毕业设计（论文）
2012 届
题目穿心莲内酯的提取工艺研究
专业制药工程
学生姓名方梅芬
学号08092312
指导教师尹莉
论文字数10319字
完成日期2012年5月
湖州师范学院教务处印制
穿心莲内酯的提取工艺研究
08092312方梅芬
(湖州师范学院生命科学学院，湖州313000)
摘要：在单因素试验的基础上，采用正交试验法优选穿心莲内酯超声波提取法最佳提取条件。以穿心莲茎干粉末为原料，改变超声振荡功率、时间、料液比、不同溶剂、反应温度等单因素变量，提取液经配制后测量吸光度值，选定三水平后进行正交试验。以穿心莲内酯对照品制备标准液，计算回归方程为：Y=13.7828x-0.0074，R2=0.9692。结果表明，超声波提取的最佳工艺条件为：在60℃下，以乙酸乙酯为溶剂，料液比为1:30，功率为140w，超声提取60min，测得穿心莲提取液的吸光度为0.951。
关键词：穿心莲内酯; 超声波; 提取
Extraction Process of Andrographolide
08092312FANG Meifen
（School of Life Science，Huzhou Teachers College，Huzhou 313000 ）
Abstract: On the basis of one-factor experiment, orthogonal experiment method was employed for the optimization of ultrasonic extraction of Andrographis paniculta lactone. To stem powder andrographis as raw materials, change the single factor variables of ultrasonic oscillator power, the oscillator time, the solid-liquid ratio, the different solvent and the reaction temperature, extrat after configuration measuring absorbance, and then selected three levels before orthogonal experiment. With andrographis paniculta lactone reference substance preparation standard fluid, calculate a regression equation for: Y = 13.78281 x -0.0074 R2 = 0.9692. The optimum conditions of ultrasonic extraction of Andrographis paniculta lactone as follows: in 60 ℃, use ethyl acetate, the solid-liquid ratio is 1: 30, ultrasonic oscillator power is 140 w, and ultrasonic extraction 60 min. measuring absorbance Andrographis paniculta extrat is 0.951.
Key words: andrographis paniculta lactone; Ultrasonic; Extracted; absorbance
目录
1 引言 (1)
1.1穿心莲简介 (1)
1.1.1穿心莲
1.1.2穿心莲内酯的药理活性
1.2超声提取概述 (1)
2 实验材料与仪器 (2)
2.1实验材料 (2)
2.2实验试剂 (2)
2.3实验器材与仪器 (3)
2.4试剂的配制 (3)
3 实验方法 (4)
3.1实验原理 (4)
3.1.1单因素试验设计
3.1.2正交试验设计
3.1.3紫外-可见吸收光谱
3.1.4活性炭脱色
3.2实验步骤 (5)
3.2.1含量测定方法
3.2.2 标准曲线的绘制
3.2.3单因素试验
3.2.4正交试验
3.2.5验证实验
3.2.6穿心莲内酯的鉴别
4 结果与讨论 (8)
4.1实验结果 (8)
4.1.1标准曲线绘制
4.1.2以超声振荡时间为单因素变量的实验结果
4.1.3以超声功率为单因素变量的实验结果
4.1.4以料液比为单因素变量的实验结果
4.1.5以不同溶剂为单因素变量的实验结果
4.1.6以反应温度为单因素变量的实验结果
4.1.7正交试验结果
4.1.8验证实验结果
4.2实验结果讨论 (13)
4.2.1单因素试验结果讨论
4.2.2正交试验结果讨论
5 总结与展望 (14)
5.1总结 (14)
5.2展望 (14)
参考文献 (15)
致谢 (17)
1. 引言
1.1穿心莲简介
1.1.1穿心莲
穿心莲Andrograph is paniculata (B urm. f.) Nees为穿心莲属植物,别名一见喜、斩蛇草、苦草、四方草、印度草[1],主要产于广东、福建等地。性寒，味苦，具有清热解毒、凉血消肿的功效[2]，可用于治疗细菌性痢疾、毒蛇咬伤等，药理活性众多，药用价值很高。为进一步揭示穿心莲药理活性的物质基础，王国才等[3]对穿心莲叶进行较为系统的研究。研究发现，穿心莲药材的主要化学成分是二萜内酯类化合物，除分离得含量较高的穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯外，还从中分离出6个化合物。
1.1.2 穿心莲内酯的药理活性
穿心莲内酯又称为穿心莲乙素，化学式为C20H30O5，是穿心莲中的主要有效成分之一[4],在穿心莲叶中含量高达1. 84%[5]。穿心莲内酯为二萜内酯类化合物，在我国已作为穿琥宁、穿心莲注射液等解热镇痛药的原料大量生产。穿心莲内酯还可降低某些前炎症蛋白如COX- 2的表达[6]，从而起到抗炎作用。穿心莲内酯对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、甲型和乙型链球菌、白酵母等均有明显的抑制作用, 其对细菌性痢疾的疗效较氯霉素与痢特灵为优[7]，且无副作用和毒性。Kapil等[8]发现, 给小鼠腹腔注射穿心莲内酯,可对抗CCl4、t-BHP 引起的肝毒性作用, 显著抑制丙二醛形成,具有明显的保肝利胆效果。
近年来，肿瘤是困扰人类的一大难题，众多专家学者一直在研究如何攻克癌症这死亡第一大杀手。孙振华等[9,10]研究表明, 穿心莲内酯与硫酸氢钠制备的莲必治注射液(LBZ)在体外研究与动物实验对胃癌、肝癌、肺癌、乳癌等有明显的抗癌作用。其抗肿瘤的机制,可能与诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制细胞周期、提高淋巴细胞抗肿瘤活性等方面有关[11]。穿心莲内酯具有抗心肌缺血和抗缺血-再灌注损伤、保护血管内皮细胞、抗血小板聚集、调脂、降血压、抗动脉粥样硬化、预防血管形成术后再狭窄和改善血液流变性等作用。穿心莲内酯分子中的α, β-不饱和双键和超氧自由基( O-2 )发生亲核发应, 清除O-2, 防止脂质过氧化反应, 这可能与抗心肌缺血有关[12]。
有研究表明，穿心莲内酯丁二酸单酯钠盐对人早期妊娠胎盘绒毛有损害作用[13]，对男性精子形成也有影响, 通过阻止生精细胞的胞质分裂影响生精过程，建议准备生育的夫妇和孕育期的妇女不要使用含穿心莲内酯的药。由穿心莲内酯与亚硫酸氢钠加成反应制成的莲必治注射液临床上可治疗肺炎、急性扁桃体炎等疾病，但它的不良反应的报道也时时存在。所以穿心莲内酯使用也要慎重，穿心莲内酯注射液属于低毒药品[14],短期大剂量给药对动物的肝、肾可造成一定程度的损伤，长期毒性试验可以验证穿心莲内酯可致肾小管损伤。
1.2超声提取概述
超声波是一种高频机械波。频率范围在15~60kHz的超声，常被用于过程的强化和引发化
学反应。超声波的产生原理是产生所需频率的电震荡，再转换成机械振荡。超声协助浸取的三大理论依据是超声波热学机理、超声波机械机制和空化作用。
⑴超声波热学机理
超声能和其他形式的能一样也会转化成热能。超声波在媒介中传播时生成的热能取决于介质对其的吸收，所吸收能量大部分或全部转化成热能，导致组织温度上升。空穴闭合或气泡崩塌之后，其内“热点”骤然冷却，冷却速度可达108K/s。这相当于将金属熔浆放入液氮中的急剧冷却速度。
⑵超声波机械机制
超声波的高频振动及辐射压力可在气体或液体中形成有效的搅动与流动，使媒质质点在其传播空间内进入振动状态，从而可加速细胞内物质的释放、扩散及溶解过程。
⑶空化效应
当空穴闭合或微泡破裂时，会使介质局部形成几百到几千K的高温和超过数百个大气压的高压环境，并产生很大的冲击力，起到激烈搅拌的作用，同时生成大量的微泡，这些微泡又作为新的气核，使该循环能够继续下去，这就是空化效应。空化效应产生的极大压力造成被粉碎物细胞壁及整个生物体的破碎，且整个破碎过程瞬间完成，提高了破碎速度，缩短了破碎时间，使提取效率显著提高。
超声波协助萃取的特点：①无需高温，在40℃～50℃水温超声波萃取，不会破坏中药材中某些热不稳定、易水解的有效成分。②萃取效率高，超声萃取20～40min即可获得最佳提取效率。③常压萃取下安全性好。④具有广谱性，适用性广。⑤能耗低。⑥药材原料处理量大，数倍提高，杂质少，有效成分易于分离、净化。⑦萃取工艺成本低，综合经济效益显著。
超声波提取设备主要由提取槽、超声波发生器和电源等部分组成。提取槽是盛放提取物系的容器，一般由不锈钢制成，其内安装有加热及控温装置，底部粘接超声波换能器。超声波发生器是超声波提取设备的关键部件，其作用是将电能转换成机械能。目前，超声波提取设备已实现商业化生产,可以满足小试、中试和大生产的需要。
超声协助浸取技术用于从植物药材中提取药用有效成分的研究近年取得了很大进展，例如提取生物碱类成分、黄酮类成分、蒽醌类成分、多糖类成分、皂苷类成分等。
2. 实验材料与仪器
2.1实验材料
风干的穿心莲茎干：实验所用的穿心莲来自于杭州市中药饮片厂。
2.2实验试剂
表2-1实验中所需的试剂
试剂名称试剂纯度试剂产地
3，5-二硝基苯甲酸分析纯AR上海晶纯试液有限公司
95%乙醇分析纯AR浙江杭州长征化学试剂有限公司
无水乙醇分析纯AR浙江杭州长征化学试剂有限公司
乙酸乙酯分析纯AR浙江省杭州双林化工试剂厂
氯仿分析纯AR浙江省衢州巨化试剂有限公司
石油醚分析纯AR杭州石化有限责任公司
氢氧化钾分析纯AR杭州萧山试剂厂
2.3 实验器材与仪器
⑴实验器材：锥形瓶（250mL）、容量瓶（100mL、250mL）、大烧杯、小烧杯、滴定管、量筒、铁架台、小试管、抽滤瓶、玻璃棒、滤纸、剪刀等
⑵实验仪器：
表2-2实验所需仪器
仪器名称仪器型号仪器产地
紫外可见分光光度计SP-752型上海光谱仪器有限公司
架盘药物天平JP-500型常熟市双杰测试仪器厂
电子天平BS124S型赛多利斯科技仪器（北京）有限公司
恒温水浴锅HH-4型国华电器有限公司
新型粉碎机JFSO-100型浙江台州伟新粮检厂
循环水式多用真空泵SHZ- D (Ⅲ)型巩义市英峪予华仪器厂
超声波清洗器KQ5200DE型昆山市超声仪器有限公司
2.4 试剂的配制
⑴0.2mol/L KOH的制备：在电子天平上精确称取0.112g氢氧化钾，溶解于适量蒸馏水中，用玻璃棒转移到容量瓶中，定容至100mL，摇匀后备用。
⑵1% 3,5-二硝基苯甲酸的制备：用电子天平精确称取2.120g3,5-二硝基苯甲酸，溶解于适量蒸馏水中，用玻璃棒转移到容量瓶中，定容至100mL，摇匀后备用。
⑶60%的乙醇溶液：取实验室的无水乙醇60mL，放入100 mL容量瓶中，向容量瓶中加水至刻度线，摇匀后备用。
⑷75%的乙醇溶液：取实验室的无水乙醇75 mL，放入100 mL容量瓶中，向容量瓶中加水至刻度线，摇匀后备用。
3．实验方法
3.1 实验原理
3.1.1 单因素试验设计
单因素试验设计是指试验中只考虑单一因素的影响，虽然实际试验中影响因素可能比较多，但我们需要先孤立其中一个因素进行研究。他包括完全随机的实验设计、随机区组设计和拉丁方的实验设计。
3.1.2 正交试验设计
试验设计法是在1920年有英国著名统计学家费歇（R.A.Fisher）发展起来。但是采用这种方式进行试验是，当因素与位级增加时，试验次数急剧增加。20世纪50年代初，日本电讯研究所田口玄一博士在此基础上开发了正交试验设计技术。此试验应用一套正规化的正交表来安排实验和用一种程序化的计算方法来分析试验结果，由于这种方法的试验次数少、分析方法简便、重复性好、可靠性高并适用面广，因而在世界范围内迅速普及，成为试验设计的重要工具。正交试验法的原理，我们以23型全面试验为例进行说明。23型全面试验，即因素为A、B、C 各取2水平，共需进行23=8次，如表3-1所示。正交试验法对于全面试验来说只实施了一部分，但对于其中任意两个因素来说，却是带有等重复的全面试验。
表3-1 23型全面试验表
实验号
因素
A B C
1 1 1 1
2 1 1 2
3 1 2 1
4 1 2 2
5 2 1 1
6 2 1 2
7 2 2 1
8 2 2 2
3.1.3 紫外-可见吸收光谱
紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）[15]是研究物质在紫外-见光波区(190nm～1100nm) 的分子吸收光谱的一种常用分析方法。某些物质的分子在吸收光能后由稳定状态的基态分子月前到不稳定的高能态从未形成光谱。利用这一特性可以对无机化合物、有机化合物及生物大分子进行定性和定量分析，继而出出现了紫外-可见分光光度计。紫外-可见光谱的基本原理是光的吸收定
律，即朗伯-比尔定律（Lambert-Beer）。比尔—朗伯定律数学表达式：
A=log(1/T)=Kbc（3-1）A：吸光度；T：透射比，是透射光强度(I0)比上入射光强度(I t)；K:摩尔吸收系数；b：吸收层厚度，一般以cm为单位；c：吸光物质的浓度。
穿心莲内酯为不吸收可见光的无色物质，与3,5-二硝基苯甲酸的碱性实际发生显色反应，反应液呈紫红色，故可用分光光度计来测量穿心莲内酯含量。但是为了提高测定的灵敏度，需要准确控制显色时间和显色剂用量[16]。
3.1.4 活性炭脱色
活性炭是一种黑色粉状，粒状或丸状的无定形具有多孔的碳，主要成分为碳，含少量氧、氢、硫、氮、氯。具有较大的表面积，有很强的吸附性能，能在它的表面上吸附气体、液体或胶状固体，常用于气体的吸附、分离和提纯，溶剂的回收和油脂、甘油、药物的脱色剂。活性炭在水中脱色效果最强，有机溶剂中较弱。一般加0.1~3%（w/v），脱色时间一般为30~60min，使用温度在75~80℃比较好。要注意不可在沸腾的溶液中加入活性炭，会产生暴沸的可能。另外，有色杂质虽可溶于沸腾的溶剂中，但当冷却析出结晶体时部分杂质又会被结晶吸附，使得结晶带色，所以用活性炭脱色要等固体物质完全溶解后再加。
3.2 实验步骤
3.2.1 含量测定方法
⑴对穿心莲内酯对照品溶液(配制方法见 3.3.2)进行最大吸收波长扫描，后得出穿心莲内酯的最大吸收波长在226nm处，与参考文献比较后结果相近，所以选择此波长为穿心莲内酯的测试波长。结果见图3-1。
图3-1 穿心莲内酯吸收光谱图
⑵此处采用比色法测定穿心莲内酯浓度。事先配制好需要测吸光度的提取液10mL：稀释好的穿心莲内酯提取液1mL，加入1%3,5-二硝基苯甲酸2 mL，0.2mol/L KOH溶液2mL,60%乙醇溶液4 mL，静置15s后用60%乙醇定容至10 mL，摇匀，在紫外-可见分光光度仪上226nm
出比色，测定吸光度。
3.2.2 标准曲线的绘制
⑴标准液的配备：精密称取穿心莲内酯对照品（在105℃下干燥至恒重）20mg，加95%乙醇完全溶解，转移到容量瓶中并定容至100mL，得到浓度为0.2mg/mL的标准液。
⑵测量：精密量取标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL,分别加入10mL容量瓶中，依次标号1、2、3、4、5、6、7。各加入60%乙醇2 mL，1%3,5-二硝基苯甲酸2 mL，0.2mol/L KOH 溶液2mL，摇匀，静置15后以60%乙醇定容至刻度，摇匀。以1号管为对照，分别在分光光度计上226nm处测量吸光度，并绘制标准曲线。曲线以穿心莲内酯浓度为横坐标，吸光度为纵坐标。
3.2.3 单因素试验
取穿心莲的干燥茎干为原料，挑去杂质，粉碎后备用。
⑴以超声震荡时间为单因素变量
精确称取5g穿心莲粉6份，分别加入250mL锥形瓶，再各加入50mL75%乙醇，置于超声波清洗器中，设置温度为40℃，超声功率100W，分别在20、40、60、80、100、120min时取出，依次用真空抽滤，再加入活性炭，30℃水浴10min脱色，抽滤，将滤液标号并用75%乙醇定容至250mL。按照3.2.1中方法测定吸光度，计算穿心莲内酯的相对含量。
⑵以超声功率为单因素变量
精确称取5g穿心莲粉6份，分别加入250mL锥形瓶，再各加入50mL75%乙醇，设置反应温度为40℃，分别在80、100、120、140、160、180瓦的功率下震荡20min。震荡结束后依次抽滤，再加入活性炭30℃水浴10min脱色，抽滤，取滤液标号，将所有滤液用75%乙醇定容至250mL。按照3.2.1中方法测定吸光度，计算穿心莲内酯的相对含量。
⑶以料液比为单因素变量
精确称取5g穿心莲粉6份，分别加入250mL锥形瓶，在各瓶中加入25mL、50mL、75mL、100mL、125ml、150ml75%乙醇，设置超声功率100瓦，超声温度40℃，然后放置于超声波清洗器中震荡20min。震荡结束后依次抽滤，再加入活性碳30℃水浴10min脱色，抽滤，取滤液标号，将所有滤液用75%乙醇定容至250mL。按照3.2.1中方法测定吸光度，计算穿心莲内酯的相对含量。
⑷以不同溶剂为单因素变量
精确称取5g穿心莲粉4份，分别加入250mL锥形瓶，再依次加入水、75%乙醇、乙酸乙酯、石油醚各50mL，设置超声功率100w，超声温度40℃，然后放置于超声波清洗器中震荡20min。震荡结束后依次抽滤，再加入活性碳30℃水浴10min脱色，抽滤，取滤液标号，将所有滤液用75%乙醇定容至250mL。按照3.2.1中方法测定吸光度，计算穿心莲内酯的相对含量。
⑸以反应温度为单因素变量
精确称取5g穿心莲粉6份，分别加入250mL锥形瓶，再加入50mL 75%乙醇，设置超声功
率100瓦，温度设置为40、45、50、55、60、65℃，置于超声波清洗器中震荡20min，震荡结束后依次抽滤，再加入活性碳30℃水浴10min脱色，抽滤，取滤液标号，将所有滤液用75%乙醇定容至250mL。按照3.2.1中方法测定吸光度，计算穿心莲内酯的相对含量。
3.2.4 正交试验
在以上单因素试验结果的基础上，选择对穿心莲内酯提取浓度影响较大的各主要因素进行正交试验。以反应温度45℃时，对超声震荡时间、超声功率、料液比、提取溶剂这4个因素进行3水平4因素L9(34)正交试验，所得滤液用75%乙醇定容至250mL，在最大吸收波长226nm 处测吸光度，找出穿心莲内酯提取的最佳工艺条件。
表3-2 正交试验因子水平表
因素Factors
水平A超声震荡时
间/min
B超声功率/w C料液比/mL D提取溶剂
1 40 100 1:20 75%乙醇
2 60 120 1:25 乙酸乙酯
3 80 140 1:30 石油醚
3.2.5 验证实验
精确称取5g穿心莲粉3份，分别加入250mL锥形瓶，按照3.2.4中穿心莲内酯提取的最佳工艺条件各加入150mL乙酸乙酯，设置温度为60℃，超声功率140w，超声震荡60min，依次用真空抽滤，再加入活性炭，30℃水浴10min脱色，抽滤，将滤液标号并用75%乙醇定容至250mL。按照3.2.1中方法测定吸光度，计算穿心莲内酯的相对含量。
3.2.6 穿心莲内酯的鉴别
⑴物理常数：mp.230~232℃。
⑵薄层色谱：
吸附剂：硅胶G-CMC板
展开剂：氯仿-无水乙醇（20:1）
显色剂：碘蒸气
结果：穿心莲内酯在常量下为一个斑点。
⑶显色反应：
①亚硝酰铁氰化钠碱液反应
取穿心莲内酯结晶少许放在放在比色板上（白色具穴磁板）上，加乙醇0.20mL溶解，加0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液2滴，10%氢氧化钠溶液2滴。
②3,5- 二硝基苯甲酸碱液反应（Kedde,s reagent）
取穿心莲内酯结晶少许，于比色板上，加乙醇0.20mL溶解，加3,5-二硝基苯甲酸溶液2滴，呈紫色。
4 结果与讨论
4.1 实验结果
4.1.1 标准曲线绘制
由3.2.2可得，绘制穿心莲内酯标准溶液浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/m、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL，于226nm测定吸光度值，绘制标准曲线。穿心莲内酯与吸光度的回归方程为Y=13.7828x-0.0074，R2=0.9692。见图4-1。
表4-1 不同浓度穿心莲内酯标准液所得吸光度
浓度（mg/ml) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
吸光值(Abs) 0.098 0.145 0.366 0.480 0.585 0.676
图4-1 穿心莲内酯标准曲线图
4.1.2 以超声震荡时间为单因素变量
表4-2 不同超声振荡时间对穿心莲内酯提取的影响
时间（time）20min 40min 60min 80min 100min 120min
吸光值(Abs) 0.564 0.922 0.821 0.795 0.445 0.148
图4-2 不同超声振荡时间对穿心莲内酯提取的影响
由表格和图片可知，超声震荡时间在40、60、80min时穿心莲内酯提取浓度较高，在40min 时达到最高。
4.1.3 以超声功率为单因素变量
表4-3 不同超声功率对穿心莲内酯提取的影响
超声功率80w 100w 120w 140w 160w 180w
吸光值(Abs) 0.356 0.442 0.478 0.635 0.410 0.388
图4-3 不同超声功率对穿心莲内酯提取的影响
由表格和图片可知，超声功率在100、120、140w时穿心莲内含子提取浓度较高，在140w 时是最高的。
4.1.4 以料液比为单因素变量
表4-4 不同料液比对穿心莲内酯提取的影响
料液比1:5 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 吸光值(Abs) 0.326 0.418 0.554 0.680 0.875 0.955
图4-4 不同料液比对穿心莲内酯提取的影响
由表格和图片可知，料液比在1:20、1:25、1:30时较高，且一直呈现上升趋势。
4.1.5 以不同溶剂为单因素变量
表4-5 不同溶剂对穿心莲内酯提取的影响
不同溶剂水75%乙醇乙酸乙酯石油醚
吸光值(Abs) 0.301 0.590 0.732 0.655
图4-5 不同溶剂对穿心莲内酯提取的影响
由表格和图片可知，用乙酸乙酯提取时穿心莲内酯浓度最高，75%乙醇和石油醚次之。
4.1.6 以反应温度为单因素变量
表4-6 不同反应温度对穿心莲内酯提取的影响
反应温度40℃45℃50℃55℃60℃65℃
吸光值(Abs) 0.130 0.336 0.499 0.650 0.840 0.932
图4-6 不同温度对穿心莲内酯提取的影响
由表格和图片可知，温度在65℃时穿心莲内酯提取浓度最高，但是变化趋势趋向平稳，在55、60℃时幅度较大，温度升高可以提高物质的溶解度，分子运动越剧烈，物质扩散越快，相应的提取速度也会加快，但温度过高会使穿心莲内酯受热分解，故提取的最佳温度为60℃。
4.1.7 正交试验结果
在单因素试验基础上，对超声振荡时间(A)、超声功率(B)、料液比(C)、提取溶剂(D)4个参数进行了L9(34)的正交试验，结果见表4-7。
表4-7 正交试验方案与结果
试验号A(min) B(w) C D 吸光度
1 1 1 1 1 0.395
2 1 2 2 2 0.736
3 1 3 3 3 0.520
4 2 1 2 3 0.423
5 2 2 3 1 0.714
6 2 3 1 2 0.821
7 3 1 3 2 0.660
8 3 2 1 3 0.485
9 3 3 2 1 0.599
K1 1.651 1.478 1.701 1.708
K2 1.958 1.935 1.758 2.217
K3 1.744 1.940 1.894 1.428
k1 0.550 0.493 0.567 0.569
k2 0.653 0.645 0.586 0.739
k3 0.581 0.647 0.631 0.476
R 0.103 0.154 0.064 0.260
主次D> B >A>C
优组合A2B3C3D2
4.1.8 验证实验结果
按照穿心莲内酯的最佳提取工艺做了三组平行试验，得出如下数据。
表4-8 验证试验结果
吸光值(Abs) 平均吸光值(Abs)
1 0.941
2 0.960
0.951
3 0.953
4.2 实验结果讨论
4.2.1 单因素实验结果讨论
⑴超声振荡时间的不同
在其他条件相同的情况下，改变超声振荡的时间，设置6个变量，分别是20、40、60、80、100、120min，提取液抽滤后经配制，测得不同吸光值。通过图4-2和表4-2可以看出吸光值是先按上升后又下降，中间一段趋于平稳状态，且当60min和80min时吸光度非常接近。可以说明在40～60min时提取效率较好，在此基础上延长时间不能提高提取率，同时考虑到节约能源等方面，我们选择的最佳时间是40min。
⑵超声功率不同
通过使用超声功率分别为80、100、120、140、160、180w，其它条件相同，提取液抽滤后经配制，测得不同吸光值。通过图4-3和表4-3可以看出在80～140w这一区域中，吸光度一直是上升趋势，在140w处达到最高后吸光度下降得非常快，从数据可以看出，在140w时吸光度是0.635，而160w时却减到0.410。所以我们的结论是选择的功率应在140w以内。
⑶料液比不同
75%的乙醇能较好的提取穿心莲内酯。此处通过改变75%乙醇的是使用量来确定最佳的料液比。选择了料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，其他条件不变，超声振荡后提取液抽滤后经配制，测得不同吸光值，结果可见表4-4和图4-4。我们可以看出，图中吸光度值一直是上升趋势，在1:30时达到最高。另外，在1:15和1:20之间的斜率是最大的，之后上升的趋势逐渐减小，说明料液比再增大时吸光度值的增加将不会太明显。考虑到节约能源方面，我们尽量不要采用太大的料液比。
⑷不同溶剂
在其他条件相同的情况下，改变提取溶剂，分别采用了水、75%乙醇、乙酸乙酯和石油醚来提取穿心莲内酯。提取液经配制后测得吸光度见表4-5和图4-5。图4-5中可以看出乙酸乙酯的提取浓度时最高的，可以达到0.732，其次是石油醚，最低的是水，仅有0.590而已。穿心莲内酯是二萜内酯类化合物，由相似相容原理可知，内酯类易溶于有机溶剂，水是无机物，提取效果所以最差。
⑸反应温度不同
在其他条件相同的情况下，改变反应温度，分别设置40、45、50、55、60、65℃，反应结束后提取液经配制测得相应吸光度值，结果见表4-6和图4-6。由图表可以看出，在温度增大的同时，吸光度值也呈增大趋势，在55～60℃之间的斜率最大，60～65℃时已经趋向平稳，再增大反应温度对提取率的影响不显著。内酯类在高温下易开环分解，对热不稳定，温度太高可能导致提取的穿心莲内酯反倒更少，所以提取的最佳反应温度是60℃。
4.2.2 正交实验结果讨论
由表4-7可以看出四个因素的极差中D的极差最大，B次之并且与A接近，C的极差最小。
极差R大，意味着它的三个水平对于实验结果造成的影响越大，从而可按极差的大小决定因素的主次顺序：D > B >A > C。不同溶剂是影响穿心莲内酯提取的最主要因素，达到极显著水平，表中k2>k1> k3，因而选择D2；超声功率对穿心莲内酯的提取的也有较大影响极差，且k3> k2> k1，故选择B3；超声振荡时间的极差与超声功率相近，R=0.103，且k2 >k3 > k1，故选择A3；料液比的极差很小，故这个因素是不显著的次要因素，对穿心莲内酯提取的影响也有，但程度不大。料液比的k3> k2> k1，故选择C3。综上所述，根据实验结果与分析，确定了穿心莲内酯提取的最佳工艺条件为A2B3C3D2，即用乙酸乙酯为提取溶剂，且料液比为1:30，在功率140w、温度60℃时提取60min。经过验证实验，可以得出在最佳提取工艺时的平均吸光度为0.951。
5 总结与展望
5.1 总结
⑴对穿心莲内酯对照品溶液进行最大吸收波长扫描，后得出穿心莲内酯的最大吸收波长在226nm处，与参考文献[17]比较后结果相同，所以选择此波长为穿心莲内酯的测试波长。制作穿心莲内酯标准液进行比色，测得相应吸光值后绘制标准曲线，计算的回归方程为：
Y=13.7828x-0.0074，R2=0.9692。
⑵通过单因素试验，考虑穿心莲内酯的性质及稳定性，选定了反应温度60℃是提取穿心莲内酯的最佳温度。同时，对超声振荡时间的试验中，选定了40、60、80min作为正交的三个水平；对超声功率的试验中，选定了100、120、140w作为参考；在料液比的试验中，选定了1:20,、1:25、1:30作为参考；在不同溶剂的单因素试验中，选中了75%乙醇、乙酸乙酯、石油醚作为提取溶剂。活性炭水浴时会吸附穿心莲内酯，造成一定的损失，因此水浴时间不能太长。
⑶在单因素实验的基础上进行了正交实验，通过极差的对比等确定了穿心莲内酯的最佳提取工艺条件是用乙酸乙酯为提取溶剂，且料液比为1:30，在功率140w、温度60℃时提取60min，在此条件下穿心莲内酯提取液测得的平均吸光度为0.951。
5.2 展望
穿心莲是一味常用中药，在我国分布广泛。近年来，对穿心莲的药用价值的研究日益增多，在临床方面的研究进展迅速。穿心莲中化学成分众多，各个成分又有相对治疗的病症。例如，内毒素血症在中暑病理生理过程中发挥了重要作用，药理学研究已经证实穿心莲具有拮抗内毒素的作用, 而新穿心莲内酯在其中起到了不可忽视的作用[18,19]，故新穿心莲内酯是治疗中暑的有效药物[20]。以前研究[21,22]表明其所含成分14-脱氧穿心莲内酯（DA）和14-脱氧-11,12- 二去氢穿心莲内酯（DDA）对麻醉大鼠有降压作用。
穿心莲内酯具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用和免疫作用、保肝利丹、解热抗炎等作用。穿心莲内酯资源广泛, 在动物体内吸收快、药效长、生物利用度高, 且无明显的毒副作用, 与其他药物配伍治疗有更好的效果,可制成多种剂型，如穿心莲内酯胶囊、穿心莲滴丸、穿心莲内
酯分散片、穿心莲注射液等具有较大的临床应用价值。穿心莲内酯结构复杂, 人工合成困难, 国内均从植物中提取。提取分离方法多样，有醇提法、水提法、NaOH水溶液提取法、微波和超声波辅助提取法。利用Michael 加成、羟基上的反应、分子内环化、分子内酯环化等反应进行结构修饰取得了新的研究进展[23]。随着对其药理作用及其机制以及结构修饰的深入研究, 将极大地促进穿心莲内酯类新药的研究和开发。
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