《分子生物学检验技术》教学大纲 第二版 《分子生物学检验技术》教学大纲是依据梵绮诗主编的《分子生物学检验技术》第一版的内容，结合临床实验室的具体应用和我校教学的具体条件制定的。重点突出与临床分子诊断应用密切相关的分子生物学技术和知识点的介绍和讲解。本学科教学总时数为32学时，其中包括26学时理论，6学时实验课和国庆放假4学时。 第一章 临床分子诊断绪论 [目的要求] 了解 课程设置；分子诊断在临床中的应用 [教学时数] 讲授4学时。 [讲授内容] 分子诊断在临床中的应用和发展 第二章 生物大分子的分离纯化 [目的要求] 掌握 基因组DNA分离的常用方法，如酚抽提法；RNA分离纯化方法，如酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法；质粒DNA分离纯化方法，如加热法和碱裂解法；固相支持物吸附法 了解 核酸的一般理化性质；核酸进一步纯化的方法 [教学时数] 讲授4学时。 [讲授内容] 核酸的理化性质；核酸分离纯化的原则；核酸分离纯化的设计；基因组（高分子量） DNA的分离纯化；质粒DNA的分离纯化；RNA的分离纯化;磁性硅胶吸附技术 [自学内容] 蛋白质分离纯化的一般方法
第三章 聚合酶链反应技术 [目的要求] 掌握 PCR的概念和基本原理；PCR反应体系的组成；实时荧光定量PCR 的概念、原理和荧光示踪方法；外标定量法的原理 了解 PCR及有关技术的发展演变历史；PCR产物的检测方法；PCR技术的发展变化和PCR相关的扩增技术；临床PCR 实验室的标准化和质量控制 [教学时数] 讲授6学时 [讲授内容] PCR及有关技术的发展历史；PCR的概念和基本原理；PCR反应体系的组成和各组分介绍；PCR扩增产物的检测；实时荧光定量PCR概念和各种荧光示踪方法的介绍；实时荧光定量PCR定量理论和基本知识；外标定量法的原理及其优缺点；PCR 技术的变化和发展及PCR相关的扩增技术；PCR实验室的标准化和实验室的质量控制 [自学内容] PCR 反应条件的优化；PCR 产物的克隆 第四章 核酸分子杂交技术 [目的要求] 掌握 分子杂交的基本原理；核酸探针的设计；固相杂交方法的适用范围；Southen/Northen印迹杂交。 了解 探针的检测核酸探针的标记；探针的纯化；其他杂交技术；限制性内切酶多态；SNP；chips [教学时数] 讲授4学时 [讲授内容] 核酸变性定义，Tm值定义，影响因素；核酸复性； 分子杂交的概念，同源性；核酸探针定义；核酸探针的种类，制备，优缺点；核酸探针的标记，缺口平移，
1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变，为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。 2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。（1）感染性微生物的检测。如：用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等。（2）基因突变的检测。如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP)技术检测地中海贫血基因突变。 （3）法医学检测。如：用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。 （4）基因异常表达的检测。如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。 （5）基因定位。如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。 3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。 4、基因：是基因组中一个功能单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。
6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位。 7、质粒：是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。 8、转座因子：又称为转座元件，是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。 9、原核生物基因组的结构特征： （1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。 （2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列。 （3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。（4）具有编码同工酶的基因。 （5)含有可移动的DNA序列。 10、病毒基因组的结构特点： （1）与细菌和真核生物基因组相比，病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。 （2）病毒基因组的核酸类型较多，有双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA；有环状分子，也有线性分子。但无论是哪种核酸类型，一种病毒颗粒中核酸成分只能为一种，或
分子生物学检验技术 _______期日______ _名___签__任__主__室__研_教名课姓任_ _ ____________名__签__员_教号题学出_ ________________员__教_课次任班学__教_ _ _ _ _ _ ______________次__班_核别考队______数人核考湖北医药学院2011-2012学年第二学期《分子生物学检验技术》期末考试试卷湖北医药学院 A、内含子 B、外显子 C、DNA D、质粒 E、重叠基因 … ………《分子生物学检验技术》期末考试试卷(C卷)8、对染色体端粒进行的显带称为 A、C显带 B、D显带 C、G显带 D、Q显带 E、T显带 ……… 9、染色质和染色体是 ……题目一二三四五总分核分人复查人A、同一物质在细胞中的不同时期的两种不同的存在形式B、不同物质在细胞中的不同时期 ……得分的两种不同的存在形式C、同一物质在细胞的同一时期的不同表现D、不同物质在细胞的… 同一时期的不同表现E、染色质是染色体的前体物质 ……… 10、物理图是以什么作为图距 线…评卷人得分 A、摩尔 B、摩尔根 C、纳米 D、重组频率 E、kb …… 一、A型题（40小题，每小题1分，共40分） …11、下列哪一项不属于真核生物基因组的特点 … ……1、A、重复序列B、断裂基因C、单拷贝序列D、DNA多态性E、多顺反子结构
HTLV基因组中tax基因编码的蛋白是 …12、据调查，糖尿病的单卵双生同病率为84％，双卵双生同病率为37％，根据遗传病研究的 ……A、对病毒的结构蛋白的表达有调节作用B、对病毒的调节蛋白的表达有调控作用C、一种…反式激活因子D、激活细胞的IL-6基因E、激活细胞的IL-2基因双生子法，可以计算出糖尿病的遗传率为 …封…2、A、100％B、75％C、60％D、50％E、25％ 腺病毒基因组不正确的是 …13、两条非同源染色体同时发生断裂，断片交换位置后重接，结果造成 …A、腺病毒基因组是环状双链DNA B、两条链分别称为轻链和重链C、每条链的5’端都…与蛋白质结合D、腺病毒DNA采用半保留复制方式E、腺病毒可引起人类许多急性感染 A、缺失 B、倒位 C、重复 D、插入 E、易位 ………3、基因图是指 14、线粒体基因组DNA的结构一般认为类似于 ……A、EST B、STS C、STR D、YAC E、STR A、原核生物 B、大肠埃希菌 C、质粒 D、病毒 E、真核生物 ………4、α -卫星DNA可由哪种限制性内切酶消化获得 15、发生基因点突变的结、直肠癌中约80％的突变位于 密…A、Alu B、HindⅢC、HinfI D、KpnI E、EcoRI A、K-ras12位密码子突变 B、K-ras13位密码子突变 C、K-ras61位密码子突变 D、H-ras12…位密码子突变 E、N-ras61位密码子突变 ……5、下列哪项不属于Alu家族的特点 …16、与遗传性高发乳腺癌相关的基因是 …A、属于短分散重复片段B、有AGCT序列C、能被AluI切割D、无种属差异E、有调…控作用 A、APC B、BRCA C、DCC D、FHIT E、Rb
疾病分子生物学诊断的研究进展 摘要：随着分子生物学技术的的不断进步，许多疾病便转入了基因治疗阶段，而分子生物学技术的不断进步，也恰好为医药领域的发展建立了良好的基础，这也必将会为各种疾病的治愈提供一个更新更好的解决方案。而本文则就白血病、胆管癌和肺结核三种疾病的分子生物学诊断研究进展进行了讨论。 关键词：分子生物学疾病研究进展 前言： 利用分子生物学的技术方法检测受检者体内 DNA 或 RNA 的结构变化，从而对疾病作出诊断的方法［1］与传统方法相比较，其具有非常显著的优越性，既可以直接对个体基因状态进行检测，又可以对表型正常的携带者以及特定疾病的易感者作出诊断和预测。因此分子生物学技术能广泛应用于白血病、胆管癌和肺结核等几种疾病的诊断治疗。因此分子生物学的诊断治疗已成为研究热点，现将其研究进展情况综述如下。 1．白血病的分子生物学诊断研究进展[2] 1.1白血病简介 白血病是一类常见和多发的造血干细胞克隆性恶性疾病，形态学分型为其主要诊断方法，但对于一些形态不典型的病例易误诊，近年来临床研究发现，大部分的白血病存在着某种染色体易位，而易位会产生新的融合基因。癌基因的扩增、原癌基因点突变或抑癌基因的失活等。 1.2荧光原位杂交技术( FISH) 目前 FISH 广泛用于检测染色体重组和标记染色体，检测多种基因疾病的染色体微缺失和用于非整倍体疾病的产前诊断.其基本原理是用标记了荧光素生物素或者地高辛的单链 DNA 探针和与其互补的 DNA 退火杂交，通过检测附着在玻片上的分裂中期或间期细胞上的核 DNA 位置反映相应基因的状况适用于多种临床标本( 如血液骨髓组织印片和体液，甚至石蜡包埋的组织标本等)，具有直观、方便、敏感、可量化、方法多样和适应不同检测目的等优点，
常见致病菌的检测 摘要：近年来食品药品安全的问题屡见不鲜，做好致病菌的检测，是防范于未然的措施，因而显得尤为的重要，也越来越受到人们的重视。这就要求我们对一些常见的致病菌检测技术的要有一定的了解。 关键词：致病菌，肠球菌，霉菌和酵母菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。一.肠球菌 （1）、形态与染色【1】 肠球菌为革兰阳性（G+）球菌,广泛分布于自然环境及人和动物消化道内。20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。因此，从分子水平对肠球菌致病因子、肠球菌引起的感染机制与治疗的研究显得尤为重要。肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。本菌对营养要求较高，在含有血清的培养基上生长良好。 （3）致病性【1】 一般而言，肠球菌的毒力不高。与金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌相比，肠球菌对大多数动物的半数致死量（LD50）值相当高，而且肠球菌很少引起蜂窝织炎和呼吸道感染。 肠球菌只有在宿主组织寄殖，耐机体非特异及免疫防御机制，并引起病理改变，才能导致感染。粘附测定显示肠球菌可通过细菌表面表达的为粘附素，吸附至肠道、尿路上皮细胞及心脏细胞。这些粘附素的表达亦受细菌生长环境的影响。另外，肠球菌可产生一种聚合物质（系一种蛋白表面物质，可聚集供体与受体菌，以利质粒转移），在体外增强其对肾小管上皮细胞的粘附。 细菌生长环境亦影响肠球菌与多形核白细胞反应。血清中生长的肠球菌与多形核白细胞反应较弱，而肉汤中生长的细菌反应较强。体外多形核白细胞对肠球菌的有效杀灭作用需血清补体蛋白参与，而抗肠球菌抗体可增强该作用。 （4）、肠球菌属主要检测步骤如下：【2】 方法一：肠球菌平板计数法检验程序 25g (mL) + 225 mL 缓冲蛋白胨水
生物传感器在检测食源性致病菌上的应用 王剑平１＊，李杜娟１ （１．浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 ３１００２９） 摘要：最主要的几种食源性致病菌像大肠埃希氏菌、李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等不仅威胁到人们的生命安全，还会造成巨大的社会经济损失。生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测的特点。根据生物传感器的信号转化器可分为光学式、电化学式、压电式生物传感器等；在检测食源性致病菌方面生物传感器表现出能够满足实际应用的发展潜力，但是生物传感器目前仍面临并需要解决一些问题.最后提出了实际检测应用中对生物传感器的要求。 关键词：致病菌，生物传感器，光学，电化学，压电 中图分类号：TS207.3 0 引 言 近年来，食源性致病菌引发的流行性疾病越来越受到社会关注。大肠杆菌Ol57：H7（E.coli Ol57：H7）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等被认为是几种最厉害的食源性致病菌，它们引起的疾病，严重时都可导致死亡。美国疾病控制和预防中心（CDC）估计，美国每年由食源性致病菌造成大约7,600万例疾病，32.5万例住院治疗，5200例死亡[1]。其中由已知致病菌引起的食源性疾病大约1,400万例，6万例住院治疗和1800例死亡。这表明致病菌是传染疾病的一种根源。美国农业部（USDA）估计，由食品致病菌造成的医疗花费和生产力损失，每年将会达到29-67亿美元[2]。致病菌入侵到美国的牲畜、家禽和农作物，不仅使食品的价格上升，还降低了食品出口量，这将使国家损失数十亿美元的税收[3]。在我国，1986年在江苏徐州市首次发现了E.coli Ol57：H7的感染病人[4]，后来又在山东省发现了 E.coli Ol57：H7，1999至2000年，在中国东部部分地区发生了较大规模的E.coli Ol57：H7爆发，可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次，对我国经济造成了重大损失。因此，建立一种快速、方便、可靠的食品安全检测技术，以防止传染疾病和经济损失是一个迫切的需求。? 几种快速检测技术已经用于检测致病菌，包括聚合酶链反应法（Polymerase Chain Reaction ，PCR）[5,6,7,8,9]，酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent ?收稿日期：修订日期： 项目基金：美国农业部国际合作项目（USDA/FAS/ICD/RSED/SCRP） 作者简介：王剑平（1960－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：农产品无损检测和生物传感器。 通讯地址，浙江大学生工食品学院杭州市凯旋路268号，310029。Email: jpwang@https://www.doczj.com/doc/0017083844.html, Asay ，ELISA）[10,11]。因为PCR和ELISA需要通过富集、分离、形态学检测、生物化学和血清学测试来鉴别食品致病菌，所以这些方法虽然比传统方法需要的检测时间缩短了不少，但还是达不到实际中的要求。实践中需要更快、更灵敏、更可靠的检测技术，生物传感器就是一种有望达到这种要求的技术。 １生物传感器的基本原理 生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合，从而检测目标化合物的分析装置。生物传感器的结构一般由两个主要组成部分：其一是生物分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生物活性物质（如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等）；其二是信号转换器（换能器），主要有电化学电极（如电位、电流的测量）、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等。如Fig1所示，其基本原理为：当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物（或光、热等）通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。生物传感器的选择性取决于它的生物敏感元件，而生物传感器的其他性 图１ 生物传感器原理图 Fig 1. Principle of operation for a biosensor 生物传感器与其他化学、物理传感器的关键不同之
医学检验本班《分子生物学检验技术》试卷 一. 选择题（在备选答案中选择一个最佳答案,每题2分,共20分）: 1. 在核酸提取时,常需要使用氯化钠,醋酸钠等盐溶液,真正的目的是（） A. 中和核酸的负离子,使其易于沉淀 B. 调节PH值 C. 保持核算的完整性 D. 提高核酸的浓度 E. 无特定目的 2. 在一个DNA分子中,如G所占摩尔比为17.2%,则A所占摩尔比为（） A. 82.8% B. 32.8% C. 17.2% D. 65.6% E. 无法计算 3.下列那项不是扩增反应所必需的?（） A. 引物和模板 B. dNTP C. Mg++ D .DNase E. 缓冲液 4. 下列那项是分子生物学技术形成的理论基础?（） A. 基因结构与功能的关系 B. 基因结构变异与疾病的关系 C. 病原微生物的基因结构特征 D. 基因的表达.调控与疾病的关系 E. 以上皆是 5. 分子生物学检验技术主要包括那些技术?（） A. 核酸分子杂交技术 B. DNA测序技术 C. PCR技术 D. DNA重组技术 E. 以上全是 6. 下列哪项检测需应用分子生物学检验技术?（） A. 肝功能检测 B.乙肝两对半检测 C. 乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测 D. 肿瘤细胞培养 E. 病原微生物培养 7. 在核酸的分离纯化过程中,为保证其一级结构的完整性,应采取（） A. 尽量简化分离步骤,缩短提取时间 B. 适当延长提取时间 C. 在37摄氏度条件下进行 D. 加入Mg++,Ca++等二价金属离子 E. 以上全是 8. 有一核酸样品,测得A260/A280=2.0,请问该样品属于哪类核酸样品?（） A. DNA B. RNA C. 是DNA,但有蛋白质污染 D. 是RNA,但有蛋白质污染 E. DNA和RNA 9. 在RNA提取和纯化过程中,为避免Rnase污染而导致RNA的降解,应采取（）
分子生物学的应用及发展 摘要：本文在文献检索的基础上，对分子生物学的发展简史，基本原理，研究领域等作了简单介绍，阐述了分子生物学在人们日常生活中的应用并结合药学专业着重讨论了其在药学及中药开发发面的应用，并进一步对分子生物学未来的研究技术、方向和前景做了展望。 一前言 生物以能够复制自己而区别于非生物。生命现象最基本的特征是进行“自我更新”。进行“自我更新”体现了一种最高级和最复杂的运动状态。这种运动就是生物机体从环境中摄取物质和能量，以更新本身的物质组成，而山现生长、繁殖，在这样的过程中保证了将自身的特征传给历代；同时也不断地向环境输送一些物质和释放能量。在生物机体的组成物质中，防水分外，有各种无机盐类和各种有机化合物。其中生物大分子——核酸和蛋白质在进行自我更新运动中，以其功能的重要性占第一位。为探索生命现象的本质问题，产生了分子生物学这一学科[1]。 分子生物学(molecular biology)是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域[2]。 分子生物学的最终目标是远大的，从产生基本细胞行为类型的各种分子的角度，来理解这五类行为类型：生长、分裂、分化、运动和相互作用。即分子生物学力图完整地描述细胞大分子的结构、功能和相互联系，从而理解细胞为什么要采取这种方式[3]。 分子生物学作为一门新兴的边缘学科。它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用，促使人们对生物学等生命科学的认识从细胞水平进入分子水平。在农业、畜牧、林业、微生物学等领域发展十分迅速，如转基因动植物等。在医学领域，为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径，使医学科学中原有的学科发生分化组合，医学分子生物学等新的学科分支不断产生，使医学科学发生了深刻的变革，不认识到这一点就很难跟上科学发展的步伐。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 二分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为三个阶段[4-7]：
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/0017083844.html, 乳制品中常见食源性致病菌检测技术的研究进展 作者：刘娜周靖娜 来源：《农家致富顾问·下半月》2019年第05期 摘要从整体结构来分析，乳制品中常见食源性致病菌主要包括阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌和李斯特菌，一旦乳制品内这五种病菌超标，必然会诱发严重的乳品安全问题。对此，需要运用食源性致病菌检测技术对所有病菌进行严格检测与控制。本文将综合探讨乳制品中常见食源性致病菌检测技术的研究进展，并提出个人见解。 关键词乳制品；常见食源性致病菌；检测技术；检测工作人员 近年来，乳制品安全问题频发，进而引起了国家政府与广大国民对乳制品食源性致病菌检测工作的高度重视。目前，最常用的食源性致病菌检测技术体系有三种，分别是免疫学技术、分子生物学技术、培养法检测技术，这三大技术各具优势，对检测和控制乳制品常见食源性致病菌至关重要。 1 免疫学技术 免疫学（immunology）原本是研究身体对致病微生物的防御能力以及防御能力失调的科学。从发展的视角来看，1796年，E.詹纳使用疫苗预防天花之后，免疫学研究才开始全面深入认知和研究微生物在疾病中的作用以及抗体和反抗原细胞的形成、动员、作用和相互作用所扮演的角色。免疫学的范围涵盖了变态反应的治疗、器官移植后的免疫抑制以避免排异反应，同时，包括对自体免疫疾病和免疫缺陷的研究。对于乳制品常见食源性致病菌检测工作来讲，免疫学技术是在依托免疫学的基础上分别形成了免疫磁珠技术、酶联免疫吸附技术、免疫胶体金技术和酶联荧光技术。其中，免疫磁珠技术的全称是免疫磁珠分离技术，该技术主要是在免疫磁珠表面偶联特异性抗体，等到被测样品和磁珠产生特异性结合，并经过磁场作用之后，复合物会滞留，实现抗原抗体磁珠和其他成分的有机分离，最终病菌也会被分离与浓缩。在乳制品常见食源性致病菌检测工作中，免疫磁珠技术能够精确检测脱脂乳、沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌。酶联免疫吸附技术主要是运用不同的PCR技术来确定循环数和检出限，并精确检测幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌。免疫胶体金技术是根据被酶催化后的样品颜色来判断阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌和李斯特菌等常见食源性致病菌所占比例。酶联荧光技术原理是抗体或者抗原和酶以交联剂相结合后生成酶标抗体或者抗原，同时，和固相载体上的抗原抗体产生特异反应后进而形成能保持活性的免疫复合物。而且，酶联荧光技术兼具免疫荧光法和放射免疫法的优势，特异性和灵敏度极高，检测速度很快，能够在短时间内检测大量的样品。 2 分子生物学技术
食品中食源性致病菌监测结果分析 了解璧山地区各类食品中食源性致病菌的污染状况,为有效预防食源性疾病提供科学依据。方法按照国家标准方法对7项食源性致病菌进行分离与鉴定。结果共抽检食品样品160件,检出致病菌9株,总检出率为5.6%,其中副溶血性弧菌5株,金黄色葡萄球菌2株,沙门菌2株。结论动物性水产品的致病菌检出率较高,副溶血性弧菌污染较为严重,沙门菌和金黄色葡萄球菌有不同程度的污染,因此食品监管部门应加强对其进行监督管理,严格控预防和控制食源性疾病的发生,保证人民群众的身体健康。 [关键词] 食品安全是关系着人民群众的身体健康和生命安全、经济健康发展、国家安定和社会发展与稳定的重大问题。食品污染是影响食品安全的主要问题,其中病原微生物引起的食源性疾病是最常见的致病因素之一。本研究主要收集食品中食源性致病菌的监测,以了解不同致病菌在各类食品中的污染程度及分布状况，寻找璧山地区容易引起食源性疾病的重点食品和重点致病菌,以预防和控制食源性疾病的发生,同时又为相关部门的监管部门提供参考。 1 材料与方法 1.1样品来源样品来源于2010-2011年本县的农贸市、大型超市、宾馆饭店、快餐店等,共采集样品160件。 1.2 样品种类与监测项目食品样品包括熟肉制品、动物性水产品、生畜肉、即食非发酵性豆制品、中式凉拌菜、速冻熟制米面、生食类蔬菜、糕点及饼干、米粉、凉皮、米线、盒饭、鲜榨果蔬汁等，监测项目涉及沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌O157、副溶血性弧菌、志贺菌、蜡样芽胞杆菌。 1.3检测方法检验方法按《食品安全国家标准食品微生物学检验》GB4789 的现行有效方法进行操作(沙门菌[1]、金黄色葡萄球菌[2]、单核细胞增生李斯特菌[3]、大肠埃希菌O157[4]、副溶血性弧菌[5]、志贺菌[6]、蜡样芽胞杆菌[7])。 1.4试剂与仪器设备所用干粉培养基由北京路桥技术有限责任公司购买；显色培养基由北京科玛嘉公司购买；API 生化条由法国生物梅里埃公司生产；沙门菌属诊断血清由宁波天润生物药业有限公司购买。所用培养基、试剂均在产品有效期内使用。 1.5 质量控制在检测样本的同时用已知阳性菌株( 都柏林沙门菌50761、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、大肠埃希菌O157ATCC43888、副溶血性弧菌TCC17802、蜡样芽孢杆菌由重庆市疾控中心以往质控考核中分离所得) 作跟踪对照，确保所用培养基、试剂、仪器均正常无误。 2 结果 2.1 不同种类的食品中的食源性致病菌的检测情况2010- 2011年共检测11类、160份食品,检出食源性致病菌9株,检出率为5.6%。其中,以动物性水产品检出率最高为16.7%( 5/30) , 其次为中式凉拌菜和生畜肉为10%(1/10)、即食非发酵性豆制品为5%(1/20)、熟肉制品为5%(1/20)。生食蔬菜、蛋制品、速冻熟制米面、生食蔬菜、糕点及饼干、米粉、凉皮、米线、盒饭、鲜榨果蔬汁均未检出相关致病菌(表1)。 3讨论 从表1来看,两年检测的160件11类食品样品中,食源性致病菌的总检出率为5.6%，与沈阳地区总检出率5.88%报道相一致[8］,低于全国其他省市报道[9],但表明我县市售食品存在食源性致病菌污染。其中,以动物性水产品是致病菌污染的高危品种,因此食品监督部门应加强
第二章临床分子生物学检验标志物 1、分子生物标志物:指可以反映机体生理,病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子,就是生物标志物的一种类型。 2、中心法则:指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录与翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这就是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)与在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)就是对中心法则的补充。 3、基因组:就是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质,包括基因与非编码DNA。 4、原核生物基因组特征: 1)原核生物基因组较小:大小一般在106—107碱基对之间; 2)原核生物的类核结构:原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区,没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下,以一定的形式盘曲,折叠包装起来,形成类核; 3)原核生物的操纵子结构:原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号,共同组成了一个基因表达单位,即操纵子结构; 4)原核生物的结构基因:原核生物的结构基因中无内含子成分,多数就是单拷贝基因,基因与基因之间有重复序列存在; 5)具有编码同工酶的基因:这类基因表达产物的功能相同,但基因结构不完全相同; 6)含有可移动DNA序列:可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组,改变生物体的遗传性状,使生物体更适应环境的变化; 5、质粒:指细菌细胞染色体以外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子; 6、人类基因组包括细胞核内的核基因组(3X109bp)与细胞质内的线粒体基因组(16569bp),人类基因组中存在大量的非编码序列与重复序列; 7、小卫星DNA:由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次,形成的1—5bp 的短DNA,又称可变数目串联重复; 8、微卫星DNA:核心序列为1—6bp,可以重复上百次,又称短串联重复; 9、多基因家族:指由某一祖先基因经过重复与变异所产生的一组基因,在多基因家族中,某些成员并不产生有功能的基因产物,这些基因称为假基因; 10、多态性:当某种变异相对常见,在群体中的频率高于1%时,则称为多态性,频率低于1%的
食源性致病菌快速检测方法研究报告 发表时间：2011-05-13T14:13:40.207Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：高友中 [导读] 目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。 高友中（湖南省岳阳县疾病预防控制中心 414100） 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0106-02 【摘要】目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。方法样品经增菌后，用ELISA法及国标法对样品中的沙门菌进行初步检测，并比较ELISA法检测结果与国标法灵敏性、特异性、符合率。结果检测200份奶类制品和肉制品，经ELISA法检测阳性率为8.3%，国标法阳性率为6.7%。ELISA法敏感性、特异性分别为100%、97%，与国标法符合率达99.3%。结论 ELISA法可快速、方便的对食品中沙门菌的污染情况进行初步检测，灵敏度高、特异性好，与国标法符合率高。适用于食品中沙门菌的初步检测。 【关键词】奶制品肉制品沙门菌 ELISA 沙门菌为常见的引起食源性疾病爆发的病原菌，在我国微生物性食物中毒中一直位居首位，而受沙门菌污染的奶、肉制品为造成人类感染的主要来源，因此沙门菌一直为医疗卫生、食品卫生及商检部门重点检验对象之一[1]。本研究采用ELISA法检测奶、肉制品中沙门菌，并与国标法进行比较研究，现报道如下： 1 材料与方法 1.1实验材料 奶、肉制品分别来自本市8家不同超市，包括70份奶及奶制品样本，60份肉及肉制品样本。取样均采取随机抽样的方法进行。每份样品250ml或250g，经无菌包装后置冷链保存送实验室检测。 缓冲蛋白胨水，氯化镁孔雀绿增菌液，四硫酸钠煌绿增菌液，亚硒酸盐胱氨酸增菌液，亚硫酸铋琼脂，DHL琼脂，HE琼脂，WS琼脂，SS琼脂，三糖铁琼脂，蛋白陈水、靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2)，氰化钾（KCN）培养基，氨基酸脱梭酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基，沙门氏菌因子血清。均按国标相关规定进行。 ELISA相关试剂均购自试剂公司。 1.2实验方法 样品按国标法相关规定预先增菌。样品处理后于36°C培养4h，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液中，42°C18-24h，另取10ml转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，36°C18-24h。 ELISA法简要步骤如下：特异性抗沙门菌单克隆抗体包被，加入待见样品检测。显色于酶标仪上读取OD值。 国标法简要步骤如下：经增菌后，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板和EHL琼脂平板。36°C培养18-24h，观察菌落生长情况。挑选可疑菌落接种于三糖铁琼脂，鉴别反应结果。如出现异常结果，按国标相关规定选择补做甘露醇和山梨醇试验，ONPG等。 1.3数据分析 参考田素娟[1]等的方法进行。即利用检验通用的计算方法，并国标法比较实验的敏感性、特异性、符合率。 2 结果 2.1ELISA及国标法检测结果 用ELISA法同步检测份奶、肉制品的沙门菌污染情况，采用国标法进一步验证，结果见表1。 表1沙门菌污染情况检测 2.2ELISA法与国标法敏感性、特异性、符合率计算结果 表2ELISA法与国标法比较 3 讨论 3.1常规检测沙门菌方法 目前，沙门菌常用检测方法有：（1）酶快速反应检测技术。包括快速酶促反应显色培养基及自动化微生物分析仪两种方法。VITEK AMS自动微生物检测系统对细菌鉴定是基于细菌的微量生化反应，可鉴定405种细菌。（2）以免疫学为基础的检测技术。包括酶联免疫吸附实验（ELISA）；免疫磁分离技术，如王海明[2]等报道的使用抗沙门氏菌免疫磁珠经增菌后于VITEK全自动生化鉴定仪和荧光PCR分子检测确认；免疫胶体金技术等。（3）以核酸为基础的检测技术，如杨俊超[3]等报道的使用实时荧光定量PCR与常规PCR比较研究，其敏感性、特异性均较好；依赖PCR的DNA指纹图谱技术；随机引物扩增DNA多态性（RAPD）；基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增；多重PCR检测技术；NASBA；基因芯片技术等。 3.2本研究采用检测方法 本研究采用ELISA法快速检测奶及奶制品、肉及肉制品中沙门菌的污染情况。其敏感性、特异性较高，且与国标法符合率较高。一般24h 之内可以出检测结果。其不足之处在于：（1）不能定量检测沙门菌的含量，只能做定性分析，即是否存在沙门菌污染，但不能测得污染量的大小。后续研究考虑通过设置标准沙门菌对照（蛋白含量已知）的情况下，设立不同稀释度，然后比较样品各组OD值，用统计软件作出标准曲线，进而推算出沙门菌含量。（2）检测结果不太稳定，有可能出现假阳性结果。ELISA实验普遍存在抗体效价下降很快的通病，如
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的 基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46, XX（XY）/47 ，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14 ，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。 分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法 6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析 等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、 F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。 珠蛋白合成障碍性贫血有六种，主要的两种是a珠蛋白生成障碍性贫血和B珠蛋白生成障碍性贫血，基因突变是主要发病原因。&基因多态性有哪些的临床应用？（P4）
牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。 在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至 达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有: 奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。 志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重 HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。 进一步经过引物筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。对多重LAMP反应体系进行特异性和灵敏度检测。 在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。在灵敏度检测中单增李斯特菌
食源性致病菌及微生物检测技术的调查报告 目录 前言 (2) 1 食源性致病菌概述 (2) 1.1 食源性致病菌的定义及种类 (2) 1.2 食源性致病菌对人体健康的影响 (3) 1.3 食源性致病菌引起的食品安全问题 (3) 1.3.1 国际情况 (3) 1.3.2 国内情况 (3) 1.3.3 食源性疾病不断上升的原因 (5) 2 国内外的食品微生物标准检验体系 (5) 2.1 国外主要食品微生物检测体系 (6) 2.2 国内主要食品微生物检测体系 (6) 2.3 常见食源性致病菌检测执行标准 (6) 2.4 国标中致病菌常规检测方法流程 (7) 3 微生物检测技术的发展现状 (8) 3.1 常规微生物快速检测技术现状——传统计数改良法 (8) 3.2 常规微生物快速检测技术现状——快速检测微生物数量的新方法 (10) 3.2.1 ATP生物荧光法 (10) 3.2.2 检测微生物产生的CO2量的方法 (10) 3.2.3 电化学方法（电导率法或电阻抗法） (10) 3.2.4 颜色变化 (11) 3.2.5 流式细胞技术 (11) 3.2.6 热量法 (12) 3.2.7 放射测量法 (12) 3.3食源性致病菌快速检测方法 (12) 3.3.1 显色培养基法 (12) 3.3.2 免疫学方法 (13) 3.3.3分子生物学检测方法 (15) 4 小结 (16)
前言 近年来我国食品安全频频出现问题，食品安全问题已经成为生活中不可不谈的话题。 同时食品引发的中毒事故频发，媒体曝光度增加，消费者对食品安全的重视程度与日俱增，国家也加大了食品安全问题的整顿和监管力度。根据国家食品药品监管总局法制司19日发布的通知，国务院已将《食品安全法》修订工作列入2013年立法计划。 影响我国食品安全的最主要因素是微生物污染和化学性物质污染，而由病原微生物引 起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。化学污染监管，将进入长期化和制 度化；食源性疾病，这一食品安全隐患因微生物性食物中毒事件屡次发生，它也不会再继 续“潜伏”。在由卫生部、工业和信息化部、商务部、工商总局、质检总局、粮食局和食品药品监管局联合制订的《2013年国家食品安全风险监测计划》中，对食品微生物及其致病因子、食源性疾病监测制定了全面而详细的监控计划。食源性疾病逐渐也引起越来越多专家、学者的广泛关注，中国疾病预防控制中心的陈君石院士、刘秀梅教授等在多个场合多 次倡议重视微生物引起的食源性疾病。在这样的社会背景下，我国食源性致病菌检测链条 的发展有着巨大的空间。快速而准确检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食 品安全的首要任务。 1 食源性致病菌概述 1.1 食源性致病菌的定义及种类 我国食品卫生微生物检验项目包括一般性检验项目和致病菌两大类。一般检验项目包括菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母等指标。 食源性致病菌，指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质，直接或间接导致人患病。常见细菌性食物中毒的病原微生物有：致病性大肠杆菌（特别是出血性大肠杆菌O157：H7）；沙门氏菌属；志贺氏菌；致病性弧菌（包括：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）；金黄色葡萄球菌及其肠毒素；近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李斯特菌、空肠弯曲菌等。 我国对菌落总数（包括霉菌酵母菌）和大肠菌群限量标准只规定最大限量，致病菌规定“不得检出”。
分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。 2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和