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东南大学
生物科学与医学工程学院
实习报告
实习单位江苏省肿瘤防治研究所
暨江苏省肿瘤医院
实习时间 2009 年 07 月 10 日至
2009 年 09 月 06 日止学生姓名
学号
指导教师(单位)
指导教师(学校)
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目录
说明 (3)
1 前言 (4)
1.1实习背景 (4)
1.2实习环境 (4)
2 实习内容......................................................5-18 2.1实习过程 (5)
2.2实习内容………………………………………………………5-18
3 总结............................................................19-22 3.1实习小结 (19)
3.2实习体会………………………………………………………20-22
4 附录............................................................23-31 附录1（染色体分组方法） (23)
附录2（正常人体染色体分析结果）…………………………24-29附录3（卵巢癌病人染色体核型分析数据）…………………30-31
谢辞 (32)
学生实习鉴定 (33)
实习生评价表 (34)
学校评语 (35)
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说明
1．实习结束之后，每位学生都必须认真撰写《实习报告》。通过撰写实习报告，系统地回顾和总结实习的全过程，将实践性教学的感性认识升华到一定的理论高度，从而提高实习教学效果。实习报告的质量反映了实习的质量，它是实习成绩评定的主要依据之一。没有在规定时间前递交实习报告者将不能参加实习成绩评定。
2．实习报告要求条理清晰，内容详尽，数据准确。
3．实习报告包含“学生实习鉴定”表，由实习单位填写。中英文2个版本任选一份填写即可。
4．“前言”部分。“实习背景”简介实习目的、学院有关实习的要求、通过何种方式到此单位实习、实习起止时间等内容；“实习环境”包括实习单位全称、地址、实习单位性质、规模、简介、所含部门、部门主要工作等内容。
5．“实习内容”部分。属报告的主要部分。“实习过程”概述实习各阶段所从事的主要工作等；“实习内容”选择某个阶段的工作进行详细描述。6．“总结”部分。“实习体会”包括本次实习的收获、对以后学习工作的看法等。
7．“谢辞”部分。主要指对实习单位、实习单位指导教师，以及合作者的感谢。
8．“学校评语”由学院实习负责教师统一填写。
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1 前言
1.1 实习背景
应院系对06级学生的暑期实习要求，本着提高个人处理工作事宜和人际关系能力的想法，经由江苏省肿瘤医院工作人员李玫老师的引荐，本人于2009年7月10日至09月06日在江苏省肿瘤医院进行了为期八周的暑期实习。
1.2 实习环境
江苏省肿瘤防治研究所暨江苏省肿瘤医院，前身系1960年建院的江苏医院。1969年江苏医院整体搬迁盱眙县后，原址由南京医学院第一附属医院接管创建肿瘤科。1973年12月正式成立江苏省肿瘤防治研究所，1991年增挂江苏省肿瘤医院牌子。该院是省内惟一的省属肿瘤专科三级甲等医院，是全省恶性肿瘤防、治、研、教技术指导中心。
医院拥有固定资产1.4亿元。根据省级肿瘤专科医院特点，先后引进用于临床诊断、治疗的全身多排螺旋CT、E-CT、MRI、DSA、CR医学影像诊断系统、医用高能电子直线加速器、后装治疗机、钴治疗机、多叶光栏（MLC）、三维TPS、高能超声聚焦刀、冷冻治疗系统和热疗系统等；用于基础实验研究的流式细胞仪、变性高效液相色谱仪、多规格基因扩增仪包括适时定量扩增仪、大型液氮罐沉水系统等国内外先进的大型仪器设备。这些设备的应用大大提高了恶性肿瘤的诊断、治疗和科研水平。
江苏省肿瘤医院设置职能部门20个，临床诊疗科室18个，基础医学研究室5个。肿瘤诊治学科齐全，肿瘤放疗、化疗、肿瘤普通外科、肿瘤胸外科四大学科均为省级临床重点专科。其中放疗科为“135工程”重点学科，是江苏省放射治疗中心。医院作为国家药物临床试验机构之一，在肿瘤药物临床试验方面有一定优势,为近百余种新药进行了临床研究。
研究高层次拓展，开展了具有高科技水平的肿瘤分子生物学和癌基因研究。《基因芯片的开发和应用研究》参与国家863攻关项目。《江苏省消化道肿瘤的病因学研究》获日本文部省项目资助，《遗传性大肠癌的分子生物学研究》获国家留学基金管理委员会和德国学术交流中心资助。开展的肿瘤遗传性突变、体细胞突变的分析和基因诊断在全国同类研究中处于前列。
分子生物学研究室拥有国内最大肿瘤标本库、DNA库和血清库。肿瘤遗传与分子生物学中心实验室现阶段研究项目主要针对肿瘤病人抑癌基因的突变及遗传易感性分析，研究基因包括MLH1、MSH2、APC、MYH、BRCA1、BRCA2 及MTHFR等。拥用省内最大的肿瘤标本库。配有流式细胞器、DNA序列分析仪、变性高效液相色谱仪、凝胶成像系统等仪器设备。
本次实习主要是在分子生物学研究室进行，对该实验室的研究方向以及一些基本的实验操作进行了系统学习。
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2 实习内容
2.1 实习过程
2009年6月16日提交实习申请；
2009年7月10日人事处报告；
2009年7月13日—7月20日：分子生物学实验室的参观了解，文献查阅，流式细胞术检测实验的见习，参与了医院的早会。(指导老师：陈森青、沈宗丽、吴晓柳、戴立玲)；
2009年7月27日—9月6日：综合实验
(第一阶段：细胞水平7月27日——8月12日)老师讲述肿瘤遗传学分子生物学中心实验室以及遗传学研究室的主要研究内容、技术平台，对于该科室的研究有了整体的了解；重点是核型分析实验的实际操作；实验期间兼有文献翻译等等内容。（指导老师：马国建）
(第二阶段：分子水平8月13日-9月6日)试剂盒提取实验、DNA甲基化实验、以及高压液相色谱分析仪的使用学习。(指导老师：马国建、李金田、张元颖)。
2.2 实习内容
1、对于实验室的了解
本实验室主要是进行细胞水平的研究和分子水平的研究。其中分子水平的研究主要是对于细胞形态进行的组织学研究，包括可靠的诊断学研究，病理学和影像学的研究，所采用的方法主要是荧光原位杂交技术。分子水平的研究主要是在基因的，是更加先进的研究方法。而本科室的主要研究内容有：基因表达、基因遗传多态性以及表遗传学（甲基化表达）科室的技术平台有：PCR、遗传多态性（高压液相色谱分析）、测序分析以及MSP。
2、流式细胞术检测（Flow Cytometry）
1）实验原理：
除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。
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信号的产生、转换和传输在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360。立体角发射，产生散射光和荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管(PMT)。从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器：线性放大器和对数放大器。在免疫学测量中常使用对数放大器。
放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。
流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。
数据的显示和分析数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由x、Y二方向组成的二维平面图。横座标x是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”(Channel No．)来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。
除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。
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2）实验目的：
在本实验室进行流式细胞术检测的目的是通过对于免疫细胞的常规检测，对肿瘤病人各个化疗阶段的情况进行检测对比，从而对于其病情进行评价以确定下一阶段的治疗方案。采用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进行检测。这方面的临床应用有：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。
3）实验步骤：
1、取病人血液作为样本。经过胰酶等处理。标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为
40μmol/L，并同时采用机械分散法。
2、本次检测采用的显示方式是二维点图：
全血流式术XCF-FCM图
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4）实验记录（免疫常规记录）以及结果分析
测量对象测量因素测得值正常细胞参考值（%）T细胞CD3+ 64.2±10.4
CD4+ 35.1±8.1
CD8+ 24.7±6.0
CD4/CD8 1.44±0.41
NK 细胞CD3-/CD(15+16)+) 21.25±9.20
B细胞CD19+ 8.63±3.44
对于消化道癌、肝癌、肺癌来说，CD8+的会超过常人，其他数值均低于正常值。
流式细胞术在肿瘤学的作用很广。对于各种肿瘤有其对应的方法。比如对DNA含量进行检测，对DNA倍体和S期比例可以对于一些早期癌症的治疗进行指导。
本次实验通过对于几种不同的癌症病人的免疫常规检测，对他们的癌症化疗效果作出了评价，并且对于下一步的化疗进行了指导。
3、核型分析实验
A、实验总体了解
1、器材：
超净台、培养箱、离心机、酒精灯、冰盘、培养瓶、吸管、移液管、橡皮盖及玻片。
消毒过程：培养瓶、吸管、移液管（泡酸洗净然后高压处理）橡皮制品（肥皂粉洗净后高压）玻片（先泡酸然后反复冲洗，最后使用无菌蒸馏水）
2、试剂：
1640培养液（已配制好）
小牛血清（在无菌条件下由小牛颈动脉采血后分离血清，置于56oC水浴中30min灭活，置于4oC冰箱中保存）
PHA（植物血凝素；淋巴细胞只有在PHA的刺激下才能进入有丝分裂，其中的粘多糖成分刺激分裂，而蛋白质则起凝集作用）
秋水仙素（本实验选用秋水仙碱）
蒸馏水
低渗液（0.075M KCl溶液）
3、制片过程：
主要分为三步：培养（短期）——制片——观察（经验+经历）对23对染色体进行综述实验中心思想：无菌
a、消毒灭菌无菌：
通风橱、消毒保存一个星期
b、手法问题：
枪头、玻璃器皿过火灭菌；37℃培养（短期培养无需CO2液氧）每24h摇匀一次，观察上层培养液是否清亮（未粉红渐渐转为黄色）；培养前2小时，加秋水仙碱使其抑制在染色体中期。
过程概述：低渗处理——固定——滴片——过火分散——染色——油镜分析
B、实验的具体操作
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7月21日~ 7月26日——消毒处理溶液配制（实验准备阶段）
1、粗制重铬酸钾加上粗制的硫酸，将玻璃器皿捆绑牢固，泡酸48h。
2、配制酒精：将95%的酒精配制成75%的酒精。
3、超净台清洗工作：将超净台用皂粉水里外清洗一遍后用净水冲干，由内到外擦拭酒精，再打开紫外灯。
4、气息橡皮盖：皂粉水反复洗净，放入恒温箱烘干。
5、基本操作的练习：火焰上方盖瓶塞，注意点：瓶子倾斜45度。
6、工作液的配置：1、PH=6.8 S?rensen缓冲液（KH2PO4 1.15g + Na2HPO4·12H2O 2.95g
溶于250ml蒸馏水中）2、PH=6.4 S?rensen缓冲液（KH2PO4 1.58g + Na2HPO4·12H2O 1.79g 溶于250ml蒸馏水中）3、低渗液（1.4g KCl加水至250ml) 姬母萨染液（Giemsa；原液配制——Giemsa粉末1g+甘油即丙三醇66ml+甲醇66ml；将Giemsa粉剂放入乳钵中，边滴加甲醇边充分研磨，充分溶解后再加入甘油，混合摇匀，用有色玻璃瓶保存，室温放置一周后使用。）
7、高压灭菌
8、紫外分光光度计说明书翻译和学习。
9、玻片清洗冷藏：先将玻片一片一片地放入酸缸中浸泡48h后取出冲洗干净并且烘干后一片一片地泡入酒精中过夜。将泡于酒精中一片一片取出在自来水下冲洗至表面乌夜啼残留为标准。冲洗完毕后再用蒸馏水冲洗一遍后放入盛有蒸馏水的烧杯中放入冰箱制作冰片。
10、在超净台下配制2mg/ml秋水仙碱和4mg/ml的PHA放入冰箱中冷冻备用。
11、染色体分组方法的详细学习（方法记录见附录1）
7月27日~8月6日——正式实验过程
Step1:
于门诊部取男性血样3ml，由静脉采血3ml，注入含有肝素（100单位/ml）的抗凝管内混匀，分成6份，每份吸取0.4ml。
取
1）小牛血清15%×5ml/份×7份=5.25ml
2)1640培养液85%×5ml/份×7份=29.75ml
3)4mg/ml的PHA 25ug/ml×5ml/份×7份÷4000ug/ml=0.219ml.
三者混合后，分别取5ml与0.4ml的血液混合后分装六瓶，盖瓶塞后置于37℃培养箱培养。Step 2:
保证细胞培养的流水式电热恒温培养箱的温度恒为37℃。每隔24h取出分装瓶观察上层培养液，若从粉红渐成微黄，且清亮；下层细胞株上无异常菌落，则说明细胞生长状况良好。轻轻混匀，使上下层混合，继续培养。
Step 3:
在70h后加秋水仙碱，0.6ug/ml×5ml=3ug，原液秋水仙碱是2mg/ml，则每瓶添加1.5ul，为了保证加入的量足够，将枪调至1.7ul。（此时无菌要求不如前面的那么严格，还有两个小时培养终止，细胞生长已过对数期。）
Step 4:
1、将培养瓶中的液体全部转至10ml离心管中，离心沉淀血细胞（3000rpm 5min）
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2、配制固定液：甲醇120ml 冰醋酸40ml
3、在离心管中加入0.075M KCl 直至10ml，静置15min ，离心（2200rpm 5min）——因为细胞已经融入KCl中，不必将所有的均离心下来，所以转速略低于前面的转速。
4、去上清，留下底部的两层沉淀。加固定液，每管2ml预固定，立即混匀。后两管并未一管，加固定液至10ml后混匀，室温下静置30min。2500rpm离心5min。
5、弃上清，加入固定液至10ml，固定20min，2200rpm离心5min。
6、弃上清，开始滴片（从冰箱中取出预先制好的冰片置于冰盘上，滴两滴新鲜固定液后混匀，将混合液滴到冰片上，经火烘烤，注意烘烤速度要快，因为玻片上的甲醇是可燃液体，而且烘烤时间过长会考焦。）斜至晾干。
7、PH=6.8 S?rensen缓冲液与Giemsa染液1：10新鲜配制，待玻片晾干后用染料染色，悬空放置一段时间。
8、蒸馏水冲去多余的染料，10倍镜下找到分裂相，换用100倍油镜仔细观察。
9、进行染色体分析，分析结果如附录2。
本次试验分裂相不多，效果不是很理想。所以改变了一些参数重新进行实验。
改变的条件有：
①小牛血清的量从15%改成20%，PHA改为30ug/ml，血样改成0.5ml每份。
②秋水仙碱改为0.8ug/ml。
③离心沉淀的时候2000rpm 5min。
④其他离心步骤均改为1200rpm 8min。
改善后得到的分裂相比较多。细胞分散效果也比较好。失误之处是低渗的时间不够导致细胞破裂的效果不够理想。
瘤组织制备染色体标本的成功率约为50％，以人肿瘤细胞株为对象制备染色体标本：
短期培养：
1 瘤组织在5mL生长培养基中被剁碎
2 置37℃水浴中温育约21小时
3 加入0.5mL 0.02％的秋水仙胺，于37℃再次温育3小时。
4 进一步使组织剁碎弄细成悬液。
5 将已经剁碎的组织和培养基转入离心管，使在重力的作用下，大的组织碎片沉降下来。
6 吸出上浮的细胞悬液。
7 （同皮肤培养）①吸出培养基，用5mL的Dulbecco A 液冲洗；②加2mL预热的胰蛋白酶——Versene液；③立即吸去胰蛋白酶——Versene,只留下约0.5mL在皿内。④在37℃大约温育10－15mins；⑤看到细胞从盖玻片剥离后，加入5mL生长培养基，以吸管吹吸使细胞悬浮。
2009－8－10 （东大样本Vo1228）
1、离心沉淀；
2、在两管中分别加入4uL的2mg/mL的秋水仙碱,静置两小时；
3、离心沉淀（2000rpm×5min）；
4、加入0.075M KCl，37℃条件下放置20min后再离心（1000rpm×8min）；
5、加入固定液平衡至10mL，静置30min，离心（1000rpm×8min）；