闪烁体荧光时间特性的观测与分析
实验目的：
1.学会正确实用数字示波器来分析闪烁计数器的输出脉冲波形。
2.学会根据记录的波形了解闪烁体的时间特性 实验原理：（见实验预习） 实验内容：
1.观测闪烁体荧光时间特性对输出波形的影响，辨认快慢闪烁体。
2.观测光电倍增管输出回路的时间常数对输出脉冲波形的影响。
3.用δ光源测定光电倍增管的响应函数*（t ）。
4.分析记录不同闪烁体的荧光衰减时间常数τs 。 实验仪器和样品：
1.记录单词脉冲的数字存储示波器。
2.可切换闪烁体的闪烁计数器系统，包括高压电源。
3.切伦科夫辐射体（有机玻璃），NaI （Tl ），CsI （Tl ），塑料闪烁体，氟化铈晶体（CeF3）。 实验数据：
共测量了6种材料的曲线，每种测量了10次。6种材料分别为：BGO, BaF2, NaI, CsI, 塑料和有机玻璃。
数据量太大，这里不予显示。 数据处理：
对每种材料，先将每次的数据除以maximum ，进行归一，然后再取10次的平均值。并将电压-时间图作出。
本实验，我采用了2种方案进行拟合：
1）第一种方案：利用简易公式，即在RC<<τ的情况下，有近似的函数，
t (t t )/0Q R U(t)e -+τ
≈
τ （1）
进行拟合，选择的是origin7.0中的函数y = A*( 1 - exp(-k*(x-xc)) )，由此可直接拟出k 的值，进而求出衰减时间τ。
2）第二种方案：利用书中的方法，使用公式
s
t/t/RC 0s
Q R U(t)(e e )-τ-≈
-τ （2）
以NaI 为参考，假定τs = 250ns ，拟合RC ，再拟合其他材料的衰减时间。在用origin7.0中拟合的并不是很好，所以作为第二种方案进行比较。
一．利用公式（1） NaI 的相关拟合：
先做出电压幅值随时间的整体变化图像，
取衰减部分进行拟合，以函数y = A*( 1 - exp(-k*(x-xc)) )进行拟合，得出如下图像：
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
t/ns
V/|Vm|NaI 电压时间曲线
可以从数据曲线上得出k ≈0.0037，故NaI 的衰减时间约为：τ≈1/k= 270.270（ns ）。
BaF2的相关拟合：
先做出电压幅值随时间的整体变化图像，
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
t/ns
V/|Vm|
NaI 电压时间曲线（衰减部分）
取衰减部分进行拟合，以函数y = A*( 1 - exp(-k*(x-xc)) )进行拟合，得出如下图像：
可以从数据曲线上得出k ≈0.00221，故BaF2的衰减时间约为：τ≈1/k= 452.489（ns ）。
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
t/ns
V/|Vm|FaF2电压时间曲线
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
V/|Vm|
BaF2电压时间曲线（衰减部分）
t/ns
BGO 的相关拟合：
先做出电压幅值随时间的整体变化图像，
取衰减部分进行拟合，以函数y = A*( 1 - exp(-k*(x-xc)) )进行拟合，得出如下图像：
-3000
-2000-10000100020003000
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
V/Vm
t/ns
BGO 电压时间曲线
500
1000
1500
2000
2500
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
V/|Vm|
BGO 电压时间曲线（衰减部分）
可以从数据曲线上得出k ≈0.00336，故BGO 的衰减时间约为：τ≈1/k= 297.62（ns ）。 综上得出的三种材料的衰减时间为： NaI 的衰减时间约为：τ≈270.270（ns ） BaF2的衰减时间约为：τ≈452.489（ns ） BGO 的衰减时间约为：τ≈297.62（ns ）
二、利用公式（2）
首先假定NaI 的衰减时间为250ns ，然后开始拟合其中的RC 的值。 在origin7.0中，我定义了拟合用的函数，对NaI 来说，函数为： u=P1*(exp(-t/250)-exp(-t/P2))/250
其中，u 为电压幅值，P1为总系数，而P2为RC 所拟合的值。 拟合曲线如下：
由图读出，RC ≈ 30.55737（ns ）
利用此RC 的值，拟合BGO 和BaF2，此时所用的函数为： u=P1*(exp(-t/P2)-exp(-t/30.55737))/P2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
V/|Vm|
NaI 电压时间曲线（衰减部分）
t/ns
其中P1为总的系数，而P2为所要拟合的衰减时间常数。
对于BGO ， 有如下曲线：
可以看到，只有衰减的后半部分可以和点比较吻合，
由此所拟合出的BGO 的衰减时间约为：τ≈ 243.428（ns ）
这个数据与简易拟合差距很大，我认为有两方面原因，一是NaI 用250ns 所拟合出的RC 会有较大误差，二是这个所拟合出的曲线前半部分没有吻合，所以也会带来较大误差。
对于BaF2， 有如下曲线：
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
BGO 电压时间曲线（衰减部分）
t/ns
V/|Vm|
可以看到，BaF2出现的问题和BGO 很相似，原因也类似。 由此所拟合出的BaF2的衰减时间约为：τ≈399.272（ns ）
故用方案二所拟合出的RC ，以及衰减时间为：
RC ≈30.55737（ns ）
BGO 的衰减时间约为：τ≈243.428（ns ） BaF2的衰减时间约为：τ≈399.272（ns ） 其中认定NaI 的衰减时间为250ns
另外，由书中的假定，R=1M Ω，以及拟合的RC 时间，可以得出分布电容： C ≈30.55737/1000000=30.55737（μF ）
综上所述，与实验室给定的几种数据进行比较，可以认为，总体上来说，NaI 和BGO 的数据
较为精确，而BaF2的数据误差稍大。
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
t/ns
V/|Vm|
BaF2电压时间曲线（衰减部分）
思考题:
1.宇宙线μ子通过有机玻璃样品和通过闪烁体引起的光信号的形成机理有什么本质区别？答：无机晶体是绝缘体，禁带比半导体宽，入射粒子除了由于电离而导带中产生电子和在满带中产生空穴之外，还有因激发而产生的激子。入射粒子通过后，产生激子，电子和空穴，都能自由经晶格很快的运动。加入某种合适杂质，成为发光中心。
无极晶体原子间联系很紧密而形成能带结构，是粒子晶体，有机晶体为分子晶体。
不过分子内原子之间相互作用仍较强，因此有机晶体的发光主要是由于分子自己的能量状态改变而引起的，为分子固有性质，不需要像无机晶体那样加入激活剂。
2.为什么有机玻璃样品给出的发光信号可以看成一种近似的δ光源。
答：为切伦科夫辐射，辐射时间实际上就是等于粒子穿过辐射介质的时间t=l/v。没有时间惯性，一般小于10e-9s，所以衰减时间非常短，可以近似认为是δ光源。
时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术： 1、时间分辨原理： 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 2、时间分辨原子标记物的特点： ●发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 ●长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 ●半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 原子标记与大分子标记物的对比 3、波长分辨： ●标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱， 有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。 ●激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的 干扰，增强测量的特异性。
4、时间分辨： ●标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧 光物质对检测结果的影响。 ●每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值， 有利于提高检测的准确性。 时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！ RIA（放免） ●放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消， 如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。 ●125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。 ●由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准 曲线无法保存备用。 ELESA（酶免） ●灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 ●酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的 TRF技术与电化学发光的比较
几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测 量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 化学发光免疫分析技术（CLIA） 各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测等各种抗原、抗体和半抗原 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛 1.多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。 2.病原体抗原/抗体 3.病毒性肝炎标志物 4.肿瘤相关抗原 5.药物 6.核酸 优缺点
荧光物质的荧光特性及其定量分析 指导老师：吴莹 实验人：王壮 同组实验：戈畅、陆潇 实验时间：2016.5.30 一．实验目的 1．测量荧光物质的激发光谱和荧光光谱； 2．掌握荧光物质的定量测定方法； 3．熟悉F-2500（日立）荧光光谱仪结构及操作。 二．实验原理 （一）荧光的产生过程 荧光是发射光。物质分子或原子在一定条件下吸收辐射能而被激发到较高电子能态后，在返回基态的过程中将以不同的方式释放能量。如在分子吸收分光光度法中，受激分子以热能的形式释放多余的能量，测量的是物质对辐射的吸收，属吸收光谱法；而发光分析是受激分子或原子以发射辐射的形式释放能量，测量的是物质分子或原子自身发射辐射的强度，属发射光谱法。 激发光谱曲线：固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。 荧光（发射）光谱曲线：固定激发光波长（选最大激发波长），化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光，所以发射光谱的形状与激发波长无关。 （二）荧光的产生与分子结构的关系 1．跃迁类型：* ππ →的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生； 2．共轭效应：提高共轭度有利于 增加荧光效率并产生红移； 3．刚性平面结构：可降低分子振 动，减少与溶剂的相互作用，故 具有很强的荧光。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的 荧光，酚酞却没有； 4．取代基效应：芳环上有供电基， 使荧光增强。 （三）荧光分析 荧光分析可应用于物质的定性及定量，由于物质结构不同，所吸收的紫外—可见光波长不同，所发射荧光波长也不同，利用这个性质可鉴别物质。在一定频率和一定强度的激发光照射下，荧光物质（稀溶液体系）所产生的荧光强度与浓度呈线性关系，可进行定量分析。 （四）荧光光谱仪
1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为
有机荧光物质 有机荧光物质是一类具有特殊光学性能的化合物, 它们能吸收特定频率的光, 并发射出低频率(较长波长) 的荧光释放所吸收的能量。某些有机化合物在紫外和短波长的可见光的激发下能发出荧光, 产生可见光谱中鲜艳的颜色, 这类物质称为日光型荧光染、颜料。 荧光的产生 有色化合物分子通常处于能量最低的状态,称为基态。吸收紫外或可见光的能量后, 电子跃迁至高能量轨道激发态。分子可有多个激发态。处于激发态的分子通过振动弛豫、内部转换等过程跃迁到分子的最低激发态的最低振动能级, 再发生辐射跃迁回到基态, 放出光子, 产生荧光. 有机染料分子的第一激发态与基态的能差是一定的, 因而荧光波长不随激发光波长的改变而发生变化。分子激发过程中吸收的能量一般高于荧光辐射释放的能量, 二者之差以热的形式损耗,因此荧光波长比激发光的长, 其差通常为50～ 70nm , 当有机化合物分子内可以形成氢键时, 则增至150～ 250 nm , 这一规律称为Stoke’s 位移。荧光的强度受许多因素的制约, 如激发光源能量、吸收强度、量子效率等。量子效率也称量子收率, 是指荧光物体分子发射的光量子数与吸收的光量子数之比。其大小是由分子结构决定的, 而与激发光源的能量无关。事实证明, 荧光物质分子一般都含有发射荧光的基团(称为荧光团) 以及能使吸收波长改变并伴随荧光增强的助色团。 分子结构与荧光特性： 1．共轭系统对荧光的影响 通常增加分子P 电子共轭体系长度可提高荧光效率并使荧光红移。空间位阻效应的存在能破坏分子的共平面性及共轭程度, 从而使荧光减弱。立体异构对荧光强度也有影响, 如反式二苯乙烯是强荧光型的, 顺式二苯乙烯由于位阻效应的存在则无荧光特性。 2．取代基对荧光的影响 大部分有机荧光物质分子中带有芳环, 芳环上引入取代基可改变荧光的光量子收率和发射波长。通常邻、对位定位基可使荧光增强, 间位定位基使荧光减弱, 硝基、偶氮基能阻止荧光的产生。分子两端分别引入给电性和吸电性基团可使染料发生红移并伴随荧光的增强。卤原子的存在对荧光不利。氨基的引入可使荧光增强。 3．分子环构化对荧光的影响 染料分子的闭环对荧光的产生非常有利, 可以增加分子共平面性和刚性而使荧光增强。许多本身无荧光或荧光很弱的化合物与金属螯合产生的具有环状结构的螯合物显示较强荧光。分子内含有羟基并可形成分子内氢键多数情况下能使荧光强度提高。 熔融状态下使树脂着色是制备热塑型树脂固溶体荧光颜料的常用方法。向熔融的对甲苯磺酰胺中加入甲醛, 再与胺发生缩合反应, 加入荧光染料, 于150～ 175 ℃使树脂着色。冷却成“玻璃”状,粉碎, 研磨, 可得颜料。热固型树脂固溶体荧光颜料也可用类似方法制得。此外, 将高度分散的树脂常温染色也是制备荧光颜料的常用方法。 金属表面等离子共振与拉曼散射 金属纳米结构的表面等离子体光学在光学传感、生物标记、以及表面增强拉
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。 （一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序 1 开机 1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。 1.2 打开计算机显示器。 1.3 启动计算机。 1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。 2 开机后准备 1.1 清洗液准备 1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。 1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。 1.2 样品处理器准备 1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。 1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。 1.3 微孔板处理器准备。
1.把各种能量转换为光能的过程主要有两种: 其一是热辐射，其二是发光。 2. 按照激发能的不同可以把发光分类为光致发光（紫外波段发光或真空紫外波段发光激发）、阴极射线发光（电子束流激发）、电离辐射发光（Ｘ射线、γ射线及高能离子激发）、电致发光（直流或交流电场激发）、化学发光（由化学反应能激发）、生物发光（由生物能激发）、摩擦发光（由机械应力激发）等。 3. 发光材料是由作为材料主体的化合物（基质）和选定掺入的少量以至微量的杂质离子（激活剂）所组成，有时还掺入另一种杂质离子作为敏化剂。 4. 荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。 5. 荧光淬灭（fluorescence quenching）又称荧光熄灭或萃灭：是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象。 6.荧光熄灭剂:引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。如，卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
7.荧光淬灭的原因很多，机理也很复杂，主要包括：①因荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的的配位化合物；③溶解氧的存在，使得荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子生在荧光物质分子与猝灭剂分子之间 8.静态猝灭：当基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光猝灭的现象称为静态猝灭。 动态猝灭：如果激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。 动态猝灭：温度增高，猝灭增强； 静态猝灭：温度增高，猝灭降低。转变至三重态；④当荧光物质浓度过大时,会产生自淬灭现象。 9. 量子效率也称量子收率, 是指荧光物体分子发射的光量子数与吸收的光量子数之比。其大小是由分子结构决定的, 而与激发光源的能量无关。 10.拉曼散射光谱是指分子对入射光所产生使其频率发生较大改变的一种光散射现象。激光拉曼光谱主要的一些特点: (l)每种物质(分子)都有自己完全独立的特征谱线，因此每种物质的特征谱线可以表征这一物质。(2)拉曼谱线的线宽大多数较窄，并且往往都是成对出现的，也就是具有完全相同大小的正负频差。这两条谱线在短波一边的叫做反斯托克斯谱线，在长波一边的叫做斯托
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 Newly compiled on November 23, 2020
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,),是将具有高灵敏度的测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、和之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺 (1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinimester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 （CLIA）
初中化学常见物质的颜色归纳总结 固体物质的颜色 白色固体：氧化镁 MgO 、五氧化二磷 P2O5、氧化钙 CaO 、氢氧化钙Ca(OH)2、碳酸钠Na2CO3、碳酸钙CaCO3、氯酸钾KClO3、氯化钾KCl、氢氧化钠NaOH、无水硫酸铜CuSO4等。 黄色固体：硫粉S 红色固体：红磷P、氧化铁Fe2O3、铜Cu 蓝色固体：胆矾CuSO4·5H2O 黑色固体：木炭C、氧化铜CuO、二氧化锰MnO2、四氧化三铁Fe3O4、生铁Fe 绿色固体：碱式碳酸铜Cu2(OH)2CO3 紫黑色固体：高锰酸钾KMnO4 无色固体：冰，干冰，金刚石 银白色固体：银，铁，镁，铝，汞等金属 生成沉淀的颜色 白色沉淀：不溶于水也不溶于稀硝酸：氯化银AgCl、硫酸钡BaSO4。不溶于水但溶于稀硝酸或稀盐酸：氢氧化镁Mg(OH)2、碳酸钙CaCO3、碳酸钡BaCO3 红褐色沉淀：氢氧化铁Fe(OH)3 蓝色沉淀：氢氧化铜 Cu(OH)2 溶液的颜色 蓝色溶液Cu2+：硫酸铜CuSO4、硝酸铜Cu(NO3)2、氯化铜CuCl2等
黄色溶液Fe3+：氯化铁FeCl3、硫酸铁Fe2(SO4)3、硝酸铁Fe(NO3)3等 浅绿色溶液Fe2+：氯化亚铁FeCl2、硫酸亚铁FeSO4、硝酸亚铁Fe(NO3)2等 无色液体：水，双氧水 紫红色溶液：高锰酸钾溶液 紫色溶液：石蕊溶液 气体的颜色 红棕色气体：二氧化氮 黄绿色气体：氯气 无色气体：氧气，氮气，氢气，二氧化碳，一氧化碳，二氧化硫，氯化氢气体等大多数气体。 常见物质的学名、俗名及化学式 ⑴金刚石、石墨：C ⑵水银、汞：Hg (3)生石灰、氧化钙：CaO (4)干冰（固体二氧化碳）：CO2 (5)盐酸、氢氯酸：HCl (6)亚硫酸：H2SO3 (7)氢硫酸：H2S (8)熟石灰、消石灰：Ca(OH)2 (9)苛性钠、火碱、烧碱：NaOH (10)纯碱：Na2CO3碳酸钠晶体、纯碱晶体：Na2CO3·10H2O
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点概念 优缺点
优点 化学发光免疫分析法（CLIA） ?单个样本检测速度快，适合做急诊； ?灵敏度较高； ?自动化程度高； 时间分辨荧光免疫技术（TRFIA） ?发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 ?长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 ?半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 ?荧光寿命长，易于自动化 ?重复性好 ?标准曲线范围宽 ?结果可靠 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的缺点 化学发光免疫分析法（CLIA） ?发光过程短 ?本底较高 ?仪器故障率较高 ?试剂稳定性差 ?检测精度不高 试剂价格高 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA） ?测量方式复杂 ?仪器成本及维护费用高 ?环境及样品中同元素可导致本底干扰等 类型原理及试剂发光类型 化学发光免疫分析（CLIA）用化学发光物质直接标 记抗原或抗体组成 吖啶酯 （acrydinum esters） 时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）* 是用三价稀土离子及其 螯合剂作为示踪物 铕（ Eu3+ ）、铽（ Te3+ ） 及钐（ Sm3+ ）、镝 （ De3+ ） 化学发光与时间分辨荧光方法学比较 化学发光时间分辨荧光发光效率1% 95%
重复检测不可重复可无数次重复 本底噪声干扰大零本底 灵敏级数10 -15 10 -18 标记物大分子化合物原子 标记位点1个/抗体可达20个/抗体 标准曲线稳定2~4周稳定达一年以上 多标记无有，最多可达四个标记科研开发无有 化学发光免疫技术原理图 时间分辨免疫技术原理图
常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA
一、前言 近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。 二、时间分辨荧光免疫分析的原理 时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。 正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。 采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。 三、时间分辨荧光分析的测量方法 （1）解离增强测量法 解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+
时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项
第一节时间分辨反应过程图 TRFIA的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。 下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作. 1、样本的采取和保存 TRFIA测定的样本一般为血清。不能使用含抗凝剂EDTA和柠檬酸的样本，因为二者可以螯合铕，使测定值降低。血清样本可按常规方法采集,溶血和脂血样本可能会影响测值。 样品在2℃-8℃可以保存3-5天，如果需要长期保存，请－20℃保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。不要把样本保存在室温，室温放置48小时可能会导致结果不稳定。 2、试剂的准备 整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行 实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去
离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。 板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。 TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 3、加样 在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。 加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！ 加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。 加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。 注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！ 使用干净的一次性容器配制铕标记物。铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。 4、孵育 在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。 目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的
细胞核常用荧光染料有： 吖丫啶橙(Acridine Orange , AO )、溴化乙锭(Ethidium Bromide , EB )和碘化丙啶(Propidium Iodide , PI ) , DAPI 、Hoechst 染料、EthD III 、7-AAD 、RedDotl 、 2等等。 透膜的染料如下： AO :具有膜通透性，能透过细胞膜，将核 DNA 和RNA 分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。 EB : —种高度灵敏的荧光染色剂，在标准 302nm 处激发出橙红色信号。 DNA 的染色灵敏度要高于EB 和PI ，荧光强度比Hoechst 低，但光稳定性高于Hoechst Hoechst 染料：蓝色一类在显微观察中标记 DNA 的荧光染料，最常见的两种是 Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm 处被激发，在 461nm 处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI 相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更 小。 RedDot 1染料：红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于 Draq?5和Draq?7。RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。 RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。 不透膜的染料，如下: PI 作为红色荧光复染剂首选，PI 经常与Calcein-AM 或者FDA 等荧光探针合用，区分死/活细 EthD III 、7-AAD 、RedDot 2 :不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测; 细胞核荧光染料(PI DAPI Hoechst33342 ) 细胞核荧光染料PI 碘化丙啶(简称PI )是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但 PI 能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜 而将细胞核 染红，PI 在绿色光(540nm 波长)的激发下，会在600nm (红色光)处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA 结合的PI 发出的荧光，与未结合的PI 相比，强 度会增强 20-30 倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in waterlOmL 碘化丙啶英文名： Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39外观：红棕SF 末应用：DNA 染色染色原理： 碘化 丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在 嵌入双链DNA 后释放红色荧光。尽管PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。 PI 经常被用来与 Calcein-AM 或者FDA 等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 光谱性质：PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm 。染色 过程：1.用PBS 或适当的缓冲液制备10?50小 的PI 溶液。a) 2.将1/10培养基体积的PI 溶液加入到细胞培养基中。b) 3 .在37 C 培养细胞10-20分 钟。4.用PBS 或合适的缓冲液洗涤细胞两次。 5.用535nm 激发波长，615nm 发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。 a)由于PI 可能具有致癌性， 请小心操作。b)也可以用1/10浓度的PI 缓冲液代替培养基。 保存条件：4C 避光保存 对人体有刺激性，请注意适当防护 DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA 中大部分A , T 碱基相互结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为 DAPI :蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与 DNA 结合后可以产生比 DAPI 自身强20多倍的荧光，而与单链DNA 结合无荧光的增强。 DAPI 对双链 PI :不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
第24卷,第5期 光谱学与光谱分析Vol 124,No 15,pp5962599 2004年5月 Spectroscopy and S pectral Analysis May ,2004 时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究 郭周义,田 振,贾雅丽 华南师范大学激光生命科学研究所,广东广州 510631 摘 要 时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物,标记蛋白质、激素、抗体、核 酸探针或生物活性细胞,待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲合反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后,用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。它之所以能够继放射性同位素标记、酶标记、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法,主要取决于它所用标记物三价稀土离子螯合物独一无二的物理及化学性质。主要报导了对使用的长寿 命荧光团Eu 3+ 螯合物的光谱研究结果,时间分辨技术及荧光增强技术的原理。实验表明:选择336～337nm 的激发波长,有利于Eu 3+ 的配位二酮体的激发及能量转移。 主题词 免疫分析;荧光增强技术;时间分辨光谱技术;Eu 3+螯合物中图分类号:O657132 文献标识码:A 文章编号:100020593(2004)0520596204 收稿日期:2003203226,修订日期:2003206228 基金项目:广东省科技攻关重点项目(2002C60113);广州市天河区科技计划项目(2002XGP06);广东省自然科学基金项目(No 1015012, No.031518);教育部科学技术研究重点项目(No 102113)资助 作者简介:郭周义,1965年生,华南师范大学激光生命科学研究所教授,博士生导师 引 言 最近几年发展起来的时间分辨荧光免疫分析方法(TR 2 FIA )是超微量免疫检定法的一大突破。由于使用了时间分辨光谱技术和荧光增强技术,使荧光免疫分析的灵敏度得到了极大提高。1983年Petterson [1]和Eskola [2]首先将时间分辨荧光光谱技术应用于免疫分析的研究中。目前,TRFIA 的最低检出值已达10-19mol ?well -1,远远超过酶标记免疫分析法(EIA )的10-9mol ?well -1,放射免疫分析法(RIA )的10-15mol ?well -1和发光免疫分析法(L IA )的10-15mol ?L -1。 稀土离子是金属离子,若用来直接标记抗原、抗体,标记率很低,一般使用含有双功能基团的螯合剂,形成稀土离子2螯合剂2抗原(或抗体)的螯合物。稀土离子的荧光,不仅与自身的能级结构有关,而且与螯合剂的性质有关。螯合物不同,稀土离子的激发光和发射光也会有所不同。 1 稀土离子的吸收光谱 镧系离子的电子排布为 1s 2 2s 22p 63s 23p 63d 104s 24p 64d 104f n 5s 25p 6(n =0～14),其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态,其 基组态是4f n (n =0～14),下一个激发态是4f n -15d [3]。 稀土离子吸收光谱[4]的产生可归因于三种情况。111 f —f 跃迁光谱 指f n 组态内,不同J 能级间跃迁所产生的光谱。它的特点是: (1)发光弱。这主要是因为f —f 跃迁是宇称选择规则禁 阻的。虽然在溶液和固态化合物中,由于配体场微扰,也能 观察到相应的光谱,但相对于d —d 跃迁来说,也是相当弱的。 (2)类线性的光谱。谱带的尖锐原因是处于内层的4f 电子受到5s 2,5p 6电子的屏蔽,受环境的影响较小。 (3)谱带的范围较广。在近紫外,可见区和近红外区内 都能得到稀土离子(Ⅲ )的光谱。112 f —d 跃迁光谱 4f n 向4f n -15d 的跃迁是组态间的跃迁。这种跃迁是宇称选择规则允许的,因而4f —5d 的跃迁是较强的;三价离子的吸收带一般在紫外区出现;由于5d 能级易受周围离子的配体场影响,相对于f —f 跃迁来说,谱带变宽。113 电荷跃迁光谱 稀土离子的电荷跃迁光谱,是指配体向金属发生电荷跃迁而产生的光谱,是电荷密度从配体的分子轨道向金属离子轨道进行重新分配的结果。镧系络合物能否出现电荷跃迁带取决于配体和金属离子的氧化还原性。一般在易氧化的配体 和易还原为低价离子(Sm 3+,Eu 3+ ,Te 3+,Yb 3+和Ce 4+)的络合物光谱中易见到电荷跃迁带。谱带的特点是有较强的强度和较宽的宽度。