第28卷第2期2008年2月
环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae C ircu mstanti a e
V o.l 28,N o .2F eb .,2008
基金项目:国家自然科学基金项目(No .40571082,50621804);国家重点基础研究发展规划资助项目(No .2005CB121105)
Supported by the Nati onalNat u ralS ci en ce Foundation of Ch i na (N o .40571082,50621804)and t h eM i n istry ofS ci en ce and T echnology ofC h i na (No .2005CB121105)
作者简介:贺纪正(1965)),男,研究员(博士),E-m ai:l jz he @rcees .ac .cn ;*通讯作者(责任作者)
Biography :H E J i zheng(1965)),m al e ,p rof ess or(Ph. D.),E-m ai:l jz h e @rcees .ac .cn ;*Corres pondi ng author
贺纪正,张丽梅,沈菊培,等.2008.宏基因组学(M etageno m i cs)的研究现状和发展趋势[J].环境科学学报,28(2):209-218
H e J Z ,Zhang L M,Shen J P ,e t al .2008.Advances and perspecti ves ofm etageno m i cs[J].Acta Scienti ae C ircum stanti ae ,28(2):209-218
宏基因组学(M etageno m ics)的研究现状和发展趋势
贺纪正
1,*
,张丽梅1,沈菊培1,2,朱永官
1
1.城市与区域生态国家重点实验室,中国科学院生态环境研究中心,北京100085
2.中国科学院研究生院,北京100049
收稿日期:2007-05-14 录用日期:2007-12-04
摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用,促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科)))微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学,M et ageno m ics)的产生和快速发展.宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能.在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值.对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述,建议在我国尽快启动有关宏基因组学的研究,从国家层面上开展联合攻关,拓展当前的研究领域,发展相关研究策略和技术,开展广泛的国际合作,使我国在宏基因组学研究领域占据有利地位.
关键词:环境基因组学;宏基因组学;基因组文库构建;文库筛选;研究前沿文章编号:0253-2468(2008)02-209-10 中图分类号:X171 文献标识码:A
Advances and perspecti ves of m etageno m ics
HE Jizheng 1,*
,Z HANG Li m e i 1
,SHEN Jupe i 1,2
,Z HU Yongguan
1
1.State Key Laborat ory ofUrban and RegionalE col ogy ,Res earch Cen ter forE co -Environm en t al Sciences ,Ch i n eseA cad e m y of Sci en ces ,B eiji ng 100085
2.Gradu ate Un i versity of Ch i nese Acad e my of Sci en ces ,Beiji ng 100049R ecei ved 14M ay 2007; accepted 4Dece mb er 2007
A bs tract :W it h t h e devel opm ent of m olecu l ar b i ology and i ts app lication i n m icrobial ecology and environm en tal m icrob i ol ogy ,a e m ergi ng fi el d of
m et ageno m ics (env i ron m en tal geno m ics or ecogeno m ics),
has been devel oped rap i d l y .M et ageno m ics ,
co m prisi ng extracti ng t otal co mm un i ty D NA ,
constru cti ng geno m i c li b rary ,and an al yzi ng li brary w it h si m il ar strat eg i es for f un cti onal genom ics ,
provi des a po w erful tool to st udy t h e uncu l tured
m i croorgan i s m s i n the co mp lex environm en tal hab i tats .In recen t years ,m et ageno m ics has been app lied to m any environm ental sa m p l es ,such as t h e oceans ,s o il s ,ther m al ven ts ,hot spri ngs ,and the hum an mouth and gastrointes ti nal tract ,s ho w i ng si gn ifi cant val ue i n vari ou s areas i ncl ud i ng m ed i ci n e ,alternati ve energy ,environm en t al re m ed i ation ,b i otechn ol ogy ,agri cu lture ,b i odefense and forens i cs .Th i s rev i e w s ummariz ed so m e m aj or advan ces i n m et ageno m ics and called to pro m ote the m etageno m ic res earch i n Ch i na by listi ng it as a nati onal research pri orit y and s upporti ng a cl uster of pro j ects t h rough t he nati onal f und i ng agen ci es such as t he N atural Sci en ce Found ati on of Ch i na .K eywords :env i ronm ental geno m i cs ;m etageno m i cs ;li b rary constructi on ;
li brary screen i ng ;fron tier of sci en ce
1 引言(Introducti o n)
随着人类基因组计划(HGP ,H um an Geno m e Pro j e ct)的实施和推进,促使了基因组功能性研究计划的开展,因此,也从结构基因组学研究时代进入了后基因组时代.美国国立环境卫生科学研究所
(N I E H S ,N ational Institute o f Envir onm enta l H ea lth Sciences)于1998年启动了环境基因组计划(EGP ,Envir onm enta lGeno m e Pr o ject),开展有关人体遗传变异与环境胁迫响应的研究,引起各国科学家的极大关注,它标志着生命科学界将在更深层次上对环境与基因相互作用对人类健康的影响进行系统全
环境科学学报28卷
面的探索和研究(www.niehs.n i https://www.doczj.com/doc/1f2262327.html,/envgeno m e/ ho m e),环境基因组学(envir onm enta l geno m ics)由此应运而生.但是,至今对环境基因组学还没有统一明确的定义.总的来说,环境基因组学建立在对疾病病因认识的基础上,深入探讨环境胁迫-基因、基因-基因间交互作用.环境基因组学的目标是研究环境胁迫对机体遗传变异的过程和机理,包括发掘环境应激和应答基因的多态性,探究这些多态性基因的功能及其与患病风险的关系,其与毒理基因组学(Tox icogeno m ics)密切相关,是在人类基因组基础上发展的功能基因组学内容之一.
在微生物学研究领域中,因为99%以上的微生物都是目前未(难)被纯培养的,过去人们对微生物世界的认识基本上都集中在不到1%的微生物上(Kellenberger,2001).在自然条件下,微生物广泛参与C、N、O和S等重要元素的循环转化,并在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应、环境污染物降解等方面发挥着重要作用;微生物通过其群落而非单一个体来执行这些重要功能,而目前人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识.因此,自1991年Pace首次提出环境基因组学的概念并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库以来,有关环境基因组学(也称微生物环境基因组学M icrob ial Env ironm en tal Geno m ics,宏基因组学、元基因组学M etageno m ics,生态基因组学E cogeno m ics)的研究受到广泛关注.环境基因组学主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,避免了传统微生物学基于纯培养研究的限制,为充分认识和开发利用未培养微生物、并从完整的群落水平上认识微生物的活动提供了可能.对这些未培养微生物多样性及群落功能的研究将大大扩展我们对生命的了解,包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用.微生物环境基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇,已经成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿.
2007年3月,美国国家科学院联合会(The Nati o na l Acade m ies,包括Nati o na l A cade m y of Sciences,N ational A cade my of Eng ineeri n g,I nstitute o fM edic i n e,Nati o na l Research Counc il)以/环境基因组学新科学)))揭示微生物世界的奥秘0(The Ne w Sc i e nce ofM etageno m ics:Revea ling the Secrets of OurM icrob ial Planet)为题发表咨询报告,认为宏基因组学科学的出现为我们探索微生物世界的奥秘提供了新的方法,这可能是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展,将带来对微生物世界认识的革命性突破.报告呼吁建立全球宏基因组学研究计划(G l o ba lM etageno m ics Initiative),建议大批量启动中小型宏基因组学研究项目,对自然环境微生物群落(如海水或土壤)、寄生微生物群落(如人体肠胃或口腔)、人为控制环境微生物群落(如污水处理厂或水产养殖厂)等展开研究;启动少量大型综合性项目,对宏基因组学研究方法、技术路线、理论框架和更为复杂的动态微生物系统进行研究.
本文以下就宏基因组学(M etageno m ics)的研究方法、热点内容和发展前景进行探讨.
2环境基因组学的研究方法(M et h odo logy of m etageno m ics)
环境基因组学的研究以基因组学技术为依托,其主要的程序包括:从环境样品(例如土壤)中直接提取DNA;将DNA克隆到合适的载体中;将载体转化到宿主细菌建立环境基因组文库;对得到的环境基因组文库进行分析和筛选(图1).其中,基因组文库的构建是揭示新基因的前提,接下来则是如何有效地利用文库中丰富的资源,挖掘新的生物分子.由于环境基因组的高度复杂性,需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因.筛选技术大致可分为3类:第1类基于核酸序列差异分析(序列驱动),第2类基于克隆子的特殊代谢活性(功能驱动),第3类基于底物诱导基因的表达,第4类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其它技术.
210
2期贺纪正等:宏基因组学(M e tageno m i cs)
的研究现状和发展趋势
图1 微生物环境基因组文库构建与筛选流程示意图(沈菊培等,2007)F i g .1 Con structi on and screen i ng strategies of m etageno m i c li b rary (Sh en e t al .,2007)
2.1 序列分析法(Sequence -dri v en screen i n g m ethod)
DNA 序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一,是发现和认识基因多态性的前提.PCR
是序列分析中最常用的技术,对目标序列特异的探针杂交技术也已被用于土壤基因文库的筛选(Knietsch et al .,2003).序列分析法需要根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引物和探针,因此,对鉴定新的基因成员有一定的局限性,但它已被有效地用于鉴定系统发育学中的标志基因(如16S r R NA 基因)和带有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合酶等)(Dan ie,l 2005).PCR 方法往往只能获得部分基因的扩增,而要从复杂的土壤基因组文库中分离到全长基因则比较困难.Stokes 等(2001)用整合子-基因盒系统巧妙地解决了这个问题.整合子由1个整合酶基因和1个含59bp 的重组位点组成,基因盒可从这个特异的重组位点插入并将这个位点分隔开与之比邻,被分隔开的这些位点常含有约25bp 的保守序列(反向重复序列),以这些保守位点序列作为PCR 引物扩增即可获得基因盒中的全长基因.微序列技术(M icr oarray)采用集约化和平面处理原理,在微小片基上高密度而有序地排列大量基因片段、EST 或寡核苷酸片段,从而形成DNA 微矩阵,又称基因芯片.利用微阵列技术研究微生物环境基因组,可以了解环境样品中微生物群落结构及其基因表达图谱和新的代谢途径,快捷地探测未知
基因的功能,进而追踪一些能够高效表达或控制微生物群落重要功能的关键基因.例如,Sebat 等(2003)利用微序列平台对整个微生物群落基因组进行筛选,鉴定出多个新的微生物种群.W agner (2006)等应用DNA 微阵列技术对活性污泥中微生物的群落结构进行了研究,获得了大量新的信息.但是,利用该技术进行基因检测的灵敏度为PCR 法的1/100~1/10000.这种差异将会阻碍土壤中低丰度微生物的序列分析.因此,提高灵敏性和专一性是应用微阵列技术研究复杂土壤中DNA 和RNA 信息所面临的重要挑战.
对基因组文库的随机测序可以获得丰富的信息,但需要进行大量的测序和分析工作,测序技术的日益改进促进了该技术的发展.焦磷酸测序(Pyrosequenc i n g)技术比较适合于验证一些只有几十个碱基对的短序列DNA 片段,很适合进行大样本的快速检测.最近新发展了一种利用皮升(P ico litre)级反应器进行测序的方法,这种方法是在焦磷酸盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔,将基因组DNA 进行随机切割,批量地进行整个测序反应.利用这个方法,能够在相同的时间内破
译6@106
组以上的基因组序列,比Sanger 法要快100倍,提高了测序的效率(M argu lies et al .,2005).另外,鸟枪法测序(Shotgun sequenc i n g )策略则为大规模测序提供了技术保障,该方法首先将一条完整的目标序列随机打断成小的片段,分别测序,然后
211
环境科学学报28卷
利用计算机根据序列间的重叠关系进行排序和重新组装,并确定它们在基因组中的正确位置(Falko w ski et al.,2004).应用这种方法研究环境基因组学为筛选新的天然产物提供了一种可选择的途径,并可产生大量的信息,从中挖掘上百万个新基因,揭示不可培养微生物的代谢途径.然而,鸟枪法的不足之处是耗费大,需大量人力和物力.同时,与个体微生物基因相比,环境基因组文库包含着巨大的序列片段,但对这些序列片段进行分析则极为困难.最近,研究人员报告了一种简化的叫Phy loPyth ia序列分类的新技术,可利用340个复杂基因组的信息对来自复杂生态环境的序列片段进行分类组装,这是以前的方法所做不到的(M c H ardy et al.,2007).
2.2功能性筛选法(Functi o n-dri v en screen i n g m ethod)
功能性筛选法以活性测定为基础,通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆.绝大部分新发现的生物催化剂或分子化合物是利用这种方式筛选得到的.
功能性筛选的方法有2种.一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测,如利用其在选择性培养基上(如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反应底物)的表型特征进行筛选.这种方法具有较高的灵敏度,使得较少的克隆子也能被检测到.例如,插入了土壤基因组片段的克隆子可以利用培养基中的多羟基化合物合成羰基化合物,由此可从土壤基因组文库中筛选到多羟基氧化还原酶基因.另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行的.例如,从以缺陷型大肠杆菌为宿主建立的一个土壤基因组文库中,筛选出了与N a+/H+反相转运通道有关的2个新基因(Danie,l2005).
通过功能性筛选的方法可以快速地从多个克隆子中鉴定出全长基因,并由此获得这些功能基因的产物,为工业、医药和农业提供一些具有潜在活性的天然产物或蛋白质.但是,这个方法最大的不足在于筛选方法必须依赖于功能基因或编码功能蛋白在外源宿主中的表达,这也往往会由于许多基因或基因产物在外源宿主中的不表达或表达后没有活性而降低了筛选效率.只有通过对筛选方法的优化和选择合适的底物及筛选条件,并建立合适的宿主载体系统,才能加快对新的生物催化剂的挖掘和利用(Ferrer et al.,2005).在许多研究中,大肠杆菌被成功地作为宿主进行基因表达和生物活性物质筛选(Dan i e,l2005),近来,其它细菌载体如链霉菌和假单胞菌也已用于筛选功能克隆子.为了便于聚酮类物质的异源表达,链霉菌也就自然被作为DNA文库筛选的替代宿主,并从重组克隆子中筛选到一系列Terrag ine抗生素.M arti n ez等(2005)选用BAC穿梭质粒作为载体分别转入到3种宿主,即大肠杆菌、变铅青链霉菌(S tre p to m yces livi d ans)、恶臭假单胞菌(P seudo m onas puti d a).结果发现,这3种宿主在表达编码不同的化学小分子基因簇的能力上各不相同.将从环境样品中获得的复制基因(rep)转入链霉菌菌株,结果引起了大量次生代谢产物的剧增,同时也促使了孢子的形成,由此说明,内含rep 基因的变铅青链霉菌菌株适合用作抗生素相关基因的异源表达宿主(M arti n ez et al.,2004).土壤样品提取所得的DNA中有很大一部分为真核基因组DNA,利用细菌宿主往往不利于筛选这部分基因,这也促使了开发真核表达宿主用于基因文库的功能筛选.
序列分析法和功能性筛选法在土壤微生物多样性研究以及新基因挖掘中发挥了重要的作用,而这两种方法各有不足之处,为了更全面的挖掘土壤微生物多样性的组成信息,往往需要把这两种方法结合起来使用.如Rondon等(2000)用BAC载体构建了大片段DNA插入基因库,同时利用序列分析和活性测定的方法筛选基因库中新的生物活性物质.
2.3底物诱导基因表达(SI G EX)法(Substrate-
induced gene-expression screen i n g m ethod)序列分析法和功能性筛选法在宏基因组文库的新基因挖掘中起到了重要的作用,但它们存在的一个共同缺陷就是目标基因的克隆效率较低、操作费时费力.虽然已在改进方法上作了很多努力,如利用新的宿主或对含目标基因的微生物进行富集培养,但还是无法克服克隆效率低的问题.为此,一种新的底物诱导基因表达法(Substrate-I nduced Gene-Expression Screen i n g,S I G EX)被用于基因筛选.代谢相关基因或酶基因往往在有底物存在的条件下才表达,反之则不表达,SI G EX即利用这个原理来筛选目的代谢基因(U chiya m a et al.,2005).这个方法的基本过程主要有4步:第1步是以p18GFP 为载体构建宏基因组文库;第2步是在无底物情况下以异丙基)))B-D硫代半乳糖苷(I PTG)为诱导物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白基因(gfp)表达的
212
2期贺纪正等:宏基因组学(M e tageno m i cs)的研究现状和发展趋势
克隆子;第3步是在培养基中添加底物诱导代谢相关基因的表达;第4步是根据gfp基因的表达从宏基因克隆库中筛选出表达代谢基因的克隆子,利用荧光激活细胞分离仪(FACS)从琼脂培养平板上将GFP表达的克隆子分离出来.这个方法的优点在于它为高通量筛选提供了保障,而且不需要对底物进行修饰.而不足之处就是S I G EX法对目标基因的结构性和适应性很敏感,同时,无法利用不能进入细胞质的底物,而且FACS对进样设备的要求也比较高.然而,只要对这些不足之处进行优化,选择合适的条件,SI GEX法仍然是一种筛选抗体基因和生物化合物的有效方法,尤其适合于在工业上使用.
2.4其它技术(Others)
随着稳定性同位素标记技术(Stab le iso tope probing,SI P)的发展,并与分子生物学技术相结合,形成了崭新的稳定性同位素探测技术.利用该技术可以不需要常规培养就能将环境中的微生物与其功能结合起来,加深对不同环境中微生物功能及其参与的特定生物地球化学过程的认识(Rada j e w ski et al.,2000).从复杂群落构建的宏基因组文库中找到特定的目的基因,需要筛选和测序成千上万的克隆.通过SI P实验使参与特定代谢过程(例如甲烷氧化)的生物基因组富集,克隆从SI P实验中获得的13C标记的核酸,从而构建一个因吸收了特定的基质而在环境中执行特定代谢功能的微生物宏基因组文库,这极大地减少了需要筛选的克隆数量.如Lu和Conrad(2005)利用13CO2作为标记基质对水稻根际微生物进行研究时,先通过密度梯度离心将13C标记的RNA(重链)与未被标记的RNA(轻链)分离出并进行PCR扩增,构建了含轻/重RNA 链的2个克隆文库Lr hA和H rhA;通过对文库中基因序列的同源性分析发现,属于C l u ster I的古菌能利用水稻根系分泌物为碳源产生甲烷气体,对水稻田温室气体的排放有相当大的贡献.除进行PCR扩增后构建文库外,也可将分离出的13C标记的核酸直接用于构建克隆文库.如Dum ont等(2005)在一个验证性实验中,从13C H4标记的森林土壤样品中提取纯化13C-DNA,用限制性酶酶切后插入细菌人工染色体(BAC)载体,构建了一个中型的包括2300个克隆的宏基因组文库;通过与甲烷单加氧酶基因(pm o A)杂交对文库进行筛选,对其中一个阳性克隆进行测序,得到大小为15.2kb的片段,其中包含一个完整的微粒型甲烷单加氧酶基因(p MMO)操纵子和几个侧翼基因(编码一些在单碳化合物上生长所必需的酶的基因).这表明,通过SI P实验直接克隆13C-DNA并在一个较小的克隆文库中获取目的基因也是可行的.
荧光原位杂交技术(Fluorescent in situ hybri d izati o n,FI SH)是核苷酸探针技术的一个重要发展,其以已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列或特异的功能基因序列为基础,合成荧光标记的寡聚核苷酸片段作为探针,与环境基因组中的DNA分子杂交,通过落射荧光显微镜进行定量分析以检测特异微生物种群的存在与丰度.该方法的特点是可以进行样品的原位杂交,应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测,是目前在分子微生物生态学领域应用比较广泛的方法之一(H esse lsoe et al.,2001).为了将特定微生物细胞的多态性与放射性物质的吸收量联系起来,通常将微生物放射技术与荧光原位杂交基因多态性特异探针和荧光显微镜联合起来研究环境微生物群落.结合显微技术的发展,环境基因组学将在基因检测、表达和环境变化上提供更微观的世界用于窥探微生物群落的变化(R iesenfe l d et al.,2004).
3环境基因组学的应用及研究现状(Application and advances o fm etageno m ics)
随着近年来研究的深入,宏基因组学研究已渗透到各个研究领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学各方面显示了重要的价值.由于研究涉及领域较多,这里仅就水体和土壤环境基因组学进行介绍.
3.1水体宏基因组学(W ater m etageno m ics)
水体环境基因组学目前主要以海洋和极端环境为主,而海洋环境基因组学则是研究的热点之一.海洋环境基因组学是功能基因组学的一个重要分支,主要研究海洋生物群落的组成多样性、生理生化及生态功能(Falko w sk i and V argas,2004).运用基因组学的手段研究海洋生态系统,不仅可以获得有关海洋生物生理多样性和生物功能的详细信息,还有助于我们了解生物体是如何响应环境胁迫的.
Venter等(2004)收集Sar gasso海表层水样构建了宏基因组文库,应用鸟枪测序法对基因组文库进行分析,得到了大量物种多样性和丰度方面的信
213
环境科学学报28卷
息,共测得1.05@1010个碱基对,发现1800多种新的海洋微生物及1.21@106余种科学界从未见过的基因,为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供了前所未有的原始素材.海洋蕴藏着巨大的生物多样性和复杂性,宏基因组学研究将大大促进人们对它的认识.Feder和M itche l-l O l d s(2003)建立了一个海洋微生物基因文库,应用DNA微阵列技术分析鉴定了微生物的基因表达谱,所获得的基因组学数据与生态学及发育生物学的研究结合起来,从基因组整体水平上全面认识这些/被遗忘的大多数0的生理生化及生态功能,得到了大量新的数据.
近几十年来,海洋生态环境受到了很大的破坏,极大地影响到了海洋生物的生存.利用基因组学对海洋环境进行抢救性研究是环境学家所面临的巨大机遇和挑战,成为环境学研究的新热点(B eja,2004).通过海洋生物全基因组功能分析信息,可以深入了解有关生物响应海洋环境的调控机制并将其应用于海洋病害防治中,如通过功能基因组途径筛选出爱德华氏细菌的致病基因,这对于研制防治这种细菌病的药物非常重要(Lopez-Garc i a, 2004).
除海洋生境外,极端环境水体(如酸性矿水、深海)由于其苛刻的物理化学条件,如高度酸化、寡营养、缺乏氧气和光照,使得其中的微生物群落也较为独特,因此,也是目前的一个研究热点.利用环境基因组学对其开展微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应的研究,将促进我们更好地理解这些极端环境生态系统并对其加以调控和利用.
Tyson等(2004)对酸性水体生物膜中微生物的种群结构和代谢进行了研究.样品来自一个废弃的黄铁矿井深处酸性矿水表面的粉红色生物膜.这是一个缺乏氧气和光照的环境,滋生着特殊的自养微生物,这些微生物从空气中固定碳和氮,同时分解矿石获得能量.这些微生物的活动造成有害重金属离子的释放,带来了严重的环境问题.研究人员用鸟枪法对其基因组文库进行了分析,一共测定了76.2M bp的DNA序列,拼成了5个不同的基因组,其中有2个分别与钩端螺旋体属II型(L ep tos p irill u m group II)和F erro p las m a II型的全基因组非常接近,另3个与已知的微生物基因组仅部分重叠.通过基因功能的分析,研究者还发现了这些微生物间的分工并成功构建了这个微生物群落的代谢网络,找到了各种具有特殊功能的基因:钩端螺旋体属第2组的细菌可固定碳原子、产生生物膜以保护微生物菌群,并使之漂浮在水面;钩端螺旋体属第3组的细菌既能够固定碳,也能固定氮;所有的细菌可能都参与了铁的释放.这一发现成为2004年最重要的十大科学突破之一.研究者们希望藉助这样的方法来探索生态系统中的微生物群落结构,并且了解它们在极端环境中的生存机制.
将从南极圈内500m深处水下采集的单细胞微藻构建成环境基因组文库,用比较基因组学分析的方法对其中泉古菌的16S和23S-r DNA片段进行分析,并对一个含有33.3kb插入片段的克隆子DeepAn-t EC39进行了全序列测定及基因组比对,发现DeepAn-t EC39代表了深海海水一个单独的进化分支,且分布广泛.与包含核糖体RNA(rrn)操纵子(74A4,4B7和C enarchaeum sy m bios um A和B)的海洋泉古菌基因组比较分析后发现,序列中存在与基因重组、基因插入/缺失有关的一个高度可变的结构域.研究还发现,rrn启动子和邻近的1-谷氨酸半醛转氨酶(gluta m ate-1-se m ial d ehyde a m i n otransferase)基因周围是基因重组的高发区.对预测的氨基酸序列进行聚类分析后发现,在古菌的2个结构域和原核的2个结构域之间可能出现水平基因转移,转移频率最高的片段包含与甲烷八叠球菌相近的嗜温产甲烷广古生菌,因此,推测从嗜温细菌和广古生菌获得转移基因是Group I泉古菌得以在极低温的环境中生存的机制(David et al.,2004).
此外,环境微生物基因组学在研究各种水体中污染物降解微生物的作用和调控、营养物循环和富营养作用的微生物生态等方面同样具有广阔的应用前景.W agner等(2006)应用DNA微阵列技术对活性污泥中微生物的群落结构进行了研究.微阵列分析结果显示,活性污泥中存在多种菌胶团微生物、硝化细菌、反硝化细菌和聚磷菌,且该污水处理系统中反硝化作用非常活跃.该实验再次证实了利用基因组学技术研究环境样品微生物群落多态性具有巨大潜力.
3.2土壤宏基因组学(So ilm etageno m ics)
土壤是自然环境中最复杂的异质体系,这决定了土壤微环境的多样化和土壤微生物的高度多样性.到目前为止,土壤宏基因组学技术已在新基因发现、生物活性物质的发现以及土壤生态等几个方面得到了广泛的应用.
从土壤宏基因组文库中获得新编码基因是该
214
2期贺纪正等:宏基因组学(M e tageno m i cs)的研究现状和发展趋势
技术的主要功能所在,已发现的新基因主要有生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因(H andels m an et al.,1998;Dan i e,l2005). Courto is等(2003)采用了大肠杆菌-浅青紫链霉菌(E scherichia coli-S trep to m yces livi d ans)穿梭质粒载体将从土壤中分离的微生物DNA片段构建成鸟枪环境DNA文库,其中包括5000个克隆子.分析结果表明,DNA文库中微生物系统发育变化多样,其中大部分微生物尚未被报道过.从文库中扩增出I型聚酮合成酶基因并表达,对这些基因的表达产物的分析结果表明,至少有8个克隆中含有新的聚酮合成酶基因.随着方法和技术的改进,除从大量的克隆子中可获得感兴趣的基因外,通过构建较少量克隆子也能得到新基因.如Voget等(2003)利用培养和直接筛选相结合的方法快速地分析和鉴定出4个克隆子中含有12个可能编码琼脂水解酶的基因,同时利用DNA序列分析法鉴定到另一些编码生物催化剂的基因,包括1个立体选择性酰胺酶基因(am ia)、2个纤维素酶基因(gnuB和uvs119)、1个A-酰胺酶基因(am y A)、1个1,4-A-葡聚糖分枝酶基因(amyB)和2个香蕉果胶裂解酶基因(pel A和uvs119).这些结果充分表明土壤微生物是各种基因的天然资源库,其蕴藏的基因多样性远远超出了人们过去的认知程度.
土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物催化剂的发现,包括腈水解酶和淀粉酶(Rondon et al.,2000)、蛋白酶、氧化还原酶(Knietsch et al.,2003)、脂肪酶、酯酶(K i m et a l., 2004;2006)等,并且在此基础上获得新酶的许多特征信息.Yun等(2004)选用p UC19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库,对其表达出的酶蛋白进行了特征分析,发现该酶具有独特的转糖基作用,同时还具有A-淀粉酶、葡聚糖转移酶和新普鲁兰酶的共同特征.在文库的筛选中,抗菌活性物质往往和新酶物质一起被鉴定出.利用未培养的方法挖掘新的抗生素已经成为一种行之有效的方法.加拿大Terra Gen D iscovery公司首次以链霉菌为宿主构建宏基因文库并筛选到具有抗菌活性的Terrag i n e系列小分子物质.G illespie等(2002)从包含24545个克隆子的土壤基因文库中发现3个克隆的菌落呈黑棕色,对这些有色产物的成分分析结果表明,它们分别为turbo m yc i n A和t u rbo m yc i n B,具有广普抗生素活性,对格兰氏阳性和阴性细菌均具有抗性.这些结果表明,一旦从环境基因组文库中获得功能基因,就能通过基因工程强化表达产物,并通过增加BAC克隆表达强度,高效率筛选感兴趣的宏基因组片段及其产物.可见,宏基因组学技术在开发新的活性物质方面具有巨大潜力.
土壤宏基因组学技术除用于新基因和生物活性物质的筛选和挖掘外,也为研究土壤微生物复杂群落结构提供了重要工具.通过对基因组文库中的16S r RNA基因序列的系统化研究,使环境微生物的多样性分析趋于完整客观.Rondon等(2000)利用可插入大片段DNA的B AC载体,构建了27.0、44.5和98.0kb等大小不同的土壤宏基因组文库.对文库16S r RNA基因序列的系统发育学分析结果表明,文库中的DNA包含来源于不同系统分类单位下的多种微生物,揭示了微生物极广泛的多样性. Treusch等(2004)从沙地生态系统和森林土壤中提取DNA并构建了3个大片段福斯(Fos m i d)质粒基因组文库,对古细菌多样性进行了研究,发现存在着更丰富的微生物资源;同时,在该研究中还发现对古细菌多样性的研究可以利用除16S r R NA基因以外的功能基因(如m cra,a m oA,n ir K)进行.
此外,宏基因组学技术也为微生物纯培养技术提供了可供选择的培养基资源.如用4-羟基丁酸作唯一的碳源和能源筛选到了5个能够稳定利用4-羟基丁酸的克隆子,经分析,这些克隆子具有4-羟基丁酸脱氢酶活性,据此可以利用该基因编码的活性物质开展实验室纯培养(G abor et a l.,2004).这个方法主要是基于活性筛选技术的特殊条件)))选择性培养基,它为实验室培养编码新基因的微生物提供了一条新途径.
3.3其它(O thers)
除上述应用外,环境基因组学还可用于病原微生物基因组的研究.人体同样存在无数种不同的微生物,虽然人们对其中相当部分基因建立了培养的方法,但仍有不少是难以培养、功能不详的.这一新的研究思路的引进,有可能帮助人们更加全面地认识微生物与人类的关系,认识病原体的致病机制,寻找预防和治疗的方法.G ill等(2006)对2名健康成年人粪便标本的DNA进行测序后发现,仅有1% ~5%的DNA不是来自细菌.他们又将已知的细菌基因组与人类基因组进行比较后发现,下消化道细菌的基因数量达60000多种,要比在人类基因组中发现的多出一倍.研究人员称,人类是一个超生物
215
环境科学学报28卷
体(superor gan is m),即由细菌和人体细胞组成的混合体.该研究结果对许多人类疾病的临床诊断和治疗研究具有深远的意义.
4环境基因组学面临的挑战与发展前景(Challenges and prospects o fm etageno m ics)
环境基因组学的研究已经成为环境生物学、微生物学乃至整个生物学中最活跃和最有潜力的学科方向,从事这个领域研究的高水平的机构和专家越来越多.其在开发微生物资源多样性,筛选获得新型活性物质,发掘与抗生素抗性、维生素合成及污染物降解相关的蛋白质等方面展示了巨大的潜力,并将在医药、能源、环境、生物工程、农业、大气、地学等领域中发挥更大的作用.但是,环境基因组学研究由于研究领域较广,同时技术和方法上还存在不足,许多问题亟待解决(The N ational A cade m ies,2007).1多学科间的协作:由于环境基因组学研究涉及多个研究领域,从事大气、海洋、水体、土壤、地学、医药、兽医学、农业科学、环境科学和生物技术多学科的专家间的相互协作将更能充分发挥环境基因组学研究的价值并促进对其研究成果的开发应用.o组织协调:成立跨部门的机构对各类宏基因组研究项目进行统一协调.?方法学的挑战:不同的取样和DNA提取方法决定了宏基因组研究的结果,如何对这些方法进行标准化是宏基因组学研究的一个挑战.此外,由于许多基因或基因产物在外源宿主中不表达或表达后没有活性,建立更多的适于不同基因表达的宿主系统是基于功能筛选的宏基因组学研究的又一挑战.?数据分析/生物信息学:生物信息学分析方法、微生物培养技术及模式微生物全基因组序列获得等方面的提高将更有利于对宏基因组学研究结果的解释,从中获取更多的信息.?数据管理:建立较规范的详细的包含有宏基因组研究结果、取样方法、DNA提取方法及数据分析方法在内的数据库供不同领域及各个国家的研究人员共享使用.
综上所述,传统微生物学研究已向人们展示了微生物在地球生命活动中所起的关键作用.环境微生物基因组学的研究正极大限度地发掘出人们难以想象到的微生物群落的巨大功能.为更深入地认识微生物在地球和人类健康及变化的环境条件中所起的重要作用,明确各生境下微生物群落的宏基因组学特征是关键的第一步.
我国地域辽阔,具有多种多样的自然生态环境,蕴含着丰富的微生物资源.最近,中科院微生物研究所董志扬研究小组成功构建了云南腾冲热泉土壤的微生物基因组文库,进一步地分析显示,所研究的土壤样品中微生物多样性较高,且发现许多未报道过的新序列(蔡莹等,2006).南京农业大学李顺鹏研究小组构建了农田土壤的宏基因组文库,但进一步的分析结果还未见报道(樊奔等,2006).中科院生态环境研究中心贺纪正研究小组对土壤等环境样品宏基因组DNA提取方法和文库构建等进行了较系统地研究(H e et al.,2005a;2005b, 2006;Zhang et al.,2007).国家海洋局的张金伟和曾润颖(2006)从南极普利兹湾深海900m深的沉积物中获得宏基因组DNA并构建克隆文库,从中获得低温脂肪酶(li p3)开放阅读框的完整序列,对其进行重组表达后得到了具有活性的低温酶.广西大学的许跃强(2006)等构建了造纸厂废水纸浆沉淀物的宏基因组文库,从中筛选到多个表达内/外切葡聚糖酶活性和B-葡萄糖苷酶活性的克隆,并鉴定出3个新的纤维素酶基因(u m cel5L、um cel5M和um bgl3D).可见,来自不同生境的环境基因组文库蕴藏着丰富的基因资源及有关生命的奥秘.但是,总的说来,国内对于微生物环境基因组学的研究开展较晚,规模较小,参与的研究机构较少,立项或基金资助项目较少.
为此,建议国家有关部门将宏基因组学的研究列入国家有关重点研究计划,通过小型项目培育宏基因组学研究队伍,通过重点项目扶持5~10个基因组学研究小组,并适时启动重大项目或重大研究计划;从国家层面上开展协作攻关,充分利用我国广袤复杂的自然地理和环境条件,拓展当前的研究领域,发展环境微生物生态理论,发掘微生物种和基因资源,取得原创性研究成果和开发具有自主知识产权的产品;加强环境基因组学领域的国际合作,以求在世界环境基因组学研究的挑战中占据重要地位,为解决我国日益严重的环境污染问题提供理论基础和技术支撑.
责任作者简介:贺纪正
(1965)),男,教授、研究员、博士生
导师,中国科学院引进国外杰出人才
/百人计划0入选者,中国科学院生态
环境研究中心中澳联合土壤环境实
验室副主任.主持(过)多项国家自然
科学基金、欧共体科技合作、国家教
委优秀年轻教师基金、/9730课题等
216
2期贺纪正等:宏基因组学(M e tageno m i cs)的研究现状和发展趋势
项目的研究,发表研究论文百余篇.主要研究方向为土壤分子生态学、污染土壤生态风险评价和土壤环境化学.通讯地址:北京市海淀区双清路18号,100085.电话:010-6284 9788,E-m a i:l jzhe@https://www.doczj.com/doc/1f2262327.html,.
R eferences:
BejaO.2004.To BAC or not t o BAC:mari ne ecogeno m i cs[J].Curren t Op i n i on i n B i otechnology,15:187)190
C aiY,Chen X Z,Yang K Q,et a l.2006.Con structi on and ana l ysis of
a m etageno m i c li brary fro m t engchong hot spri ng soil i n Yunnan
P rovi n ce[J].A ct a M icob i o l og i ca S i n ica,46(3):427)431(i n
C hinese)
C ou rtois S,Capp ell ano C M,Ball M,et al.2003.R eco m b i nan t
env i ronm en tal li braries prov i de access t o m icrob ial d i versit y for drug
d i scovery from natural produ cts[J].App lied and E nvironm ental
M i crob i o l ogy,69(1):49)55
Dan iel R.2005.The m etagen o m ics of soil[J].N ature R evie w s M i crob i o l ogy,3:470)478
Davi d M,Fran ci sco R V.2004.C o mparati ve anal ysis of a geno m e
f ra
g m en t of an un c u lti vated m es opel ag i c crenarchaeote reveals
mu lti ple hori zon t a lgene transfers[J].Environm en t alM icrobiol ogy, 6(1):19)34
Dum ont M G,M urell J C.2005.S tab l e isot op e prob i ng-li nk i ng m icrob i al
i den tity to functi on[J].Nat u re Rev i e w s M icrob i ol ogy,3(6):
499)504
Fal ko w sk iP G.,de Vargas C.2004.Sh otgun sequen ci ng i n t he sea:a
b l ast fro m the pas t[J].Science,304(5667):58)60
Fan B,Cu iZ L,Q i u S L,et a l.2006.C onstru cti on of soilm etageno m i c li b rary w ith p las m i d vector[J].Acta Pedologica S inica,43(3): 513)516(in Ch i nese)
Feder M E,M itc h el-l O l ds T.2003.Evo l uti onary and ecological
f unctional geno m i cs[J].Nature Revie w s G enetics,4:651)657 FerrerM,M art nez-Abarca F,Gol yshin P N.2005.M i n i n
g geno m es and -m etageno m es.f or novel catal ysts[J].Cu rrent Op i n i on
B i otechnol ogy,16:1)6
Gab or E M,de Vries E J,Janssen D B.2004.C onstru cti on, characteraizati on,and u se of s m al-l i n s ert gen e bank s of DNA
i solated fro m s o il and en ri chm ent cu l tures f or the recovery of novel
a m i das es[J].Environm en talM i cro
b i ology,6:948)958
Ge Y,H e J Z,Zheng Y M,et a l.2006.Stab le i sot ope prob i ng and its app licati ons i n m i crob i al eco l ogy[J].Acta E cologica S i n i ca,26
(5):1574)1582(i n C h i nes e)
G ill S R,Pop M,Deboy R T,et al.2006.M etageno m ic analys i s of the
hu m an d istal gu tm icrob i o m e[J].S ci en ce,312:1355)1359
G illesp i e D E,Brady S F,B ett er m ann A D,e t a l.2002.Isolati on of
an ti b ioti cs t u rbo m yci n A and B fro m a m etageno m i c li b rary for soil m icrob i alDNA[J].Appli ed and Env i ronmentalM i crob i o l ogy,68: 4301)4306
H andels m an J,Rondon M R,B rady S F,et a l.1998.M olecu lar
b i ological access to the che m i stry of unknown s o ilm i crobes:a new
f ronti er f or natural products[J].C he m istry and B iol ogy,5:
245)249
H e J Z,Xu Z H,H ughes J.2005a.Anal yses of soil f unga l co mmun ities
i n ad j acent nat u ral forest and hoop p i ne p lantati on ecosyste m s of
s ub trop i calAu stralia u si ng m ol ecu l ar app roaches based on18S rR NA genes[J].FEM S M icrob iol ogy L etter,247:91)100
H e J Z,Xu Z H,Hughes J.2005b.P re-l ysis w ash i ng i m p roves D NA
extracti on fro m a forest soil[J].So ilB iol ogy and B i oc h e m istry,37
(12):2337)2341
H e J Z,Xu Z H,Hughes J.2006.M olecu l ar bacterial d i vers it y of a
forest soilunder resi due m anage m ent regi m es i n subtrop i calAus tralia [J].FEM S M icrob i ol ogy Eco l ogy,55:38)47
H esselsoeM,BrandtK K,Sorensen J.2001.Quantificati on of a mmon i a-
oxi d izi ng bact eri a i n soil us i ng m icroco l ony techn i que co m b i ned w i th fl u orescen ce i n situ hybridizati on(M CFU-F I SH)[J].FEM S M icrob i ol ogy Ecol ogy,38:87)95
K ellenb erger E.2001.Exp l ori ng the unko w n-The sil en t revol u tion of m i crob i o l ogy[J].EM BO Reports,2:5)7
K i m H K,J ung Y J,Cho iW C,et a l.2004.Sequen ce-based app roach to fi nd i ng f unctional li pas es from m i crob ial geno m e databases[J].
FEM S M icrob iol ogy L etter,235:349)355
K i m Y J,Choi G S,K i m S B,et a l.2006.S creen i ng and characterizati on of a novel esterase fro m am etageno m i c li brary[J].
Protei n Express i on and Purifi cati on,45:315)323
K niets ch A,W asc hkow itz T,Bow ien S,et a l.2003.C onstru cti on and screen i ng ofm etageno m i c li braries deri ved fro m en ri chm en t cu l tures: generation of a gene bank for genes con f erri ng al cohol oxidoreductase acti v i ty on E sc h e richia coli[J].App li ed and Environm en t al M icrob i ol ogy,69:1408)1416
Lopez-Garci a P,B roc h ier C,M orei re D,et al.2004.C o mp arati ve anal ysis of a geno m e fiag m en t of au uncu lti vated i n esopelagic crenarchaeote reveal s m u l ti p l e hori zon tal gene transfers[J].
Environm en t alM i crob i ology,6:19)34
Lopez-Garci a P,Broch i er C,M oreira D,et a l.2004.C o mp arati ve anal ysis of a geno m e frag m en t of an un c u lti vated m esopelagic crenarchaeote reveals m ulti p l e h oriz ontal gen e transfers[J].
Environm en t alM i crob i ology6:19)34
Lu Y,Con rad R.2005.In sit u stab l e i sotope p rob i ng of m ethanogen ic archaea i n the rice rh i zos phere[J].S ci en ce,309(5737): 1088)1090
M argu li es M,Eghol m M,A lt man W,E,et a l.2005.Gen o m e s equ enci ng i n m icrofab ri cated h i gh-dens it y p icolitre react ors[J].
N ature,437:376)380
M arti nez A,Kol vek S J,H opke J,et a l.2005.E nvironm ental D NA fragm ent con f erri ng earl y and i ncreas ed sporu lati on and an tib i otic p roduction i n S trep t o m yces s p ecies[J].App li ed and Environm en t al M icrob i ol ogy,71(3):1638)1641
M arti nez A,Kol vek S J,Y i p C L T,et a l.2004.Geneti cally m od ified bact eri al strai n s and n ovel bact eri al artifi ci a l chro m os om e s hu ttle vectors for con structi ng environm en t a l li braries and detecti ng heterol ogou s natural p roducts i n mu ltiple expressi on hosts[J].
App lied and Env i ron m en talM i crob i o l ogy,70:2452)2463
M c H ardy A C,M art n H G,Ts iri gos A,e t a l.2007.A ccu rate
217
环境科学学报28卷
phyl ogen eti c cl assificati on of DNA frag m ents based on s equ ence co m positi on[J].Nature M ethods,4:63)72
Radaj e w s k i S,Ineson P,Parekh N R,et al.2000.S tab l e-is otope prob i ng as a tool i n m icrob ial eco l ogy[J].Nat u re,403(6770): 646)649
R iesen f eld C S,Sch l oss P D,H andels m an J.2004.M etageno m i cs: geno m ic analys i s ofm i crob i al co mm un i ti es[J].Annua lR evie w of Gen eti cs,38:525)552
Rondon M R,August P R,Better m ann A D,et al.2000.C l on i ng the soilm etageno m e:a strat egy f or access i ng the genetic and f unctional
d i versit y of un cultured m i croorgan is m s[J].App li ed and
E nvironm entalM icrob iol ogy,66(6):2541)2547
Sebat J L,Col w ell F S,C ra w f ord R L,2003.M etageno m i c profili ng: m icroarray anal ys i s of an environm en t a l geno m i c li brary[J].
App li ed and Environm entalM icrob i ol ogy,69(8):4927)4934 Shen J P,Zhang L M,H e J Z,et al.2007.M ethodology and app li cati on of s oilm etageno m i cs[J].Ch i n ese J ou rnal ofApp lied E col ogy,18
(1):212)218(in Ch i nese)
S t ok es H W,H ol m es A J,N iel d B S,e t al.2001.G ene cassett e PCR: sequen ce-i ndependen t recovery of en tire genes fro m environm ental DNA[J].App lied and Environm en tal M i crobology,67(11): 5240)5246
The National A cade m i es.2007.The ne w science of m etageno m i cs: reveali ng the secrets of ourm icrobial planet[M].W ash i ngt on D C: The N ati on alAcade m ies Press,157
T reu s ch A H,K letz i n A,Raddatz G,et a l.2004.C haracterizati on of l arge-insert DNA li braries fro m s o il for environm ental geno m i c stud i es of A rchaea[J].Environm en tal M icrob iol ogy,6(9): 970)980
Tyson G W,Ch ap m an J,H ugenho l tz P,et al.2004.C o mm un i ty stru cture and m etaboli s m t h rough reconstru cti on of m icrob i al geno m es fro m t he environm ent[J].Nat u re,428(6978):37)43 U c h iya m a T,Ab e T,Ike mu ra T,et a l.2005.Substrate-i nduced gen e-expression screen i ng of env i ron m en tal m etageno m e li b rari es f or
i solati on of catabolic gen es[J].Nat u re B i otechnology,23:88)93 Ven ter J C,Re m i ngt on K,H ei delberg J F,et al.2004.E nvironm ental geno m e shot gun sequen cing of the S argasso Sea[J].Science,304:
66)74V oget S,Legge w ie C,Ues b eck A,et a l.2003.P rospecti ng for n ovel
b i ocatal ysts i n a s o ilm et ageno m e[J].App lied and Environm en t al
M icrob i ol ogy,69:6235)6242
W agner M,N i elsen P H,Loy A,et al.2006.L i nk i ng m i crob i al co mm un it y stru cture w it h functi on:fl u orescen ce i n s i tu hyb ri d iz ati on-m i croautorad i ography and i sot ope arrays[J].Cu rrent Op i n ion i n B i otec hno l ogy,17:83)91
Xu Y Q,Duan C J,Zhou Q N,e t al.2006.C lon i ng and i dentification of cellulase genes fro m uncu lt u red m icroorgan is m s in pu l p sed i m ents fro m paperm ill effl u ent[J].Acta M icob i o l og i ca S i n i ca,46(5): 783)788(i n Ch i n ese)
Y un J,Kang S,Park S,et a l.2004.C haracteriz ati on of a n ovel amylol yti c en z y m e encoded by a gen e fro m a soi-l deri ved m etagen o m ic li brary[J].App li ed and Env i ron m en talM i crob i ology, 70(12):7229)7235
Zhang J W,Zeng R Y.2006.C lon i ng,express i on and characteri zation of the col d acti ve li pase(L i p3)fro m m et agenom ic DNA of an antarctic deep s ea sed i m ent[J].Progress i n B i oche m i s try and
B i ophys i cs,33(12):1207)1214(i n Ch i n ese)
Zhang L M,L i u F,Tan W F,e t al.2007.M icrob i al DNA extraction and anal yses of soil iron–m angan ese nodu l es[J].Soil B i ology and B i oche m i stry(On li ne,do:i10.1016/.j soil b io.2007.01.004)
中文参考文献:
蔡莹,陈秀珍,杨克迁,等.2006.云南腾冲热泉土壤微生物基因组文库的构建与分析[J].微生物学报,46(3):427)431
樊奔,崔中利,邱珊莲,等.2006.以质粒载体构建土壤宏基因组文库的研究[J].土壤学报,43(3):513)516
葛源,贺纪正,郑袁明,等.2006.稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用[J].生态学报,26(5):1574)1582
沈菊培,张丽梅,郑袁明,等.2007.土壤宏基因组学技术及其应用[J].应用生态学报,18(1):212)218
许跃强,段承杰,周权能,等.2006.造纸废水纸浆沉淀物中未培养微生物纤维素酶基因的克隆和鉴定[J].微生物学报,46(5): 783)788
张金伟,曾润颖.2006.南极深海沉积物宏基因组DNA中低温脂肪酶基因的克隆、表达及性质分析[J].生物化学与生物物理进展,33(12):1207)1214
218
宏基因组学的研究状况及其发展 摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛 选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域，并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。 关键词：宏基因组学、宏基因组、基因组文库构建、文库筛选、未培养微生物、研究进展 随着微生物学的发展，微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行，但现有技术条件下，自然界存在的可培养微生物不到总数的1％，阻碍了该计划 的发展，使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用。21世纪初，随着测序能力的提高和基因组学的发展，科学家提出了一种研究不可培养微生物基因组的新思路——直接对含有各种不可培养的微生物的群体进行基因组序列的测定。这类研究称为Metagenomics，前缀“Meta”源于希腊语。意思是“超越”。科学家选择它来表示这种基因组研究超越了传统意义上分析单一物种的基因组学，将研究对象定为由种类众多的微生物组成的整个菌落。国内的研究者也据此将该术语翻译为“宏基因组学”。 1 宏基因组的概念 宏基因组 (也称微生物环境基因组、宏基因组学、元基因组学、生态基因组学) 是由Handelsman等1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌 和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 克隆DNA到合适 的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会，为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库，并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。 2 宏基因组学的研究过程 2．1 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和策略。一般包括样品总DNA的 提取、与载体连接和克隆到宿主中。 2．1．1样品总DNA的提取 宏基因组文库构建的关键之一是获得高质量的目的样品的总DNA。目的样品 的采集是第一步，除了需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品能更好地代表自然状态下的微生物原貌。 根据提取样品总DNA前是否分离细胞，提取方法可以分为原位裂解法和异位 裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)、酶解法(如蛋白酶K)、机械
真菌基因组学研究进展 真菌为低等真核生物，种类庞大而多样。据估计，全世界约有真菌150万种，已被描述的约8万种。真菌在自然界分布广泛，存在于土壤、水、空气和生物体内外，与人类生产和生活有着非常密切的关系。许多真菌在自然界的碳素和氮素循环中起主要作用，参与淀粉、纤维素、木质素等有机含碳化合物及蛋白质等含氮化合物的分解。有些真菌如蘑菇、草菇、木耳、麦角、虫草、茯苓等可直接供作食用和药用，或在发酵工业、食品加工业、抗生素生产中具有重要作用。然而，也有些种类引起许多植物特别是重要农作物的病害，如水稻稻瘟病、小麦锈病、玉米腥黑穗病、果树病害等。少数真菌甚至是人类和动物的致病菌，如白色假丝酵母Candida albicans等。因此，合理利用有益真菌，控制和预防有害 真菌具有重要意义。 本文整理了已完成基因组序列测定的真菌的信息，并对真菌染色体组的历史、测序策略及其基因组学的研究进展进行了评述。 1真菌染色体组的研究历史和资源 1986年美国科学家Thomas Rodefick提出基因组学概念，人类基因组计划带动了模式生物和其它重要生物体基因组学研究。阐明各种生物基因组DNA中碱基对的序列信息及破译相关遗传信息的基因组学已经成为与生物学和医学研究不可分割的学科。由欧洲、美国、加拿大和日本等近百个实验室六百多位科学家通力合作，1996年完成第一个真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组测序，这 对于酵母菌类群来说是一个革命性的里程碑，并且激起了真核基因功能和表达的第一次全球性研究(Goffeau etal，1996)。随后粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(Wood etal.2002)和粗糙脉孢 霉Neurospora crassa(Galagan etal.2003)染色体组的完成显露出酿酒酵母作为真菌模式生物的局限性。尽管如此，真菌染色体组测序的进展最初是缓慢的。为加快真菌染色体组研究的步伐，2000年由 美国Broad研究所与真菌学研究团体发起真菌基因组行动(fungal genome initiative，FGI)，目的是 促进在医药、农业和工业上具有重要作用的真菌代表性物种的基因组测序。2002年2月FGI发表了第 一份关于测定15种真菌基因组计划的白皮书。2003年6月，真菌基因组行动发表了第二份白皮书，列 出了44种真菌作为测序的目标，强调对其中10个属即青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、组 织胞浆菌属Histoplasma、球孢子菌Coccidioides、镰刀菌属Fusarium、脉孢菌属Neurospora、假丝 酵母属Candida、裂殖酵母属Schizosaccharomyces、隐球酵母属Cryptococcus和柄锈病菌属Puccin& 的物种优先进行测序。之后，经过FGI、法国基因组学研究项目联(G6nolevures Consortium)、美国能 源部联合基因组研究所(The DOE Joint Genome Institute，JGI)DOE联合基因组研究所、基因组研究 院(The Institute for Genomic Research，TIGR)、英国The Wellcome Trust Sanger InstimteSanger和华盛顿大学基因组测序中心等共同努力；得到包括美国国家人类染色体研究所、国 家科学基金会、美国农业部和能源部等的资助，也有来自学术界和产业集团如著名的 Monsanto、Syngenta、Biozentrum、Bayer Crop Science AG和Exelixis等公司的持续合作，在最近 的几年里，真菌基因组学研究取得重大突破。至2008年6月1日，共有3734种生物的全基因组序列测定工作已经完成或正在进行，公开发表812个完整的基因组，其中，70余种真菌基因组测序工作已经 组装完成或正在组装，分别属于子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门和微孢子虫(Microsporidia) 的代表。此外，还有Ajellomyces dermatitidis和Antonospora locustae等20余种真菌基因组序列 正在测定中(Bemal etal．2001)。这些真菌都是重要的人类病原菌、植物病原菌、腐生菌或者模式生物，基因组大小为2．5—81．5Mb，包含酵母或产生假菌丝的酵母、丝状真菌，或者具有二型性(或多型性) 生活史的真菌，拥有与动物和植物细胞一样的的细胞生理学和遗传学特征，包括多细胞性、细胞骨架结
宏基因组学概述
————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期: ?
宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班） 摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法
研究进化基因组学进展 摘要：进化基因组学是利用基因组数据研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的学科。随着近年来基因组数据的不断增加，进化基因组学得到了长足的发展。进化基因组学主要包括从基因组水平理解和诠释生物进化和新基因分析研究探索两方面的内容。本文介绍了进化基因组学研究的主要内容和较为常用的方法，以及近年来在细菌、酵母、果蝇进化基因组学方面的研究进展。 关键词：进化基因组学系统进化比较基因组学新基因 正文 随着基因测序技术的不断进步以及基因组学的飞速的发展，人们积累了大量的基因组学数据，利用所得的大量的基因组数据与进化生物学相结合，在基因组水平研究生物进化机制，随即产生了进化基因组学。 近年来进化基因组学取得了长足的进展，在研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的终极方式等方面有重大突破，对人类理解生命现象和过程有重要作用。 研究系统进化学通常包括两个关键步骤：一方面，在不同物种中鉴定同源性特佂，另一方面利用构建系统进化树的方法比较这些特征，进而重新构建这些物种的进化历史[1]。针对这两个关键步骤，传统系统进化学，常采用基于形态学数据和单个基因研究的同源性状鉴定和重建系统进化树（常包括距离法、最大简约法、概率法）[1]的方法来研究。在目前拥有丰富基因组数据的条件下，我们可以分析基因组数据，利用进化基因组学研究系统进化。 一、目前进化基因组学的研究内容主要集中于两个方面：（1）在比较不同生物的基因数据的基础上，从基因组水平理解和诠释生物进化；（2）通过对新基因的分析研究探索基因进化过程的规律两个方面。在进行全基因组进化分析方面，进化基因组学主要集中于构建系统进化树、研究基因组进化策略、研究生物功能变化和进化机制、进化和生态功能基因组学、基因注释的等方面；在新基因方面
宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165) 摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。 关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1 宏基因组学的研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1 宏基因组的提取 在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3 目的基因的筛选 目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。 对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2 宏基因组学的应用 2.1 在生态学方面的应用 当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得
基因组学研究的应用前景摘要：基因组学是一门研究基因组的结构，功能及表达产物的学科，基因组的结构不仅是蛋白质，还有许多复杂功能的RNA,包括三个不同的亚领域，及结构基因组学，功能基因组学和比较基因组学。近几年，基因组学在微生物药物，细菌，病毒基因，营养基因方面都有进展，其前景是光明的。 关键词：基因研究未来结构 一、微生物药物产生菌功能基因组学研究进展 微生物药物是一类化学结构和生物活性多样的次级代谢产物，近年来多个产生菌基因组序列已经被测定完成，在此基础上开展的功能基因组研究方兴未艾，并在抗生素生物合成，形态分化，调控，发育与进化及此生代谢产物挖掘等方面有着新的发现，展现出广阔的研究前景，青霉素及其衍生的《》内酰胺类抗生素极大地改善了人类的卫生保健和生活质量，并促进研究人员不断对其工业生产菌株类黄青霉进行遗传改良和提高其产量，从而降低生产成本。经过60年的随机诱变筛选，当前青霉素产量至少提高了三个数量级，同时，青霉素的生物合成机理也得到了较为清晰的阐述，其pcbAB编码的非核糖体肽合酶ACVS~DPcbc编码的异青霉素N合成酶IPNS位于细胞质中，而苯乙酸COA连接酶PenDE编码的IPN酰基转移酶位于特殊细胞器一微体中。 研究发现，青霉素合成基因区域串联扩增，产黄青细霉胞中微体含量增加都可显著提高青霉素产量。然而随机诱变筛选得到的黄青霉工业菌株高产的分子机制尚不明确。为此，2008年荷兰研究人员联合国美国venter基因组研究所对黄青霉wisconsin54—1225进行了基因组测试和分析，并进一步利用DNA芯片技术研究了wisconsin54—1255及其高产菌株DS17690在培养基中是否添加侧链前体苯乙酸情况下的转录组变化，四组数据的比较分析发现，有2470个基因至少在其中一个条件下是差异表达的，根据更为严格的筛选标准，在PPA存在的条件下，高产菌相比测序菌株有307个基因转录是上调的，和生长代谢，青霉素前体合成及其初级代谢和转运等功能相关，另有271个基因显著下调，主要是与生长代谢及发育分化相关的功能基因。 二、乳酸菌基因组学的研究进展
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班） 摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Macro summary of Metagenomics Wang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,） Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA （也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"met a-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter 将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生 物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。
进化基因组学研究进展 刘超 （山东大学生命科学学院济南250100） 摘要：进化基因组学是利用基因组数据研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的学科。随着近年来基因组数据的不断增加，进化基因组学得到了长足的发展。进化基因组学主要包括从基因组水平理解和诠释生物进化和新基因分析研究探索两方面的内容。本文介绍了进化基因组学研究的主要内容和较为常用的方法，以及近年来在细菌、酵母、果蝇进化基因组学方面的研究进展。 关键词：进化基因组学系统进化比较基因组学新基因 前言 随着基因测序技术的不断进步以及基因组学的飞速的发展，人们积累了大量的基因组学数据，利用所得的大量的基因组数据与进化生物学相结合，在基因组水平研究生物进化机制，随即产生了进化基因组学(Evolutional Genomics)。 近年来进化基因组学取得了长足的进展，在研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的终极方式等方面有重大突破，对人类理解生命现象和过程有重要作用。 1进化基因组学研究内容 研究系统进化学通常包括两个关键步骤：一方面，在不同物种中鉴定同源性特佂，另一方面利用构建系统进化树的方法比较这些特征，进而重新构建这些物种的进化历史[1]。针对这两个关键步骤，传统系统进化学，常采用基于形态学数据和单个基因研究的同源性状鉴定和重建系统进化树（常包括距离法、最大简约法、概率法）[1]的方法来研究。在目前拥有丰富基因组数据的条件下，我们可以分析基因组数据，利用进化基因组学研究系统进化。
目前进化基因组学的研究内容主要集中于两个方面：（1）在比较不同生物的基因数据的基础上，从基因组水平理解和诠释生物进化；（2）通过对新基因的分析研究探索基因进化过程的规律两个方面[2]（如图1）。在进行全基因组进化分析方面，进化基因组学主要集中于构建系统进化树、研究基因组进化策略、研究生物功能变化和进化机制、进化和生态功能基因组学[2]、基因注释的等方面；在新基因方面主要分析基因产生机制和新基因固定及其动力学研究。 图1 进化基因组学主要研究内容 目前进化基因组学的研究有力的解决了一些基础性的进化问题，但也出现了一些未来需要急需解决的挑战。例如生物进化的本质和目前重建系统进化树方法的限制[1]。 2研究进化基因组学的方法 研究进化基因组学的方法主要包括利用基因组数据分析和研究新基因的产生和演化两种。 2.1利用基因组数据进行系统进化分析 利用基因组数据进行系统进化分析，常有基于基因序列的方法和基于全基因特征的方法。（如图2）
环境基因组学的研究进展及其应用 贾海鹰 张徐祥 孙石磊 赵大勇 程树培* （南京大学，环境学院，南京，210093） E-mail（jhy194@https://www.doczj.com/doc/1f2262327.html,） 摘 要：本文系统地介绍了环境基因组学的基本概念、研究的主流技术平台及其在环境污染控制、健康风险检测与评价等方面地应用，并阐明了环境基因组学与生物信息学两者之间的关系。环境基因组学在分子水平上揭示了环境污染物与生物之间的相互作用，为检测、控制环境污染维护环境健康注入了新的活力。 关键词：环境基因组学 生物信息学 健康风险评价 环境污染 环境健康 1.引言 2003年4月14日，人类基因组计划(Human Genome Project)顺利完成。HGP成功地绘制出了遗传图谱、物理图谱、序列图谱和转录图谱4张图谱。这标志着人类基因组计划的所有目标全部实现。至此，HGP的研究发生了翻天覆地的变化，已从结构基因组学研究时代进入了功能基因组（后基因组）时代[1-2]，因此也就有了“人类后基因组计划”。HGP正朝着生物信息科学、计算机生物技术、数据处理、知识产权及社会伦理学研究等多方面发展，对生命科学、环境科学、医疗卫生、食品制药、人文科学各领域产生了广泛而深远的影响。环境基因组学（environmental genomics）是在人类基因组基础上发展的功能基因组内容之一，由基因组学和环境科学交叉融合而成，是一个近期发展起来的新型边缘学科，是基因组学技术和成果在环境污染保护与控制和生态风险评价中的应用，在其发展的短短的几年时间内已渗透到环境科学研究的各个研究领域并发挥着日益重要的作用。 2.环境基因组学的概念与定义 至今，国内外学者对环境基因组学还没有统一明确的定义。但是，大多数学者认为，环境基因组学（environmental genomics）的概念与毒理基因组学（toxicogenomics）密切相关。自从1999年Nuwaysir等[3]首次提出毒理基因组学概念至今，在短短的八年的时间里这一概念不断地发展和完善着。目前人们普遍采纳的定义有两种，一种是美国国家毒理学规划机构给出的定义[3]：毒物基因组学是研究外来化学物对基因活性和基因产物的影响及相互作用的科学；另一种是由世界卫生组织给出的定义[3]，认为毒物基因组学是一门与遗传学、基因组水平上RNA表达(转录组学) 、细胞和组织范围的蛋白表达(蛋白质组学)、代谢谱(代谢组学) 、生物信息学和常规毒理学结合，以阐明化学物作用模式和基因－环境相互作用的潜在意义的科学。1998年4月4日，美国国会顾问环境卫生科学委员会正式投资专项基金进行环境基因组计划研究，其目的是专门研究与环境相关疾病的遗传易感性，寻找对化学损伤易感的基因，鉴定对环境发生反应基因中有重要功能的多态性，并确定它们在环境暴露引起疾病的危险度方面的差异；在疾病流行病学中研究基因与环境的相互作用，从而改善遗传分析技术，优化研究设计，建立样品资源库，把公用的多态性应用于社会、法律和伦理学[4-7]。2001年，Miller 提出环境基因组（Environmental Genomics）是在人类基因组（HGP）基础上发展起来的后 - 1 -
宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究
宏基因组学的研究
宏基因组学研究进展及其应用 摘要： 本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。 宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。 关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用 引言： 微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在内的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。 宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。 1.宏基因组学的概念 宏基因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓宏基因组学(也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学Microbial Environmental Genomics、生态基因组学Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。 2.宏基因组学的基本策略及方法 2.1宏基因组学的基本策略 宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化
基因组学课程论文 题目：植物基因组学的的研究进展姓名：秦冉 学号：11316040
植物基因组学的的研究进展 摘要：随着模式植物——拟南芥和水稻基因组测序的完成，近年来关于植物基因组学的研究越来越多。本文主要对拟南芥、水稻2种重要的模式植物在结构基因组学、比较基因组学、功能基因组学等领域的研究进展以及研究所使用的技术方法进行简单介绍。 关键词：植物；基因组学；研究进展 The recent progress in plant genomics research Abstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant-- Arabid opsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent yea rs. The research progress of the 2 important model plant--Arabidopsis and rice in structural genomics,comparative genomics,functional genomics and technology methods used in this research are introduced briefly in this paper. Keywords:plant; genomics; research advances 前言 基因组是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1986年由美国科学家Thomas Roderick提出的基因组学是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。自从1990年人类基因组计划实施以来，基因组学发生了翻天覆地的变化，已发展成了一门生命科学的前沿和热点领域。而植物基因组研究与其他真核生物和人类基因组研究有很大的不同。首先，不同植物的基因组大小即使在亲缘关系非常近的种类之间差别也很大; 其次，很多植物是异源多倍体，即便是二倍体植物中有些种类也存在较为广泛的体细胞内多倍化( endopolyp loidy）现象[1]。基因组研究主要包括三个层次:①结构基因组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱。②功能基因组学，即“后基因组计划”，是结构基因组研究的延伸，利用结构基因组提供的遗传信息，利用表达序列标签，建立以转录图谱为基础的功能图谱( 基因组表达图谱），系统研究基因的功能，植物功能基因组学是当前植物学最前沿的领域之一。③蛋白质组学，是功能基因组学的深入，因为基因的功能最终将以蛋白质的形式体现。 近来，以水稻( Oryza sativa）和拟南芥(Arabadopsis thaliana）为代表的植物基因组研究取得了很大进展，如植物分子连锁遗传图谱的构建，在此基础上，已经在植物基因组的组织结构和基因组进化等方面得到了有重要价值的结论; 植物基因组物理作图和序列测定的研究集中于拟南芥和水稻上; 植物比较基因组作图证实在许多近缘植物甚至整个植物界的部分染色体区段或整个基因组中都存在着广泛的基因共线性，使得我们可以利用同源性对各种植物的基因组结构进行研究、分析和利用。本文主要对拟南芥、水稻2种重要的模
宏基因组学研究进展及其应用 摘要： 本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。 宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。 关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用 引言： 微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在内的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。 宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。 1.宏基因组学的概念 宏基因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓宏基因组学(也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学Microbial Environmental Genomics、生态基因组学Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。 2.宏基因组学的基本策略及方法 2.1宏基因组学的基本策略 宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究范围中所有基因组展开研究