Pharmacok i n eti cs of ga ti floxac i n m esyl a te and ga ti floxac i n i n ra ts in vivo
BU Xiu2yun,ZHANG Guo2liang
(D ept of Phar m acology,School of B asic M edical Sciences,B eijing U niversity,B eijing 100083,China)
Abstract:A i m T o investigate the difference in phar2 macokinetics bet w een gatifl oxacin mesylate(G AT M) and gatifl oxacin(G AT)in S D rats in vivo.M ethod The p las ma concentrati on2ti m e courses of G AT in rats were measured by HP LC method after a single oral dose of G AT M and G AT,and the phar macokinetic pa2 ra meters were esti m ated by p r ogra m3p97s oft w are. Results The results shown that both of G AT M and G AT p las ma concentrati on2ti m e courses were best fitted t o t w o2compart m ent models after a single oral dose (G AT M23143mg?kg-1and G AT20mg?kg-1,re2 s pectively).The maj or average phar macokinetic pa2ra meters of G AT M were as foll w ing:T1
2
β:9113h, AUC:15105mg?L-1?h,C max:4141mg?L-1,and
T max:015h,res pectively.On the other hand,the phar macokinetic para meters of G AT were as foll w ing:
T1
2
β:10170h,AUC:13184mg?L-1?h,C
max
:4125 mg?L-1,T max:015h,res pectively.Conclusi on Un2 der the equi2mole dose conditi on treated as above,both of phar macokinetic characters bet w een G AT M and G AT were not significantly differences in rats
Key words:gatifl oxacin mesylate(G AT M);gatifl oxa2 cin(G AT);HP LC;phar macokinetics
四嗪二甲酰胺抑制肝癌细胞株HepG2增殖
并诱导细胞凋亡的研究
周永列1,吕亚萍2,胡惟孝2,邱莲女1,王文松1,杨忠愚2,刘建栋1
(1.浙江省人民医院中心实验室,浙江杭州 310014;2.浙江工业大学药学院,浙江杭州 310014)
中国图书分类号:R329124;R329125;R329128; R735170212;R97911
文献标识码:A文章编号:1001-1978(2006)06-0754-06摘要:目的 观察四嗪二甲酰胺(ZG DHu21)体外抑制肝癌细胞株HepG2增殖并诱导细胞凋亡作用。方法 将不同浓度的ZG DHu21与HepG2细胞在体外培养,用台盼蓝染色、MTT 法、5′2溴22′脱氧尿苷(B rdu)2E L I S A法观察ZG DHu21对HepG2细胞增殖的抑制作用;用细胞形态学、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析、Annexin2V/P I双标记、Ho2 echst33258荧光染色和E L I S A法测定DNA片段等技术检测细胞凋亡。结果 ZG DHu21能抑制HepG2细胞增殖和活力,呈现作用时间和剂量的量效关系。HepG2细胞与ZG2 DHu21作用后,大部分细胞阻滞于G22M期;出现典型的细胞形态改变,DNA片断化,亚G
1
峰检出并增加,Annexin V+/
收稿日期:2006-02-16,修回日期:2006-04-22
基金项目:浙江省科技厅资助项目(No2003c33019)
作者简介:周永列(1963-),男,副主任医师,副教授,研究方向:实验血液学和抗癌药物机制,Tel:057128523998823825,Fax:
0571285235131,E2mail:zyl@https://www.doczj.com/doc/0e4243920.html,;
胡惟孝(1941-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:
制药工程和药物构效学,Tel:0571288320557,E2mail:huy2
ang@https://www.doczj.com/doc/0e4243920.html, P I-表达升高,细胞内DNA片段含量增加,Hoechst33258荧光染色后出现凋亡细胞的特征性改变等均证实ZG DHu21能诱导HepG2细胞凋亡。结论 ZG DHu21能抑制HepG2细胞增殖,并可诱导其细胞凋亡。
关键词:四嗪二甲酰胺;肝癌;细胞株,HepG2;增殖;细胞凋亡
四嗪二甲酰胺(ZG DHu21)是一种新颖的四嗪化合物,其化学名称为N,N′2二(间甲苯基)23,62二甲基21,4二氢21,2,4,52四嗪21,42二甲酰胺,结构式见Fig1。该化合物是胡惟孝等[1]以乙醛和水合肼为原料,改进了合成方法,合成中间体3,62二甲基2 1,6二氢21,2,4,52四嗪。以此为先导化合物,通过药物分子设计,合成了多种取代基修饰的3,62二甲基21,4二氢21,2,4,52四嗪类化合物,获国家发明专利[2]。经药物构效关系研究和筛选,其中ZG DHu21对非小细胞肺癌A549裸小鼠移植瘤抗肿瘤的动物试验证实,具有较强的抗肿瘤作用[3],其疗效与多西他赛相当,毒性更低。体外抗癌活性初步研究表明,ZG DHu21对乳腺癌MCF27、A549和小鼠白血病
?
4
5
7
?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6):754～9
P388等细胞株均有较强的抑制作用
[4]
,有望成为一
种具有自主知识产权的抗癌新药。为了研究ZG 2
DHu 21抗肝癌的作用及其途径,我们以肝癌细胞株HepG2为模型,在体外观察了ZG DHu 21对HepG2增殖抑制并诱导凋亡的作用
。
F i g 1 Stracture of ZGD Hu 21
1 材料与方法
1.1 材料 ZG DHu 21由浙江工业大学药学院制药
工程研究所合成,系白色片状结晶。贮存液(1g ?
L -1
)用二甲基亚砜溶解,应用液用含体积分数为10%的小牛血清的RP M I 1640(Gibco 公司产品)配
制。二甲基亚砜、噻唑蓝(MTT )、蛋白酶K 、胰蛋白为Sig ma 产品;DNA 2Prepkit (内含透膜剂,Rnase 和P I )为美国Beck man 2Coulter 公司产品;Annexin Ⅴ
和P I 试剂系Bender MedSyste m s 公司产品;B rdu 2EL I S A 细胞增殖和细胞凋亡试剂盒为Roche 公司产
品。Hoechst33258试剂系Cal B i oche m 公司产品。1.2 细胞培养 HepG2细胞株由浙江大学免疫研
究所沈建根教授惠赠。采用含体积分数为10%灭活小牛血清的RP M I 1640(Gibco 公司产品),并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES )及青霉素(1×105
U
?L -1)和链霉素(100mg ?L -1
)的培养体系培养。培养环境为37℃,含体积分数为5%的CO 2培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 细胞活力和形态观察 取对数生长期的细胞,
用215g ?L -1的胰蛋白酶消化后,以1×104?c m
-2
的细胞密度,分别接种于25c m 2
的培养瓶中,每瓶加盖玻片6张,24h 后细胞贴满玻片,每瓶加不同量的ZG DHu 21,使ZG DHu 21终浓度分别为2、10、50、
100、200、500μg ?L -1
,并设52F U (天津金耀氨基酸有限公司产品)的阳性对照和不加药物的空白对照组,终浓度为5mg ?L -1
。置含5%CO 2,饱和湿度,37℃的培养箱中培养24、48、72h,每瓶分别取出细胞爬片2张。其中1张用4%台盼蓝染色,计数活细胞数,细胞存活率/%=活细胞数/细胞总数×100%。每次计数200个细胞,每张爬片重复计数3
次,绘制细胞活力曲线。另一张爬片用W right 2Gi 2e m sa 染色,光镜下观察细胞形态变化。
1.4 M TT 法测定ZGD Hu 21对HepG2细胞生长
的影响 将对数生长期的HepG2细胞调整细胞浓
度为5×107?L -1
,接种于96孔无菌培养板中,每孔100μl 。培养24h 后弃上层培养基,每孔加200μl 无小牛血清的RP M I 1640培养基培养24h,使细胞同步于G 0期,实验组加用含2%小牛血清的RP M I 1640培养基配制的6种不同浓度的ZG DHu 21200
μl,对照组仅加2%小牛血清RP M I 1640培养基;52
F U 对照组的药物终浓度为5mg ?L -1
;以无细胞培养基为空白组。每组每个浓度下设4个复孔。培养
48、72h 后加10μlMTT (10g ?L -1
),继续培养4h 后离心弃上清液,每孔加入200μl DMS O 终止反应,微振荡后,用全自动酶标仪(Cli B i o128,美国)在570nm 波长处读取吸光度(A )值。计算抑制率。绘制剂量效应曲线,求出ZG DHu 21对HepG2细胞的半数抑制浓度(I C 50)。
1.5 5′2溴22′脱氧尿苷(Brdu)2E L I SA 法检测ZG 2D Hu 21对HepG2细胞增殖 ZG DHu 21对HepG2细
胞作用的浓度和处理方法同MTT 法,培养结束前每
孔加入20
μl B rdu 标记液,继续培养6h 。用EL I S A 法检测细胞增殖抑制,方法简述如下:加B rdu 培养结束后,加入Fix Denat 使DNA 变性,然后每孔加100
μl HRP 标记的抗B rdu 抗体,用洗涤液洗3次,每孔加入100μl T MB 底物液显色,于20m in 后加1mol ?L -1
H 2S O 4终止反应,置振荡器上1m in,在酶标读数仪上用450n m /630nm 双波长检测A 值,即B rdu 值。E L I S A 检测中设仅含培养基无细胞的空
白对照和含细胞而不加B rdu 的背景对照,该两对照
孔的A 值均小于011。每组设3个复孔。
1.6 Annex i n V /P I 标记染色测定凋亡细胞 ZG 2DHu 21处理HepG2细胞的分组同方法113。置5%
CO 2培养箱37℃孵育12、24h 轻轻收获细胞1×10
6
个,用冷P BS 洗1遍后置0℃水浴中,加490
μl 结合缓冲液,轻轻混匀细胞后加5μl F I T C 2Annexin V 和5μl P I,10m in 后流式细胞仪检测。
1.7 细胞周期和DNA 倍体分析 ZG DHu 21作用HepG2细胞的分组同方法113,取细胞悬液检测细
胞DNA 倍体。具体方法为取培养细胞悬液015m l,
用冷P BS 各洗涤1次,加DNA 2Prepkit 中透膜液(内含Trit on 和Rnase )50μl,轻摇后放置1m in,加碘化丙啶染液50μl 作用15m in 后,在EP I CS 2XL 型流式
细胞仪(Beckman 2Coluter 产品)上机分析,检测104
以上个细胞,并用Muticycle 软件进行DNA 倍体及细胞周期分析,计算亚二倍体峰(subG1)的百分率。1.8 D NA 琼脂糖凝胶电泳 收获经ZG DHu 21作
用的HepG2细胞1×107
个细胞,用S DS 和蛋白酶
?
557?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6)
K 裂解细胞后,按常规方法用酚—氯仿提取DNA,
复溶于TE 缓冲液中,经溴乙锭(015mg ?L -1
)染色后,用15g ?L -1琼脂糖凝胶电泳,5V ?c m -1
,电泳
3～4h,在紫外线透射仪上显影拍照。
1.9 Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡 细胞爬片制作及ZG DHu 21作用HepG2细胞的分组同方法113,培养48h 后的HepG2细胞,取爬片用固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)4℃固定5m in,蒸馏水冲
洗后加5mg ?L -1
Hoechst33258染色10m in,用蒸馏水洗片后经封片剂封片后在荧光显微镜下观察。1.10 E L I SA 法检测凋亡细胞的核小体 调整
HepG2细胞2×108?L -1
,加5′2溴22′脱氧尿苷(B r 2
du ),使其终浓度为10μmol ?L
-1
,培养16h,使
HepG2细胞标记B rdu,弃上层培养,收集HepG2细
胞,调整细胞浓度为1×108?L
-1
,接种于96孔培养
板上。待细胞完全贴壁后加ZG DHu 21,使终浓度分
别为2、10、50、100、200、500μg ?L -1
,并设52F U 阳性对照和空白对照组,每组设3个复孔。培养48h 后离心弃上层,加细胞裂解液200μl,30m in 后取其中100μl 加于包被抗DNA 抗体并已封闭的96孔酶标板上,室温放置90m in 后,用洗液洗3次,每孔再加洗液300μl,将酶标板放置内有约300m l 水的塑料盒内,放微波炉内500W 、5m in,取出后立即放-20℃冰箱内10m in,酶标板扣干后每孔加100μl HRP 标记的抗B rdu 抗体,室温放置90m in 后,用洗
涤液洗3次,每孔加入100μl T MB 底物液显色,于
20m in 后加1mol ?L -1
H 2S O 4终止反应,置振荡器上1m in,在酶标读数仪上用450nm /630nm 双波长检测A 值,2 结果
2.1 ZGD Hu 21抑制HepG2细胞增殖作用的检测2.1.1 ZG DHu 21对HepG2细胞生长活力的影响:HepG2细胞经ZG DHu 21作用后随着作用剂量和时
间的增加,细胞活力明显受抑。呈现剂量和时间的量效关系。
2.1.2 MTT 法检测ZG DHu 21抑制HepG2细胞增殖的效应 不同浓度的ZG DHu 21对HepG2细胞均有增殖抑制作用,呈现剂量-时间依赖关系(Fig
2)。10μg ?L -1
的ZG DHu 21即可抑制HepG2细胞
生长。48、72h 的I C 50分别为185、85μg ?L -1
。50μg ?L -1的ZG DHu 21对HepG2的抑制作用与5mg
?L -1
的52F U 相接近。
2.1.3 B rdu 2EL I S A 法检测ZG DHu 21对HepG2细
胞增殖 不同浓度的ZG DHu 21与HepG2细胞培养
48h 后,B rdu 参入量的检测值(吸光度A )呈现药物
剂量依赖型下降(Fig 3)。表明HepG2细胞经ZG 2DHu 21处理后,细胞增殖能力减弱。
F i g 2 The effect of Z
G D Hu 21on proli fera ti on
ra te i n HepG2(52F U:5mg ?L -1)
F i g 3 The effect of Z
G D Hu 21on proli fera ti on ra te by
Brdu i n HepG2(52F U:5mg ?L -1)
2.2 ZGD Hu 21诱导HepG2细胞凋亡作用的检测2.2.1 细胞形态学观察 倒置显微镜下,空白对照
组HepG2细胞形态均一,可贴壁生长。经ZG DHu 2
处理48h 后,HepG2细胞皱缩变小,大小不一,出现细胞碎裂。经W right 2Gie m sa 染色后油镜下观察,细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂,胞膜出泡,并可见典型的凋亡小体等。经Hoechst33258荧光染色后,在荧光显微镜下凋亡细胞可见细胞核或细胞质内浓染致密的颗粒荧光,正常细胞核呈弥漫均匀的荧光(Fig 4)。
2.2.2 细胞周期及DNA 倍体分析 ZG DHu 21与HepG2细胞培养48h 后,细胞凋亡率与药物剂量存
在量效关系。细胞周期进程明显受影响,G 0/1期细胞减少,细胞阻滞在G 22M 期(Tab 1,Fig 5),提示ZG DHu 21诱导G 0/1细胞凋亡并阻止细胞分裂。
?657?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6)
F i g 4 The cell m orphology of Z
G D
Hu 21on apoptosisi by W r i ght 2G i e m s a and Hoechst33258
F i g 5 The results of apoptoti c and cell cycle by FC M (culture 48h ) a ～f:Z
G DHu 21:2、10、50、100、200、500μg ?L -1;g:52F U;h:contr ol Tab 1 The results of apoptoti c and cell cycle of HepG2after trea t m en t w ith d i fferen t concen tra ti on of ZG D Hu 21( x ±s,n =3)Concentrati on /μg ?L
-1
SubG 1
/%
G 0/1
/%G 2/%
S /%2
26.4±2.23375.8±2.7 024.2±2.5 1028.2±2.03365.8±2.8 034.2±3.1 5030.5±2.63358.7±2.6339.89±1.43331.4±3.6 10033.2±3.53325.8±1.73313.1±1.83361.0±4.33320057.9±4.83323.5±1.13318.6±2.13357.9±3.133
50068.3±5.83345.7±2.93314.4±1.23
3
39.7±3.3
52F U 21.6±2.33
3
21.6±1.83
3
078.2±5.23
3
Contr ol
2.8±0.1 7
3.9±2.8 0
26.1±2.5
3
3
P <0101vs contr ol
2.2.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果 HepG2细
胞与不同浓度的ZG DHu 21孵育48h 后,经琼脂糖
凝胶电泳后,可见清晰的凋亡细胞特征性的梯状带。对照组无DNA 梯状带出现(Fig 6)。
2.2.4 Annexin V /P I 双标记测定凋亡细胞 HepG2细胞和不同浓度的ZG DHu 21作用12h 和24h 后,凋亡早期细胞(Annexin V +/P I -)和细胞总
凋亡率(Annexin V
+/P I -与Annexin V +/P I +之
和)结果见Fig 7和Tab 2。
F i g 6 The result of D NA agarosegel electrophoresis A ～F:Z
G DHu 21:500,200,100,50,10,2μg ?L -1,G:Contr ol
2.2.5 凋亡细胞核小体EL I S A 法检测结果 HepG2细胞与不同浓度的ZG DHu 21培养48h 后,
渗入到HepG2细胞中B rdu 的释放量的检测值(吸光度A )呈现药物剂量依赖型上升,3个复孔的均值
?
757?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6)
分别为0143、0155、0165、0171、0184、0186,52F U
组和空白对照组分别为0167和0131。表明HepG2细胞经ZG DHu 21处理后,细胞凋亡增加。
Tab 2 The results of apoptoti c HepG2after trea t m en t w ith
d i fferen t concen tra ti on of ZGD Hu 21
ZG DHU 21/μg ?L -1
12h Early apop t osis
Total apop t osis 24h
Early apop t osis Total apop t osis 2 3.26 3.4511.813.0710 3.92 4.4813.915.2150 3.33 4.6515.016.21100 4.04 4.5623.725.75200 4.57 4.8623.925.57500 4.84 5.2230.833.5152F U 4.78 5.0521.823.59Contr ol
1.62
1.80
3.54
4.97
3 讨论
四嗪是一类四氮杂苯化合物,根据其六元杂环
上氮原子的分布可以分为1,2,4,52四嗪(对称四嗪),1,2,3,42四嗪(连四嗪)和1,2,3,52四嗪(不对称四嗪)三种异构体。自从1900年德国化学家Ha 2ntzsh 和Leh mann 首先合成了对称四嗪,该类化合物
一直不为人们所注意。四嗪类化合物一般都具有良好的生物活性。目前惟一作为药品上市的替莫唑胺(Te moz ol om ide )是一种咪唑四嗪类口服抗肿瘤药,属于不对称四嗪类化合物,该药物对白血病、淋巴瘤及实体肿瘤尤其是脑部恶性肿瘤有较好的疗效。胡惟孝等合成了另一类全新结构的对称四嗪化合物,经过大量的筛选和结构疗效学研究,发现ZG DHu 21
具有明显的抗肿瘤活性。
本研究表明,ZG DHu 21可抑制HepG2细胞增
殖,其抑制效应呈时间和剂量依赖性。10μg ?L -1
的ZG DHu 21即可明显抑制HepG2细胞生长。48h 、
72h 的I C 50分别为185、85μg ?L -1。50μg ?L -1
的ZG DHu 21对HepG2的抑制作用与5mg ?L -1
的52F U 相接近。B rdu 2EL I S A 法检测结果显示,不同浓
度的ZG DHu 21与HepG2细胞培养48h 后,B rdu 参入量呈现药物剂量依赖型下降。表明HepG2细胞经ZG DHu 21处理后,细胞增殖能力减弱。细胞周期分析表明,经药物作用后,HepG2细胞周期进程明显受影响,G 0/1期细胞减少,S 期细胞比例也降低,细胞阻滞在G 22M 期,但随药物作用时间延长,G 22M 细胞百分比减少。提示ZG DHu 21可抑制HepG2细胞增殖。
亚G 1期细胞出现是细胞凋亡的标志之一。本
研究采用浓度梯度为2～500μg ?L -1
的ZG DHu 21与HepG2细胞作用不同的时间后,测定亚G 1期细胞百分率,结果发现随着药物浓度的增加,亚G 1期细胞百分率也随之增加,高于对照组,呈剂量效应关系。Annexin V /P I 双标记染色是测定早期凋亡细胞的有效方法,本研究发现HepG2细胞经ZG DHu 21
作用12和24h 后,细胞早期凋亡率和总凋亡率随ZG DHu 21浓度增加而升高。ZG DHu 21与HepG2细胞作用48h 后,光镜下可见细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂,胞膜出泡,新月型核等凋亡细胞的特征性改变。Hoechst33258荧光染色后,在荧光显
F i g 7 The result of Annex i n V /P ILabeli n g by FCM (culture 24h) A ～F:Z
G DHu 21:2、10、50、100、200、500μg ?L -1;G:52F U;H:contr ol
?857?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6)
微镜下可见细胞核或细胞质内浓染致密的颗粒荧光。经DNA琼脂糖凝胶电泳,可见清晰的凋亡细胞特征性的梯状带。细胞核小体是细胞凋亡的特征性标记,核小体由组蛋白和DNA片段组成,用EL I S A 法测定经B rdu标记的DNA片段,可敏感地定量反映细胞凋亡。本研究显示,HepG2细胞经不同浓度的ZG DHu21培养48h后,反映凋亡细胞核小体DNA片段数量的指标呈现药物剂量依赖型上升。上述结果说明,ZG DHu21可诱导HepG2细胞凋亡。
ZG DHu21作用的分子机制尚不清楚。有作者研究替莫唑胺的作用机制时,认为可能与DNA特定位置的甲基化有关。其中鸟嘌呤O6位置甲基化更为重要[5],诱导p53和p21waf-1蛋白的表达,抑制细胞增殖并出现凋亡,还可能与抑制端粒酶活性有关[6]。替莫唑胺的抗肿瘤转移是通过干扰激活PKC引起的α26磷酸化过程得以实现。我们曾观察了ZG DHu21诱导SH I21细胞分化和凋亡过程中p38MAPK和Stat3磷酸化表达的变化,发现SH I21细胞经不同浓度的ZG DHu21培养48h后,磷酸化p38MAPK随ZG DHu21浓度增高表达增强,而磷酸化Stat3表达降低,说明p38MAPK信号通路和磷酸化Stat3参与了ZG DHu21诱导SH I21细胞分化和凋亡过程。ZG DHu21抑制HepG2细胞增殖并诱导其细胞凋亡的机制是否与上述途径有关尚需进一步的研究。肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,肝癌的综合治疗中,化疗具有重要的作用。为此,许多学者[7]长期致力于抗肝癌药物的研究。ZG DHu21经小鼠口服后的最大耐受量大于5000mg?kg-1。因此,ZG DHu21有望成为治疗肝癌的一种新药。
参考文献:
[1] 胡惟孝,杨忠愚,周 茂,等.新型抗癌药3,62二甲基21,42二
氢2S2四嗪21,42二甲酰胺类化合物及其制造方法[P].中国发
明专利,申请号Z L98121915.2,证书号第159831号.
[2] 孙雅泉,胡惟孝,袁 庆.N,N′2双间甲苯基23,62二甲基21,4
二氢2s2四嗪21,42二甲酰胺的合成和晶体结构[J].有机化学,
2003,23:483-7.
[3] 蔡志彬,周 茂,胡惟孝,等.N,N′2二取代苯基23,62二甲基21,
4二氢21,2,4,52四嗪21,42二甲酰胺衍生物的合成及抗肿瘤活
性[J].药学学报,2000,35:793-6.
[4] W eixiao H,Guowu R,yaquan S.Synthesis and antitumor activity
of S2tetrazine derivatives[J].B ioorganic M edicinal Che m istry L et2
ters,2004,14:1177-81.
[5] W edge S R,Newlands E S.O62benzylguanine enhances the sensi2
tivity of a gli oma xenograft with l ow O62alkyguanine2DNA alkyi2
transferase activity t o te mozol om ide and BCNU[J].B r J Cancer,
1996,73:1049-52.
[6] Kanzawa T,Ger mano IM,Kondo Y,et al.I nhibiti on of tel omerase
activity in malignant gli oma cells correlati on with their sensitivity t o
temoz ol om ide[J].B r J Cancer,2003,89:922-9.
[7] 何 慧,郭 芳,屈顺林,等.蛋白酶体抑制剂MG132诱导
HepG2细胞凋亡及其机制研究[J].中国药理学通报,2005;21
(7):795-8.
The effects of N,N′2d i2(m2m ethylphenyl)23,62d i m ethyl21, 42d i hydro21,2,4,52tetraz i n e21,42d i carboam i de on
proli fera ti on and apoptosis i n HepG2cells in vitro ZHOU Yong2lie1,LΒYa2p ing2,HU W ei2xiao2,Q I U L ian2nü1,
WANG W en2s ong1,Y ANG Zhong2yu2,L I U J ian2dong1
(1.Central L aboratory,Zhejiang P rovincial People′s Hospital,Hangzhou 310014China;
2.Colleage of Phar m aceutical Sciences,Zhejiang U niversity of Technology,Hangzhou 310014,China)
Abstract:A i m To study the effect of N,N′2di2(m2 methyl phenyl)23,62di m ethyl21,42dihydr o21,2,4,52tet2 razine21,42dicarboa m ide(ZG DHu21)on p r oliferati on inhibiti on and apop t osis in HepG2cells in vitr o. M ethod D ifferent concentrati on of ZG DHu21and the different ti m e of cultivate were used t o treat HepG2 cell.The p r oliferati on inhibiti on was analysed by alive cell count,MTT assay and B rdu2EL I S A.Cell apop t osis was analysed by cell mor phol ogy,DNA agar ose gel e2 lectr ophoresis,DNA content,Annexin2V/P I,cellular DNA feag mentati on EL I S A and Hoechst33258labeling method.Results ZG DHu21can inhibit HepG2cell p r oliferati on viability within a certain range of treating ti m e and does,and a maj ority of HepG2cells were ar2 rested in G2/M phase.The HepG2cells apoposis was comfir med by type cell mor phol ogy and DNA frag ment and sub2G1phase and Hoechst33258and Annexin/P I Labeling method and cellular DNA feag mentati on EL I S A with a ti m e and does related manner.Conclusi on ZG DHu21can inhibit p r oliferati on and induced apop t o2 sis of HepG2cells.
Key words:N,N′2di2(m2methyl phenyl)23,62di m eth2 yl21,42dihydr o21,2,4,52tetrazine21,42dicarboa m ide; Hepatic cancer;cell line,HepG2;p r oliferati on;apop2 t osis
?
9
5
7
?
中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6)
HuH-7 人肝癌细胞 Catalogue No.: C165 Product Format: a T25 flask Culture Properties：贴壁 Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗 Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Application:Cells and cancer research NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY. Components Operation steps for cell culture 1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞； 2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶 浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化； （细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。） 3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀； 4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基 重悬37度培养箱继续培养； 传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。 Cell cryopreservation 1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择） 2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
2020肝细胞癌免疫治疗现状（完整版） 肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的病理类型，也是癌症相关死亡的主要原因之一。早期HCC可以通过手术或消融治疗，但对于晚期HCC，可用的治疗均为姑息性治疗。目前大量的研究支持免疫疗法应用于HCC。本综述将讨论免疫检查点抑制剂（ICB）在HCC中的应用现状。 ICB在晚期HCC的疗效 目前已有几种ICB在针对晚期HCC的1、2和3期临床试验中进行了验证。ICB单药治疗的缓解率（ORR）为15％-23％，联用靶向治疗或其他ICB的ORR可达到30%（表1和表2）。其中研究显示，纳武利尤单抗、帕博利珠单抗以及纳武利尤单抗联合伊匹木单抗在HCC中具有持久的抗肿瘤反应。 Check Mate 040研究显示，在经索拉非尼治疗的晚期HCC中，单用纳武利尤单抗的ORR为18.7%，纳武利尤单抗联合伊匹木单抗的ORR为33％；中位总生存期（OS）分别为15个月（单用纳武利尤单抗）和23个月（联合用药）。KEYNOTE-224研究显示经索拉非尼治疗的晚期HCC 中，帕博利珠单抗的ORR为17％，中位OS为13个月。 表1 ICB在晚期HCC疗效观察的部分1/2期试验
缩写：NR，未报告；ORR，总体缓解率；OS，总生存期；PFS，无进展生存期；TTP，出现进展的时间。a仅包括样本量35例以上的试验；b根据实体瘤反应评估标准（RECIST）版本1.1.16；c具有3种不同给药方案的三臂；d根据修改后的RECIST。 尽管1/2期研究获得了阳性结果，但纳武利尤单抗和帕博利珠单抗在随后开展的针对晚期HCC的2项3期随机试验中未达到预定的主要终点。第一项是CheckMate 459研究，其比较了纳武利尤单抗和索拉非尼在晚期HCC中的疗效，未达到预定的OS主要终点事件。但纳武利尤单抗的中位OS较索拉非尼有所延长（16.4 vs. 14.7个月）；纳武利尤单抗的ORR是索拉非尼的2倍（15％vs. 7％），且4％的纳武利尤单抗患者完全缓解；纳武利尤单抗的安全性和生活质量也明显高于索拉非尼。 另一项是KEYNOTE-240研究，其在经索拉非尼治疗的晚期HCC患者中比较了帕博利珠单抗与安慰剂的疗效，也未达到预定的OS主要终点事件。结果显示，帕博利珠单抗组的OS长于安慰剂组（13.9 vs. 10.6个月；
项目学习：普外科肝癌总共4套题答案的选A 第一套题 1、在肝癌的TNM分期中，T代表的是（c ） A、肿瘤大小 B、远处转移 C、原发灶 D、区域淋巴结 2、下列哪项不属于原发性肝癌（a ） A、肝脏继发性肿瘤 B、肝细胞癌 C、肝内胆管细胞癌 D、肝细胞-胆管细胞混合型癌 3、肝细胞癌的特点不包括（a ） A、进展缓慢 B、起病隐匿 C、治疗困难 D、预后很差 4、若肝癌病变位于左肝，一般疼痛部位是（c） A、右腰部 B、右肋区 C、剑突下 D、右背部 5、肝癌诊断的金标准是（b） A、慢性肝病背景 B、病理学诊断 C、影像学检查结果 D、血清甲胎蛋白水平 6、肝细胞癌多见，占到肝癌的（d）以上 A、60% B、70% C、80% D、90% 7、肝性脑病常发生在肝病（d ） A、早期 B、中期 C、晚期 D、终末期 8、在我国引起肝细胞癌的因素主要是肝炎病毒感染导致的（b ） A、甲肝 B、乙肝 C、丙肝 D、戊肝 9、下列哪项是肝硬化门脉高压引起的肝癌并发症（a） A、消化道出血
B、肝肾综合征 C、肝性脑病 D、肝癌破裂出血 10、（b）是肝细胞癌的重要症状，常为间歇性或者持续性 A、持续低热 B、肝区疼痛 C、食欲减退 D、消瘦乏力 第二套题 1、2.Okuda分期的不足不包括（d ） A、对肿瘤累及范围的确定过大 B、血清胆红素的界值定义过高 C、未纳入早期肝癌预后因素 D、唯一未加干预措施评估生存期 2、下列哪项是碱性磷酸酶的主要分布位置（b ） A、脾脏 B、肾脏 C、胰腺 D、心脏 3、在肝癌的TNM分期中，T3代表的是（a） A、肿瘤多发，最大径>5cm；侵及门脉或肝静脉主要属支 B、肿瘤单发，有血管浸润；多发，最大径≤5cm C、肿瘤单发，无血管浸润 D、无原发肿瘤证据 4、在BCLC分期中，早期患者可行根治性治疗措施指的是（a ）期 A、A B、B C、C D、D 5、CLIP分期是1998年（b ）肝癌研究组提出的 A、奥地利 B、意大利 C、加拿大 D、美国 6、（d ）是良好的肝脏储备功能评价指标 A、天门冬氨酸氨基转移酶 B、碱性磷酸酶 C、3.白蛋白 D、前白蛋白 7、Kampala分期是（a）年乌干达首都坎帕拉举行的国际肝癌讨论会上制定 A、1971 B、1981 C、1991 D、2001
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/0e4243920.html, Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达 作者：刘鼎刘建生 来源：《中国当代医药》2015年第16期 [摘要] 目的检测Rab27A与Rab27B在3种人肝癌细胞系及1种永生化肝细胞系中的表达情况，初步研究Rab27A与Rab27B表达对肝癌细胞生物学特性的影响。方法采用RT-PCR及Western blot技术，检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达。结果 Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌组织中存在差异性表达。Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达明显强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均明显表达但无显著差异。结论 Rab27A与Rab27B与原发性肝癌密切相关，可以为临床采取合理诊断措施提供有效的参考依据。 [关键词] Rab27A；Rab27B；肝细胞癌；RT-PCR；Western blot [中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（a）-0004-04 Expression of Rab27A and Rab27B in the four different hepatocellular carcinoma LIU Ding LIU Jian-sheng▲ The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China [Abstract] Objective To investigate the expression of Rab27A and Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line and its effect on biology characteristics of the cells. Methods The mRNA expression of Rab27A and Rab27B was detected by RT-PCR，and Western-blot in 3 human HCC lines of HepG2，Huh-7，Li-7 and the immortalized hepatic cell line of HL-7702. Results Rab27A and Rab27B were differentially expressed in cell lines and primary HCC tumors.The expression of Rab27A in 3 human HCC line was significantly better than that expressed in the immortalized hepatic cell line；the mRNA of Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line were significantly expression but there was no significantly difference. Conclusion Rab27A and Rab27B expression are closely correlated HCC，it can provide the clinical reasonable diagnostic measures as valuable effective reference basis. [Key words] Rab27A；Rab27B；Hepatocellular carcinoma；RT-PCR；Western blot 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的侵袭性和转移性，出现典型症状时，往往已经为晚期。目前与HCC进展相关的因子包括癌
综述：肝细胞性肝癌 原发性肝癌以肝细胞性肝癌（HCC）为主。在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在发病率方面排名第六。根据世界卫生组织的年度预测，估计2030年将有100多万患者死于肝癌。 在美国，从2000年到2016年，肝癌的死亡率增加了43%（从7.2人/10万人上升到10.3人/10万人），而5年生存率为18%，肝癌已成为仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤。大部分的HCC发生在有基础肝脏疾病的患者当中，主要是HBV或HCV感染或酒精滥用。 普遍接种HBV疫苗和广泛应用针对HCV的直接作用抗病毒药物可能将改变HCC的病因谱。而非酒精性脂肪肝（NAFLD）、代谢综合征和肥胖患者的增加放大了肝癌的发生风险，在西方国家，NAFLD将很快成为肝癌的主要病因。 针对晚期肝癌患者的系统疗法发展迅速，在过去2年，有4种新药在3期临床试验中显示出了临床疗效。本文将主要论述HCC的主要遗传学改变、风险因素、监测和诊断，以及循证治疗方法。 一、发病机制 慢性肝病患者存在持续性肝脏炎症、肝纤维化和肝细胞异常再生。这些异常的生理过程可导致肝硬化，并导致一系列遗传学和表观遗传学事件，最终导致异常增生结节（真正的肿瘤癌前病变）的形成。额外的分子改变能使异常增生细胞获得增殖、侵袭性和生存优势，并完成到成熟HCC的转变（图1）。HCC也可发生于不存在肝硬化或明显炎症的慢性肝病患者（如HBV感染患者）。 图1HCC的主要遗传学改变及分子分型 图中描述了人HCC发生过程中关键的分子和组织学改变，以及HCC两个分子亚型的主要遗
传和临床特征。*表示高水平的DNA扩增。在非增生型中，CTNNB1突变增强了免疫排斥。 二、风险因素 没有基础肝病的患者很少罹患HCC，男性的HCC发病率是女性的两倍。任何原因的肝硬化都会增加HCC的发生风险。 这种风险因病因、地理区域、性别、年龄和肝损伤程度而异。 在世界范围内，HBV感染是HCC的主要病因。尽管乙肝疫苗的广泛接种降低了HCC的发病率，但仍有许多未接种疫苗的人感染HBV（2015年为2.57亿人），有罹患HCC的风险。饮食中接触黄曲霉毒素B1可导致249位TP53的特异性突变（R→S），增加HBV感染患者发生HCC的风险。在西方国家和日本，HCC的主要病因是HCV感染。无论潜在的肝纤维化程度如何，HBV感染都有直接的致癌作用，但在HCV感染者中，若不伴有重度肝纤维化，则HCC很少发生。 全世界范围内，NAFLD相关HCC的发病率呈上升趋势。在美国，从2016年到2030年，该发病率预计将增加122%（从5510例增加到12240例）。 酒精性肝硬化是HCC的另一常见病因。 吸烟合并HIV感染也可能导致HCC的发生。抗病毒治疗在降低HCC的发生率方面是有效的，但不能根除这种风险。 与无应答的患者相比，在对干扰素治疗方案有持续病毒学应答的HCV感染患者中，HCC 的风险从6.2%降低到了1.5%。据报道，使用直接作用抗病毒药物治疗的HCV感染患者发生HCC的风险也会降低。 除了肝病的病因治疗外，尚无任何药物可以降低HCC的发生率。 三、HCC的监测 癌症监测旨在早期发现肿瘤，增加治疗机会，提高生存率。然而，尚无高质量的随机对照试验评估HCC监测对肝硬化患者的临床价值。不过，数学模型、低质量的临床试验（在方法学上有局限性）以及meta分析都显示了监测对患者的生存益处。 HCC监测的目标人群是肝硬化患者，且不考虑肝硬化的病因。 由于重度肝功能不全的肝硬化患者不适合接受根治性治疗，所以没有癌症监测的必要。但因肝功能障碍而等待肝移植的患者则需要进行监测，目的是确保肿瘤不会发展到按照既定标准无法进行移植的程度。 一些没有肝硬化的肝病患者也应该被纳为癌症监测目标。慢乙肝患者发生HCC的风险存在地区差异（非洲和亚洲地区的发生风险高于其他地区），且老年、男性、肝纤维化、病毒复制水平高、基因C型以及HCC家族史都提示着更高的HCC发生风险。 虽然无肝硬化的非酒精性肝病患者可能会发生HCC，但实际风险是未知的，且可能非常低。除非有方法可以识别出风险较高的患者，否则不建议对无肝硬化的NAFLD患者进行癌症监测。 HCC的推荐监测方法为：每6个月进行一次腹部超声检查，联合/不联合血清甲胎蛋白水平检测。结果对操作者的依赖性较高，敏感度为47%-84%，特异度＞90%。对肥胖患者，超声检测的实用性会降低。 四、HCC的诊断 在肝硬化患者中，利用影像学技术就可以诊断HCC（图2）。由于肝细胞在恶性转变期间会发生血管转变：良性病灶（如增生性结节）由门静脉系统分支供血，而恶性病灶由肝动脉分支供血。这种转变转化为一种独特的模式：对比增强CT或MRI可显示动脉后期明显强
健康教育 一、用药指导 1、遵医嘱按时、准确、合理使用止痛剂。对于晚期肝癌发生难以控制的疼痛时，应尽可能在疼痛前给药。 2、出血患者，中药汤剂宜偏凉服。胃纳不佳者，中药应浓煎，并予多次少量进服，以饭前或饭后1小时为宜。对胃有刺激的药宜饭后服，补益药宜饭前服。 3、癌性发热者应用消炎痛纳肛退热时，因汗出较多，应及时补充水分，更换汗湿的衣服。 4、应用化疗药物时应防止药液外渗，并计划使用静脉。 二、饮食指导 饮食原则以高蛋白、适当热量、高维生素、低脂肪食物为宜，限制动物油的摄入；饮食多样化，注意食物搭配，做到色、香、味俱全，以增进食欲；进食应以易消坚硬、辛辣之品，少食煎炸食品，少量多餐：肝硬化时避免有刺激性及植物纤维素多的食物，以免引起食管或胃底静脉破裂出血：多食新鲜蔬菜、水果，饮用果汁饮料，补充维生素：出现腹水时应限制钠的摄入，要用低盐或无盐饮食：出血倾向宜吃贝、橘、海参、乌贼等：疼痛宜吃金橘、杨梅、山楂等：出现呕血、黑便时立即禁饮食。 三、心理指导 1．本病病情发展快，预后差，患者精神压力大，情绪低落，应予以关心、体贴、帮助、支持和鼓励，使患者对疾病有正确的认识，积极组东配合治疗。 2．保持心情愉快，学会自我心理调节，避免不良因素的刺激。控制情绪波动，防止病情恶化。 3．培养自己的多种兴趣，自己给自己找乐趣，如：下棋、聊天、看电视、集邮、养花等以分散注意力，有利于养病、避免在家胡思乱想。 四、日常生活指导 1、根据体质、病情和耐受情况进行体育锻炼，如打太极拳、练保健操等。 2、遵医嘱继续用药。 3、戒除嗜酒、酗酒等不良习惯，不喝烈性酒、劣质酒、以防酒精对肝细胞的破坏，造成肝脏的操作及慢性肝脏中毒。 4、定期随诊复查，了解肝功能变化及病情复发情况。术后还应注意甲胎蛋白追踪检查结果，或注意观察有无肝癌的转移。
网络出版时间：2014-02-17 09:02 网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/0e4243920.html,/kcms/detail/64.1008.R.20140217.0902.004.html 人肝癌细胞株中FOXM1 及NF-κB的表达及意义 王琦1，柴磊2，蒋少青3，马丽4 ，金栋5 ，殷利军5，张桂香5，谢岩青5 （1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，银川 750004；2.宁夏回族自治区第三人民外科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004；4.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院药剂科，银川 750004；5.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院血管外/普外科，银川750004）1 [摘要] 目的探讨不同肝癌细胞株中转录因子FOXM1（Forkhead Box M1）及核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa B）的表达强度及意义。方法采用Western blot、RT-PCR法，检测不同肝癌细胞株（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721）中FOXM1及NF-κ B 在蛋白及mRNA 水平的表达情况。结果在3株肝癌细胞中FOXM1及NF-κB的表达无论是mRNA水平还是蛋白水平均存在显著差异，细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达同时都明显高表达于细胞株SMMC-7721。结论肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达与NF-κB表达趋势一致，提示FOXM的表达可能与NF-κB的活化有关。 [关键词] FOXM1；NF-κB；肝细胞肝癌 [中图分类号]R735.7 [文献标识码]A Expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells WANG Qi1，CHAI Lei2，JIANG Shao-qing 3，MA Li4，JIN Dong5，YIN Li-jun5 ,ZHANG Gui-xiang5，XIE Yan-qing5，（1. Dept.of Hepatobiliarysurgery，the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；2. Dept.of Surgical， the Third People′s Hospital of Ningxia. Yinchuan 750004；3. Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；4. Dept.of Pharmacy，the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；5. Dept.of Vascular/General Surgery， the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ.Yinchuan 750004） ABSTRACT Objective（1）To investigate the expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells. Methods The expression of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B protein and micro-RNA in hepatocellular carcinoma cell lines(QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721)were detected with the application of Western blot analysis and RT-PCR analysis，respectively. Results The expression 基金项目：宁夏自然科学基金（项目编号：NZ1236） 作者简介：王琦(1983-),硕士，主任医师，肝癌复发相关分子机制的研究。 通作者：谢岩青，Email：xie-yanqing@https://www.doczj.com/doc/0e4243920.html,
在现在人们的生活当中，人们不仅仅只追求是所谓的物质生活，健康也是人们越来越追求的了，因为如果没有了健康，所有的物质也都是白搭，肝癌就是危害健康的一大杀手，随着中医治癌理念的普及与广泛应用，不少饱受过西医肿瘤治疗副作用的患者转而求诊于副作用小、较为安全的中医施治。可是已经经过了病痛折磨，都不免想要仅服用中医药施治，那么，是否有纯中医药治疗肝癌晚期的案例呢?下面，我们就来详细说明下。 纯中医药治疗肝癌晚期的案例有不少 患者会问是否有纯中医药治癌的案例，应该是疑惑纯中医药施治的功效。其实，大量临床研究表现，癌肿虽然发生在身体的局部部位，但实际上是一种全身性疾病，肿块仅是全身性病变的局部显现。局部的癌肿，会通过血液循环、淋巴循环等在全身各个部分广泛扩散、转移。对大多数肿瘤患者而言，仅是局部切除肿块，或灭杀肿瘤不可能长期稳定，治疗后容易复发、转移。 纯中医药可以施治晚期肝癌，正是因为，中医治癌具有整体观，可以从肝癌整体出发，既考虑局部癌肿与病灶的治疗，又采取扶正固本的方法，提高及巩固免疫机能、体质，维持机体免疫功能与肿瘤对抗平衡。 有时候，患者服用几个疗程的中医药后，经检查发现肿块没有明显缩小，便自觉中医无用。其实，瘤体已经被控制，虽然不见肿块缩小，但肿块也不会扩张、增大。肝癌非一日之病，是机体长期受内忧外患干扰的结果，那整体施治的中医药治疗，对机体的调养也应是循序渐进的，有较长的调养周期。 在临床上，坚守在中医治癌临床前线近四十年的肿瘤老中医袁希福就以亲身实践表明，纯中医药施治晚期肝癌的可行性。自2004年到2017年，整整十三年间，郑州希福中医肿瘤医院连续召开五届希福中医百名抗癌明星康复经验交流会，见症了数万人的康复奇迹!一个人的康复，也许只是幸运;十个人的康复，可能是偶然;一百个人的康复，传递的就是希望!而且参加大会的百余名患者中，其中不少都是已经发展到晚期，甚至是已经被医院判“死刑”的患者。因此，肝癌晚期患者一定不要轻易放弃，应积极配合治疗，尽可能延长生存期，提高生存质量，甚至实现临床康复或长期带瘤生存。那么多中医药治疗肝癌晚期的康复案例，自是症明了纯中医治疗晚期肝癌的有效性。 袁希福提出的中医抗癌三联平衡理念还指出：确保中医治癌疗效的关键在于辩症论治。肝癌病因不明，但其发生、发展、转移有一定规律性，肝癌患者普遍具有相同的元气亏虚、痰凝血瘀、癌毒结聚表现。在治疗上，辩症论治要根据晚期肝癌患者的分期情况、症状不同、表现不同、转移部位不同，抓住肝癌患者的实质内涵，主要病机“虚”“淤”“毒”三大本质进行灵活辩症，才可以实现对症下药、有的放矢。从而全面调整患者全身阴阳、气血、脏腑生理功能平衡，提高及巩固机体免疫力，增强患者体质，调动患者自身免疫力，让瘤体趋于稳定，有效预防病情反复，从而提高生存质量，延长生存期，进而达到长期带瘤生存。 【真实案例】依据三联平衡理念为指导，在辩症施治基础上治疗的肝癌患者前后现状
原发性肝癌诊疗规范(2011年版) 一、概述 原发性肝癌(Primary liver cancer，PLC,以下简称肝癌) 是常见恶性肿瘤。由于起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，如果仅采取支持对症治疗，自然生存时间很短，严重地威胁人民群众的身体健康和生命安全。 原发性肝癌主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管细胞癌(ICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型，在其发病机制、生物学行为、组织学形态、临床表现、治疗方法以及预后等方面均有明显的不同；由于其中HCC占到90%以上，故本文所指的“肝癌”主要是指HCC。 二、诊断技术和应用 （一）高危人群的监测筛查。 我国肝癌的病因因素，主要有肝炎病毒感染、食物黄曲霉毒素污染、长期酗酒以及农村饮水蓝绿藻类毒素污染等，其他肝脏代谢疾病、自身免疫性疾病以及隐原性肝病或隐原性肝硬化。由于肝癌的早期诊断对于有效治疗和长期生存至关重要,因此,十分强调肝癌的早期筛查和早期监测。常规监测筛查指标主要包括血清甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein，AFP)和肝脏超声检查(US)。对于≥40
岁的男性或≥50岁女性，具有HBV和/或HCV感染，嗜酒、合并糖尿病以及有肝癌家族史的高危人群，一般是每隔6个月进行一次检查。一般认为，AFP是HCC相对特异的肿瘤标志物，AFP持续升高是发生HCC的危险因素。新近，有些欧美学者认为AFP的敏感性和特异度不高，2010版美国肝病研究学会(AASLD)指南已不再将AFP作为筛查指标，但是我国的HCC大多与HBV感染相关，与西方国家HCC致病因素不同（多为HCV、酒精和代谢性因素），结合国内随机研究(RCT) 结果和实际情况，对HCC的常规监测筛查指标中继续保留AFP。 （二）临床表现。 1.症状。 肝癌的亚临床前期是指从病变开始至诊断亚临床肝癌 之前，患者没有临床症状与体征，临床上难以发现，通常大约10个月时间。在肝癌亚临床期（早期），瘤体约3－5cm，大多数患者仍无典型症状，诊断仍较困难，多为血清AFP普查发现，平均8个月左右，期间少数患者可以有上腹闷胀、腹痛、乏力和食欲不振等慢性基础肝病的相关症状。因此,对于具备高危因素，发生上述情况者，应该警惕肝癌的可能性。一旦出现典型症状，往往已达中、晚期肝癌,此时，病情发展迅速, 共约3-6个月, 其主要表现:
肝癌诊治指南（试行） 一、范围 本指南规定了原发性肝癌（简称肝癌)的规范化诊治流程、诊断依据、诊断、鉴别诊断、治疗原则和治疗方案。 本指南适用于具备相应资质的市、县级常见肿瘤规范化诊疗试点医院及其医务人员对肝癌的诊断和治疗。 二、术语和定义 下列术语和定义适用于本指南。 肝细胞肝癌hepatocellular carcinoma 三、缩略语 下列缩略语适用于本指南： HCC:(hepatocellular carcinoma)肝细胞肝癌 AFP: (a-fetoprotein)甲胎蛋白 CEA: (carcinoembryonic antigen)癌胚抗原 CA19-9:(Carbohydrate Atigen 19-9)糖抗原19－9 ICG15:(Indo Cyanine Green)吲哚氰绿15分钟潴留率 HBV:(hepatitisB virus)乙肝病毒 HCV:(hepatitisC virus)丙肝病毒 TAIT:( transarterial interventional therapy)经肝动脉介入治疗 3DCRT:(3-dimensional conformal radiation therapy)三维适形放疗 IMRT:(intensity modulated radiation therapy）调强适形放疗 四、诊断依据 （一）高危因素。 有乙型/丙型肝炎或酒精性肝硬化、黄曲霉毒素接触史、饮水污染史者，是肝癌的高危人群。 （二）症状。 具备高危因素，合并肝痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦、黄疸、腹水者，应高度警惕肝癌可能。 （三）体征。 1．多数肝癌患者无明显相关阳性体征。 2．合并高危因素者，出现肝大伴或不伴结节、上腹肿块、黄疸、腹水、脾大等，应警惕肝癌可能。 3．肝掌、蜘蛛痣、血管痣和腹壁静脉曲张等为肝硬化体征。 4．临床诊断为肝癌的病人近期出现咳嗽、喀血、骨痛、病理性骨折、左锁骨上淋巴结肿大等提示远处转移的可能。 （四）辅助检查。 1．血液生化检查 对于原发性肝癌，可能出现血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高、白蛋白降低等肝脏功能改变以及淋巴细胞亚群等免疫指标的改变。2．肿瘤标志物检查 AFP（甲胎蛋白）是肝癌诊断中最好的肿瘤标记。AFP>400ng/mL一个月；或AFP>200ng/mL 持续二个月，排除妊娠和生殖腺胚胎癌者，高度警惕肝癌，应通过影像学检查确诊。
BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌细胞培养过程 器材： 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、离心机、 倒置显微镜、超净工作台、一次性吸管若干个、带塞培养瓶（不定个）、试管架、酒精灯、G6型号细菌过滤漏斗、无菌冻存管、液 氮瓶。 试剂： RPMI l640培养液，胎牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，70%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，胎牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。 器皿的消毒及准备： 清洗灭菌（浓硫酸、蒸馏水）： （1）浸泡（酸浸）:新使用或重复使用的玻璃器皿须经浓硫酸 溶液浸泡过夜，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷 等物质，并消除其弱碱性。操作过程需戴防护用具。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后 经行烘干。 （3）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器 皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能 残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。 实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消 毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线 照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须 快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应 马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然 后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解 冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培 养液。
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称Hep G2 [HepG2]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS其它因子1%NEAA 传代方法1:4~1：6传代；每周2次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SMMC-7721 [SMMC7721]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3传代；3~4天1次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS 其它因子无 传代方法1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-） 国内还有，： 小鼠肝癌细胞Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株H22 人肝癌细胞HHCC 人肝癌细胞PLC/PRF/5 人肝癌细胞HB611 人肝癌细胞BEL-7402 人肝癌细胞QGY-7701 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞QGY-7703 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞BEL-7404 人肝癌细胞BEL-7405
早期非典型肝细胞性肝癌CT表现分析 目的分析非典型肝癌CT表现，为临床诊断早期肝癌提供帮助。方法选取8例经手术及病理检查确诊早期不典型肝细胞肝癌患者为研究对象，分析其CT 表现。结果平扫显示，8个病灶均呈低密度表现，平扫病灶边界模糊6例，病灶边界清楚2例，有纤维假性包膜2例，病灶密度均匀6例，病灶密度不均匀2例；三期增强扫描：患者表现程度不一的轻度强化，和邻近的正常肝实质相比，三期增强扫描显示病灶强化后的密度均较低，且动脉期及静脉期强化密度相对较低，门静脉期的强化密度相对较高；增强扫描动脉期病灶边界清4例，病灶边界模糊4例，门脉期病灶边界清楚7例，病灶边界模糊、病灶边缘轮廓轻度不规整1例，密度均匀2例，病灶内密度不均匀、伴有多个小斑点状6例。结论早期肝癌的CT表现不典型，临床应掌握其特点，结合病理学检查予以确诊。 标签：不典型小肝癌；扫描；体层摄影术；CT表现；病理学检查 我国是肝癌高发国，恶性程度及死亡率均较高。肝癌居我国恶性肿瘤死亡率的的第2位。早期肝癌又称小肝癌（smallhepatocellular carcinoma，SHCC），指单个癌结节最大直径不超过3cm，或癌结节数目≤2个，癌结节最大径之和≤3cm[1]。早期肝癌患者临床症状不明显，手术切除率较高，术后可达5 年生存率。因此，临床应早期诊断，及时手术，防止疾病进一步发展恶化，提高患者生存率，改善患者预后。目前检查肝癌依赖螺旋CT多期增强扫描技术，诊断正确率可达90%[2]。但早期小肝癌部分CT呈现不典型表现，导致早期诊断失误。本文主要分析非典型肝癌CT表现，旨在提高临床诊断正确率。现报道如下。 1资料与方法 1.1一般资料2010年5月~2013年12月，我院经病理检查诊断原发性肝细胞癌患者72例，其中51例肝癌患者CT 表现具有典型特征性，21例患者CT表现不典型，其中平扫及三期后均呈低密度改变8例。以这8例患者为研究对象，分析其CT影像学特征。8例患者AFP值：AFP升高者7例，正常1例。8例患者中，男性6例，女性2例，年龄36～69岁，平均年龄（48.5±1.36）岁；病因：6例患者以腹胀、腹泻、黄疸等消化道症状为主要表现，1例结肠癌术后发现，1例正常体检时发现。 1．2检查方法与仪器设备先行平扫，扫描条件为120kV，200～300mA，设置参数为螺距0．984，层厚5mm。扫描包括膈顶至双肾下极之内的区域。随后进行增强扫描：采用碘帕醇100ml经肘静脉注射，进行三期扫描，碘帕醇为非离子造影对比剂，注射速率（3~3.5）ml/s，延迟时间：动脉期延迟时间25~28s，门脉期70~75s，实质期5~10min[3]。所用仪器设备为128层螺旋VCT扫描机，型号GE light speed。 2结果
*国家自然科学基金资助项目（编号：8106016），广西科学基金资助项目（编号：2010GXNSFD013048） △通信作者。E －mail ：gwongluo@yahoo．com 肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌 细胞株的筛选 * 蒋日婷，晁耐霞，马平，李金平，罗国容△ 广西医科大学组织胚胎学教研室（南宁530021） 【摘要】目的 筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的 可能作用奠定基础。方法 选择4种人肝癌细胞株（BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721和QGY －7703）及1种成人正常肝细胞株（HL －7702），培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后，采用免疫细胞染色技术和Western blot 的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株。结果 免疫细胞染色显示， GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达。GCF2蛋白在肝癌细胞BEL －7404、HepG2、SMMC －7721和QGY －7703的表达要强于正常肝细胞HL －7702，其中以BEL －7404的表达量最高。通过Western blot 检测，BEL －7404的GCF2相对表达量为0.875?0.134，较其他细胞株高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论 BEL －7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量最高，可以作为下 一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料。 【关键词】肿瘤相关抗原；GCF2；肝癌；蛋白表达 GCF2（GC binding factor 2）是一个转录抑制因子，能 够抑制多个下游基因，比如EGFR 、TNF －α、PDGF －A 链和Igf2等的转录，参与细胞增殖、周期和凋亡等进 程 ［1－6］ 。本课题组前期用SEREX 技术筛选人肝癌组织构建的cDNA 文库，发现2个克隆与GCF2的片段同 源，提示GCF2可能是肝癌相关抗原［7］ 。目前，尚未见文献报道GCF2基因在肝癌中的作用的研究，因此，2010年11月至2011年3月，本实验将采用免疫细胞化学技术检测4种人肝癌细胞和1种成人正常肝细胞中GCF2的表达情况，并且通过Western blot 筛选出GCF2高水平表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用奠定基础。1材料与方法 1．1 材料人肝癌细胞株BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人肝细胞株HL －7702，均购于上海细胞生物学研究所。实验仪器均由广西医科大学基础实验中心提供：CO 2恒温培养箱（Thermo ）、倒置显微镜（OLYMPUS ）、台式高速冷冻离心机（SIGMA ）、紫外分光光度计（UV2000I Tanon ）、电泳仪（北京六一仪器厂）、半干式转膜仪（BIO －RAD ）。细胞培养基高糖DMEM 及RPMI 1640均购于HyClnoe 公司。磷酸缓冲液（PBS ）、 DAB 显色试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司。蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司。GCF2抗体购自美国Santa 公司。辣根过氧化物酶（HRP ）标记的山羊抗鼠IgG 购自上海长岛生物试 剂有限公司。GAPDH 抗体、ECL 发光试剂购于碧云天生物技术研究所。 1．2 细胞培养 将4种肝癌细胞分别培养在含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培养液中，将成人正常肝细胞 株HL －7702培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培 养液中，并置于37?、 5%CO 2及饱和湿度的恒温培养箱中培养， 隔天更换培养液。1．3细胞爬片的制作及免疫组织化学检测 将生长 状态良好的人肝癌细胞株BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人正常肝细胞株HL －7702接 种于置有圆形盖玻片的12孔培养板内，接种密度为1?104个细胞/孔，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 及RPMI 1640培养液在37?、5%CO 2条件下培养。待细胞长到60% 70%融合时，用0.01mol /L PBS 洗涤1次，加入4%多聚甲醛室温固定15min 。将盖玻片取出，粘贴在载玻片上，按照常规免疫组织化学方法，加 入1?100稀释的GCF2抗体， 4?湿盒内温育过夜。PBS 洗片后滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG ，室温 下孵育30min ， PBS 洗片后进行DAB 显色2 3min 。常规50% 100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，香柏油 封片，显微镜下观察并拍照记录结果。以PBS 替代一抗作为阴性对照。采用Image －Pro Plus version 6.0软件分析阳性着色光密度。1．4 总蛋白的提取及Western blot 的检测常规细胞培养，当细胞贴壁生长达90%时，按蛋白提取试剂盒 操作方法提取细胞总蛋白， 分装后置于－80?保存。取4个细胞株的蛋白20μg 与1/4体积的5?SDS 上样缓冲液混合，100?沸水浴5min ，冷却后点样进行 SDS －PAGE 电泳分离。电泳完毕，按照半干转移仪公司提供的说明进行印迹操作，将电泳分离蛋白转移到PVDF 膜上。转移膜用含50g /L 脱脂牛奶的PBST （0.01mol /L PBS +0.5%Tween －20）室温封闭5h 。GCF2抗体1?200稀释液4?孵育过夜；按1?5000稀 · 1551·广东医学2012年6月第33卷第11期Guangdong Medical Journal June．2012，Vol．33，No．11
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称 Hep G2 [HepG2] 细胞中文名人肝癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。培养基 MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清 10%FBS 其它因子 1%NEAA 传代方法 1:4~1：6传代；每周2次。传代情况 C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 细胞英文名称 SMMC-7721 [SMMC7721] 细胞中文名人肝癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。培养基 RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清 10%FBS 其它因子无 传代方法 1:3传代；3~4天1次。传代情况 C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性细胞英文名称 Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基 MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清 10%FBS 其它因子无 传代方法 1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况 C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-）国内还有，： 小鼠肝癌细胞 Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞 HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株 H22 人肝癌细胞 HHCC 人肝癌细胞 PLC/PRF/5 人肝癌细胞 HB611 人肝癌细胞 BEL-7402 人肝癌细胞 QGY-7701 （有疑问细胞待定）人肝癌细胞 QGY-7703 （有疑问细胞待定）人肝癌细胞 BEL-7404 人肝癌细胞 BEL-7405 人高转移肝癌细胞 HCCLM3 人肝癌细胞 Hep 3B2.1-7 人肝癌亚力山大细胞 PLC/PRF/5 人肝癌细胞 SMMC-7721 人肝癌细胞 Homo Spaniens cell line Hep B1.2 抗人肝癌单抗HAb18杂交瘤细胞 HAb18 抗人肝癌单抗F11杂交瘤细胞 F11 细工-CRO