4 苏木素染色上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ,用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚。在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚。四唑盐试验（MTT）比色试验
四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，5mg/ml。用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。
操作步骤
1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。
2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）
3. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液(对于悬浮生长的细胞，需离心1000rpm，5min)。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。
4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。
（五）、注意事项
1．选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。
2．避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。
3．设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零
【原理】活细胞的线粒体中存在NADPH相关的脱氢酶类，可将黄色的MTT还原为水不溶性的蓝紫色甲臜，死亡的细胞该酶活性丧失，MTT不被还原，用DMSO溶解甲臜后用酶标仪于490nm波长处检测光密度值。
【方法】按不同肿瘤细胞的生长速率，将一定数量的处于对数生长期的细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔（当然要根据你的实验设计不同的药物浓度），每个浓度均为3个复孔，另设无细胞调零孔。置于37℃，5%CO2培养箱培养一定时间后（时间就要看你的实验设计多长时间，几个时间点了）加入MTT液20μl/孔（MTT用PBS配制成5mg/ml),继续培养4小时，吸出上清液，加入150μlDMSO使甲臜溶解，摇匀，然后用酶标仪测OD570值。
【注意事项】悬浮细胞必须离心后才能吸出上清再加入DMSO.
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
福建农林大学计算机与信息学院信息工程类实验报告系：计算机科学与技术专业：计算机科学与技术年级： 09级 姓名：张文绮学号： 091150022 实验课程：计算机组成原理 实验室号：___田405 实验设备号： 43 实验时间：2010.12.19 指导教师签字：成绩： 实验一算术逻辑运算实验 1．实验目的和要求 1. 熟悉简单运算器的数据传送通路； 2. 验证4位运算功能发生器功能(74LS181)的组合功能。 2．实验原理 实验中所用到的运算器数据通路如图1-1所示。其中运算器由两片74181
以并/串形式构成8位字长的ALU。运算器的输出经过一个三态门(74245)和数据总线相连，运算器的两个数据输入端分别由两个锁存器(74373)锁存，锁存器的输入连接至数据总线，数据开关INPUT DEVICE用来给出参与运算的数据，并经过一个三态门(74245)和数据总线相连，数据显示灯“BUS UNIT”已和数据总线相连，用来显示数据总线内容。 图1-2中已将用户需要连接的控制信号用圆圈标明(其他实验相同，不再说明)，其中除T4为脉冲信号，其它均为电平信号。由于实验电路中的时序信号均已连至W/R UNIT的相应时序信号引出端，因此，在进行实验时，只需将W/R UNIT 的T4接至STATE UNIT的微动开关KK2的输出端，按动微动开关，即可获得实验所需的单脉冲，而S3，S2，S1，S0，Cn，LDDR1，LDDR2，ALU-B，SW-B各电平控制信号用SWITCH UNIT中的二进制数据开关来模拟，其中Cn，ALU-B，SW-B为低电平控制有效，LDDR1，LDDR2为高电平有效。 3．主要仪器设备（实验用的软硬件环境） ZYE1603B计算机组成原理教学实验系统一台，排线若干。 4．操作方法与实验步骤
第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 Fig1 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面 Fig2 将Transwell小室放入培养板中，小室称上室，培养板称下室，上室盛装上层培养液，下室盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 Fig3 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： (1).共培养体系：
重庆理工大学 《计算机组成原理》 实验报告 学号 __11503080109____ 姓名 __张致远_________ 专业 __软件工程_______ 学院 _计算机科学与工程 二0一六年四月二十三实验一基本运算器实验报告
一、实验名称 基本运算器实验 二、完成学生：张致远班级115030801 学号11503080109 三、实验目的 1．了解运算器的组成结构。 2．掌握运算器的工作原理。 四、实验原理： 两片74LS181 芯片以并/串形式构成的8位字长的运算器。右方为低4位运算芯片，左方为高4位运算芯片。低位芯片的进位输出端Cn+4与高位芯片的进位输入端Cn相连，使低4位运算产生的进位送进高4位。低位芯片的进位输入端Cn可与外来进位相连，高位芯片的进位输出到外部。 两个芯片的控制端S0～S3 和M 各自相连，其控制电平按表2.6-1。为进行双操作数运算，运算器的两个数据输入端分别由两个数据暂存器DR1、DR2（用锁存器74LS273 实现）来锁存数据。要将内总线上的数据锁存到DR1 或DR2 中，则锁存器74LS273 的控制端LDDR1 或LDDR2 须为高电平。当T4 脉冲来到的时候，总线上的数据就被锁存进DR1 或DR2 中了。 为控制运算器向内总线上输出运算结果，在其输出端连接了一个三态门（用74LS245 实现）。若要将运算结果输出到总线上，则要将三态门74LS245 的控制端ALU-B 置低电平。否则输出高阻态。数据输入单元(实验板上印有INPUT DEVICE)用以给出参与运算的数据。其中，输入开关经过一个三态门（74LS245）和内总线相连，该三态门的控制信号为SW-B，取低电平时，开关上的数据则通过三态门而送入内总线中。 总线数据显示灯（在BUS UNIT 单元中）已与内总线相连，用来显示内总线上的数据。控制信号中除T4 为脉冲信号，其它均为电平信号。 由于实验电路中的时序信号均已连至“W/R UNIT”单元中的相应时序信号引出端，因此，需要将“W/R UNIT”单元中的T4 接至“STATE UNIT”单元中的微动开关KK2 的输出端。在进行实验时，按动微动开关，即可获得实验所需的单脉冲。 S3、S2、 S1、S0 、Cn、M、LDDR1、LDDR2、ALU-B、SW-B 各电平控制信号则使用“SWITCHUNIT”单元中的二进制数据开关来模拟，其中Cn、ALU-B、SW-B 为低电平有效，LDDR1、LDDR2 为高电平有效。 对于单总线数据通路，作实验时就要分时控制总线，即当向DR1、DR2 工作暂存器打入数据时，数据开关三态门打开，这时应保证运算器输出三态门关闭；同样，当运算器输出结果至总线时也应保证数据输入三态门是在关闭状态。 运算结果表
计 算 机 组 成 原 理 讲 义 计算机科学技术系王玉芬 2012年11月3日
基础实验部分 该篇章共有五个基础实验组成，分别是：实验一运算器实验实验二存储器实验实验三数据通路组成与故障分析实验实验四微程序控制器实验实验五模型机CPI组成与指令周期实验
实验一运算器实验 运算器又称作算术逻辑运算单元（ALU ,是计算机的五大基本组成部件之一, 主要用来完成算术运算和逻辑运算。 运算器的核心部件是加法器, 加减乘除运算等都是通过加法器进行的, 因此, 加快运算器的速度实质上是要加快加法器的速度。机器字长n 位,意味着能完成两个n位数的各种运算。就应该由n个全加器构成n位并行加法器来实现。通过本实验可以让学生对运算器有一个比较深刻的了解。 、实验目的 1．掌握简单运算器的数据传输方式。 2．掌握算术逻辑运算部件的工作原理。 3. 熟悉简单运算器的数据传送通路。 4. 给定数据,完成各种算术运算和逻辑运算。 二、实验内容： 完成不带进位及带进位的算术运算、逻辑运算实验。 总结出不带进位及带进位运算的特点。 三、实验原理： 1. 实验电路图
DHP1 ICC 图4-1运算器实验电路图 UiT ■-? M 74LS2J5 b t h y \ g tj'gr 2 e 曲 s詔凶口占a 出乜 VTXX tLb 匕'7^7^ elr 3泊 为 ■乱::f l 4 3 S |ilm gi ￡ Ctdf BsuB&-Kritin Xd 74IK131 亠 -fl " a r? ￡严 ■_> \ )00' S o o o o rsp "PFP iH 3I I DJ n l/l /B \\W th V4 74HC1S1 八z、 —
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
计算机组成原理实验报告 一、实验1 Quartus Ⅱ的使用 一．实验目的 掌握Quartus Ⅱ的基本使用方法。 了解74138（3：8）译码器、74244、74273的功能。 利用Quartus Ⅱ验证74138（3：8）译码器、74244、74273的功能。 二．实验任务 熟悉Quartus Ⅱ中的管理项目、输入原理图以及仿真的设计方法与流程。 新建项目，利用原理编辑方式输入74138、74244、74273的功能特性，依照其功能表分别进行仿真，验证这三种期间的功能。 三．74138、74244、74273的原理图与仿真图 1.74138的原理图与仿真图 74244的原理图与仿真图
1. 4.74273的原理图与仿真图、
实验2 运算器组成实验 一、实验目的 1.掌握算术逻辑运算单元（ALU）的工作原理。 2.熟悉简单运算器的数据传送通路。 3.验证4位运算器（74181）的组合功能。 4.按给定数据，完成几种指定的算术和逻辑运算。 二、实验电路 附录中的图示出了本实验所用的运算器数据通路图。8位字长的ALU由2片74181构成。2片74273构成两个操作数寄存器DR1和DR2，用来保存参与运算的数据。DR1接ALU的A数据输入端口，DR2接ALU的B数据输入端口，ALU的数据输出通过三态门74244发送到数据总线BUS7-BUS0上。参与运算的数据可通过一个三态门74244输入到数据总线上，并可送到DR1或DR2暂存。 图中尾巴上带粗短线标记的信号都是控制信号。除了T4是脉冲信号外，其他均为电位信号。nC0，nALU-BUS，nSW-BUS均为低电平有效。 三、实验任务 按所示实验电路，输入原理图，建立.bdf文件。 四.实验原理图及仿真图 给DR1存入01010101，给DR2存入10101010，然后利用ALU的直通功能，检查DR1、
一、Transwell小室制备 1、无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜: 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜: 吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。 2、有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 μl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度就是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞,24 h内对细胞增殖并无明显抑制,但24 h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟就是由于侵袭被抑制引起,还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我瞧到细胞在小室内的形态不就是正常培养贴壁的形态,而就是圆形的,仍就是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张,就是正常现象 在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这就是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧,确信没有大气泡产生。
不同实验中transwell 小室的选择和使用 Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。 根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6孔板小室、12孔板小室和24孔板小室以及和transwell 皿配套的75 mm直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。 小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。例如共培养实验和caco-2细胞转运模型实验。 共培养实验： 常用0. 4、34μm，将细胞A 种于上室，细胞B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A 的影响。 caco-2细胞转运模型： 选用0.44μm 膜，将Caco-2细胞以约l×10个/mL，每孔0.5 mL的密度接种在Transwell 内培养21d左右，前1周隔天换液，1周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。 涉及到细胞迁移的实验： 要用5. 0、8. 0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。
趋化性实验： 细胞B 对细胞A 的趋化作用，将细胞A 种于上室，细胞B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 细胞迁移实验： 常用8. 0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 细胞侵袭实验： 常用8. 0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，但与细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映细胞的侵袭能力。
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
计算机组成原理实验报告 ——微程序控制器实验 一.实验目的: 1.能瞧懂教学计算机(TH-union)已经设计好并正常运行的数条基本指令的功能、格式及执 行流程。并可以自己设计几条指令,并理解其功能,格式及执行流程,在教学计算机上实现。 2.深入理解计算机微程序控制器的功能与组成原理 3.深入学习计算机各类典型指令的执行流程 4.对指令格式、寻址方式、指令系统、指令分类等建立具体的总体概念 5.学习微程序控制器的设计过程与相关技术 二.实验原理: 微程序控制器主要由控制存储器、微指令寄存器与地址转移逻辑三大部分组成。 其工作原理分为: 1、将程序与数据通过输入设备送入存储器; 2、启动运行后从存储器中取出程序指令送到控制器去识别,分析该指令要求什么事; 3、控制器根据指令的含义发出相应的命令(如加法、减法),将存储单元中存放的操作数据取出送往运算器进行运算,再把运算结果送回存储器指定的单元中; 4、运算任务完成后,就可以根据指令将结果通过输出设备输出 三.微指令格式: 其中高八位为下地址字段、其余各位为控制字段、 1)微地址形成逻辑 TH—UNION 教学机利用器件形成下一条微指令在控制器存储器的地址、 下地址的形成由下地址字段及控制字段中的CI3—SCC控制、当为顺序执行时,下地址字段不起作用、下地址为当前微指令地址加1;当为转移指令(CI3—0=0011)时,由控制信号SCC 提供转移条件,由下地址字段提供转移地址、 2)控制字段 控制字段用以向各部件发送控制信号,使各部件能协调工作。 控制字段中各控制信号有如下几类: ①对运算器部件为了完成数据运算与传送功能,微指令向其提供了24位的控制信号,包括:4位的A、B口地址,用于选择读写的通用积存器３组３位的控制码I８－I６、 I５－I３、I２－I６,用于选择结果处置方案、运算功能、数据来源。 ３组共７位控制信号控制配合的两片GAL20V8 3位SST,用于控制记忆的状态标志位 2位SCI,用于控制产生运算器低位的进位输入信号 2位SSH,用于控制产生运算器最高,最地位(与积存器)移位输入信号 ②对内存储器I/O与接口部件,控制器主要向它们提供读写操作用到的全部控制信号,共3位,即MRW
实验一监控程序与汇编实验 实验时间：第周星期年月日节实验室：实验台： （以上部分由学生填写，如有遗漏，后果由学生本人自负） 1、实验目的 1）了解教学计算机的指令格式、指令编码、选择的寻址方式和具体功能。 2）了解汇编语言的语句与机器语言的指令之间的对应关系，学习用汇编语言设计程序的过程和方法。 3）学习教学机监控程序的功能、监控命令的使用方法，体会软件系统在计算机组成中的地位和作用。 2、实验平台 硬件平台：清华大学TEC-XP实验箱的MACH部分 软件平台：监控程序、PC端指令集仿真软件 3、实验要求 1）学习联机使用TEC-XP 教学实验系统和仿真终端软件； 2）使用监控程序的R 命令显示/修改寄存器内容、D 命令显示存储器内容、E 命令修改存储器内容； 3）使用A 命令写一小段汇编程序，使用U命令观察汇编码与机器码之间的关系，用G 命令连续运行该程序，用T命令单步运行并观察程序单步执行情况。 **代码不得写到0000——1FFF的地址单元中，如有违反将被取消当堂成绩 4、操作步骤及实验内容 1）实验箱功能开关设置及联机操作： 1. 将实验箱COM1口与PC机相连； 2. 设置功能状态开关为00110； 3. 于PC端运行； 4. 按RESET，START键，若PC端出现如下输出（如图所示），则操作成功； 图 2）仿真软件相关操作： 1. 在项目文件夹找到并启动； 图
2. 点击文件-启动监控程序； 图 4.若PC端出现如下输出（如图所示），则操作成功； 图 3）理解下列监控命令功能： A、U、G、R、E、D、T 1. A命令：完成指令汇编操作，把产生的指令代码放入对应的内存单元中，可连 续输入。不输入指令直接回车，则结束A命令（如图所示）； 图 2. U命令：从相应的地址反汇编15条指令，并将结果显示在终端屏幕上（如图所 示）； 图 注：连续使用不带参数的U命令时，将从上一次反汇编的最后一条语句之后接着继续反汇编。 3. G命令：从指定（或默认）的地址运行一个用户程序（如图所示）； 图 4. R命令：显示、修改寄存器内容，当R命令不带参数时，显示全部寄存器和状 态寄存器的值（如图所示）； 图 5. E命令：从指定（或默认）地址逐字显示每个内存字的内容，并等待用户打入 一个新的数值存回原内存单元（如图所示）； 图 6. D命令：从指定（或默认）地址开始显示内存120个存储字的内容（如图所示）；
计算机组成原理上机实验指导
一、实验准备和实验注意事项 1．本课程实验使用专门的TDN-CM++计算机组成原理教学实验设备，使用前后均应仔细检查主机板，防止导线、元件等物品落入装置导致线路短路、元件损坏。 2．完成本实验的方法是先找到实验板上相应的丝印字及其对应的引出排针，将排针用电缆线连接起来，连接时要注意电缆线的方向，不能反向连接；如果实验装置中引出排针上已表明两针相连，表明两根引出线部已经连接起来，此时可以只使用一根线连接。 3．为了弄清计算机各部件的工作原理，前面几个实验的控制信号由开关单元“SWITCH UNIT”模拟输入；只有在模型机实验中才真正由控制器对指令译码产生控制信号。在每个实验开始时需将所有的开关置为初始状态“1”。 4．本实验装置的发光二极管的指示灯亮时表示信号为“0”，灯灭时表示信号为“1”。 5．实验接线图中带有圆圈的连线为实验中要接的线。 6．电源关闭后，不能立即重新开启，关闭与重启之间至少应有30秒间隔。 7．电源线应放置在机专用线盒中。 8．保证设备的整洁。
二、实验设备的数据通路结构 利用本实验装置构造的模型机的数据通路结构框图如下图。其中各单元部已经连接好，单元之间可能已经连接好，其它一些单元之间的连线需要根据实验目的用排线连接。 图0-2 模型机数据通路结构框图
实验一运算器实验：算术逻辑运算实验 一．实验目的 1．了解运算器的组成结构； 2．掌握运算器的工作原理； 3．掌握简单运算器的数据传送通路。 4．验证运算功能发生器(74LSl81)的组合功能。 二．实验设备 TDN-CM++计算机组成原理教学实验系统一台，排线若干。 三．实验原理 实验中所用的运算器数据通路如图1-l所示。其中两片74LSl81以串行方式构成8位字长的ALU，ALU的输出经过一个三态门(74LS245)和数据总线相连。三态门由ALU-B控制，控制运算器运算的结果能否送往总线，低电平有效。 为实现双操作数的运算，ALU的两个数据输入端分别由二个锁存器DR1、DR2(由74LS273实现)锁存数据。要将数据总线上的数据锁存到DR1、DR2中，锁存器的控制端LDDR1和LDDR2必须为高电平，同时由T4脉冲到来。 数据开关(“INPUT DEVICE”)用来给出参与运算的数据，经过三态门(74LS245)后送入数据总线，三态门由SW-B控制，低电平有效。数据显示灯(“BUS UNIT”)已和数据总线相连，用来显示数据总线上的容。 图中已将用户需要连接的控制信号用圆圈标明(其他实验相同，不再说明)，其中除T4为脉冲信号外，其它均为电平信号。由于实验电路中的时序信号均已连至“W／R UNIT”的相应时序信号引出端，因此，在进行实验时，只需将“W／R UNIT”的T4接至“STATE UNIT”的微动开关KK2的输出端，按动微动开关，即可获得实验所需的单脉冲。 ALU运算所需的电平控制信号S3、S2、S1、S0、Cn、M、LDDR1、LDDR2、ALU-B、SW-B均由“SWITCH UNIT”中的二进制数据开关来模拟，其中Cn、ALU-B、SW-B为低电平有效，LDDRl、LDDR2为高电平有效。 对单总线数据通路，需要分时共享总线，每一时刻只能由一组数据送往总线。
不同实验中 transwell 小室的选择和使用 Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。 根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6 孔板小室、12 孔板小室和 24 孔板小室以及和 transwell 皿配套的 75 mm 直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。 小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。例如共培养实验和 caco-2 细胞转运模型实验。 共培养实验：常用 0.4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响。 caco-2 细胞转运模型：选用0.44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10个/mL，每孔 0.5 mL 的密度接种在 Transwell 内培养 21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。 涉及到细胞迁移的实验：要用 5.0、8.0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。 趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 细胞迁移实验：常用 8.0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 细胞侵袭实验：常用8.0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。上室
实验一基础汇编语言程序设计 一、实验目的： 1、学习和了解TEC-XP16教学实验系统监控命令的用法。 2、学习和了解TEC-XP16教学实验系统的指令系统。 3、学习简单的TEC-XP16教学实验系统汇编程序设计。 二、预习要求： 1、学习TEC-XP16机监控命令的用法。 2、学习TEC-XP16机的指令系统、汇编程序设计及监控程序中子程序调用。 3、学习TEC-XP16机的使用，包括开关、指示灯、按键等。 4、了解实验内容、实验步骤和要求。 三、实验步骤： 在教学计算机硬件系统上建立与调试汇编程序有几种操作办法。 第一种办法，是使用监控程序的A命令，逐行输入并直接汇编单条的汇编语句，之后使用G命令运行这个程序。缺点是不支持汇编伪指令，修改已有程序源代码相对麻烦一些，适用于建立与运行短小的汇编程序。 第二种办法，是使用增强型的监控程序中的W命令建立完整的汇编程序，然后用M命令对建立起来的汇编程序执行汇编操作，接下来用G命令运行这个程序。适用于比较短小的程序。此时可以支持汇编伪指令，修改已经在内存中的汇编程序源代码的操作更方便一些。 第三种办法，是使用交叉汇编程序ASEC，首先在PC机上，用PC机的编辑程序建立完整的汇编程序，然后用ASEC对建立起来的汇编程序执行汇编操作，接下来把汇编操作产生的二进制的机器指令代码文件内容传送到教学机的内存中，就可以运行这个程序了。适用于规模任意大小的程序。
在这里我们只采用第一种方法。 在TEC-XP16机终端上调试汇编程序要经过以下几步： 1、使教学计算机处于正常运行状态（具体步骤见附录联机通讯指南）。 2、使用监控命令输入程序并调试。 ⑴用监控命令A输入汇编程序 >A 或>A 主存地址 如：在命令行提示符状态下输入： A 2000↙；表示该程序从2000H（内存RAM区的起始地址）地址开始 屏幕将显示： 2000： 输入如下形式的程序： 2000: MVRD R0，AAAA ；MVRD 与R0 之间有且只有一个空格，其他指令相同 2002: MVRD R1，5555 2004: ADD R0，R1 2005: AND R0，R1 2006: RET ；程序的最后一个语句，必须为RET 指令 2007:（直接敲回车键，结束A 命令输入程序的操作过程） 若输入有误，系统会给出提示并显示出错地址，用户只需在该地址重新输入正确的指令即可。 ⑵用监控命令U调出输入过的程序并显示在屏幕上 >U 或>U 主存地址
一、Transwell小室制备 1. ?无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成 0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有 tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。 2. ?有基质胶的Transwell小室制备 ?Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h 把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。? 四、结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法： 1. ?直接计数法 （1）“贴壁”细胞计数 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞