NK细胞及其应用
自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，属于一类独立的淋巴细胞。它来源于骨髓干细胞，主要分布于外周血、肝脏和脾脏。该细胞群是抗肿瘤的第一道防线，无需抗原预先致敏即可直接识别和杀伤肿瘤细胞，能发挥非特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有快速杀伤和溶解的作用，是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，其具有溶解靶细胞(某些肿瘤细胞和病毒感染细胞)的能力，而且还兼有重要的生理性免疫调节作用，，被认为是机体免疫中不町忽视的细胞。
主要分布于外周血，占外周血淋巴细胞总数的5％－10％，不需抗原刺激，可以直接杀伤靶细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫和抗病毒感染中均起重要作用。
人类NK细胞表达CD3,CD16,CD56等分化抗原。其中CD16为Ig FcR,介导ADCC。NK细胞表面有NK细胞活化受体（KAR)和NK细胞抑制受体（KIR)。KAR与相应配体结合后可激活NK细胞；KIR与MHC分子识别后能抑制NK细胞的杀伤活性。
NK细胞主要生物学功能：
1、抗感染和抗肿瘤作用：细胞毒作用
2、免疫调节作用：分泌大量CK，活化Mφ，促进Ig类别转换，诱导T细胞极化。
NK细胞杀伤靶细胞的作用机制：
1、穿孔素/颗粒酶作用途径
2、Fas/FasL作用途径
NK细胞的优点：
1、无需抗原提前致敏就有较强的杀伤肿瘤细胞的活性
2、对肿瘤细胞的杀伤具有直接、灵敏、反应速度快的优点
3、无毒副作用，提高患者生存质量
NK可释放穿孔素、颗粒酶，穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶b进入靶细胞诱导靶细胞凋亡。同时分泌大量的细胞因子，如ifn-v、tnf-x、gm-csf、il-3、m-csf等，直接作用于靶细胞，或通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞。并可表达可以诱导细胞凋亡的蛋白（fasl）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（trail），使靶细胞进入程序性凋亡状态。
实验一巨噬细胞吞噬功能实验 1、【实验原理】 (1)巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。 (2)此实验采用体内法，即： 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡红细胞30min 后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美蓝染色，油镜下计数吞噬鸡红细胞的百分数，及观察巨噬细胞中内因被杀死而染为蓝色的鸡红细胞的形态、数目，以判断巨噬细胞中的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。 2、【实验步骤】 （1）试验前3d，小白鼠腹腔注射6％无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。 （2）实验时，每只小鼠腹腔注射鸡红细胞液1ml，轻揉腹部，使红细胞在腹腔中分布均匀，利于吞噬 （3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用吸管取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴 0.03％xx溶液，盖上盖玻片。 （4）低倍镜下找到观察区域后，换高倍镜下进行观察，计数 3、【实验结果】 4、【结果分析】 （1）如图所示，在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可以看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。
（2）镜下可见吞噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。 (3)由于未将腹腔液和冷美蓝溶液充分混合均匀，使得视野中出现大片深染区域。 总体实验结果较好，视野中央可见清晰的吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞。 5、【注意事项】 （1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 （2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 （3）如小鼠腹腔液过少，可注入适量生理盐水。 （4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。 （5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。实验二双向琼脂扩散实验 1、【实验原理】 （1）可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀线/环的现象，称为沉淀反应。 （2）琼脂扩散是指为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。 当对应的抗原、抗体在半固体琼脂终相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，再适当的部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散不仅用于疾病的诊断，更广泛地用于抗原成分的分析。 （3）双向琼脂扩散试验是定性实验。将可溶性抗原与相应抗体分别加人琼脂板上的孔内，两者均可扩散，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。如
实验一巨噬细胞吞噬细胞功能实验 原理：巨噬细胞具有活跃的吞噬功能，能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。巨噬细胞受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。此次实验我们用体内法来介绍巨噬细胞的吞噬功能。 体内法：在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美兰染色，显微镜下计数吞噬鸡红细胞的百分数，及观察巨噬细胞内被杀死而染为紫色的鸡红细胞的形态、数目，以判断巨噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。 方法：（1）试验前3天，小白鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。（2）实验时，每只小鼠腹腔注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使鸡红细胞在腹腔中分布均匀，利于吞噬。 （3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用滴管取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.06%冷美兰溶液，盖上盖玻片 （4）高倍镜下进行观察，计数。 实验结果：100个巨噬细胞中已吞噬了鸡红细胞的 巨噬细胞的数目 吞噬百分率 = ———————————————————×100% 100个巨噬细胞 100个已吞噬鸡红细胞的巨噬细胞中 鸡红细胞的数目 吞噬指数 = ———————————————————×100% 100个已经吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞 结果分析：正常值 吞噬百分率：62.77±1.38 吞噬指数：1.058±0.049 我们的实验结果偏低，原因可能是腹腔注射时没有完全注射到腹腔内，部分残留在腹腔壁上。 实验二沉淀反应（双向琼脂扩散实验） 原理：双向琼脂扩散试验是定性实验。将可溶性抗原与相应抗体与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，两者均可扩散，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。如果不是相应的抗原与抗体，就不出现沉淀线。本试验常用于分析抗原抗体的纯度及相互关系。 方法：（1）将熔化的1%琼脂加在玻片上，3ml/板。 （2）待琼脂凝固后，在板上打孔。 （3）中央孔加抗体，上下孔加抗原1，左右孔加抗原2，每孔10μl。 （4）将琼脂板置于湿盒内，37℃ 24h后观察结果。 结果：在中央孔与周围孔之间，如出现沉淀线，则为阳性反应，提示有相应抗体与抗原反应。结果分析：（1）琼脂铺板应一次铺成，均匀平滑。 （2）打孔时要垂直打孔，防止孔壁破裂。 （3）加样时避免样品量过多溢出，影响沉淀线的生成。
自然杀伤( NK) 细胞是先天性免疫系统的重要组成部分,是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。与T 淋巴细胞不同, NK 细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞, 是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞[1]。人类NK细胞约占全血淋巴细胞的10 %～15 %。目前研究认为NK 细胞特异性表达CD56, 而缺乏T 细胞抗原CD3。NK 细胞具有以下功能:( 1) 对病毒感染细胞、白血病细胞及其他肿瘤细胞产生直接细胞毒活性;( 2) 分泌多种免疫调节细胞因子 ( 如:IFN- γ, TNF- α, GM- CSF) ;( 3) 通过细胞膜FcγRⅢ( CD16)与抗体Fc 段结合从而介导抗体依赖的细胞毒( ADCC) 作用 NK 细胞临床应用进展 2.1 体内扩增、激活NK 细胞 目前NK 细胞的免疫治疗主要是利用细胞因子体内扩增、 激活NK 细胞和体外产生LAK、CIK 细胞杀伤自体肿瘤细胞。 从早期的大剂量IL- 2 治疗的严重毒副作用到随后的长期小剂 量联合间断中剂量IL- 2 治疗证实在HIV 感染及恶性肿瘤患者 中可以较好耐受。但这种治疗方法只是增强骨髓祖细胞向NK 细胞分化及依赖IL- 2 延迟NK 细胞的凋亡, 而并非外周血成 熟NK 细胞的增生[14, 15]。因此联合应用IL- 2 和其他细胞因子 ( 如IL- 12, IL- 15, KL, FL) 可能达到更好的体内和体外扩增 NK 细胞的效果[16, 17]。但是由自体肿瘤细胞上表达的MHC- Ⅰ类 分子所介导的抑制性信号仍然是成功治疗的最大限制。 2.2 体内阻滞抑制性受体 在自体和HLA 相合的干细胞移植中, 白血病细胞表达 MHC- Ⅰ类分子与NK 细胞的抑制性受体结合从而抑制NK 细
关于NK细胞的研究 【摘要】：自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。1【In humans, NK cells comprise about 30%–50% of intrahepatic lymphocytes, whereas peripheral blood lymphocytes contain about 5%–20% NK cells. Accumulating evidence suggests that NK cells play an important role not only in host defense against invading microorganisms and tumor transformation in the liver but also in liver injury and repair.】 一，NK细胞的来源： NK细胞确切的来源还不十分清楚，一般认为直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。二，NK细胞的功能： (一)自然杀伤活性 由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。 1. 识别靶细胞NK细胞识别靶细胞是非特异性的，这与CTL识别靶细胞机理不同，但确切的机理尚未明了。 2. 杀伤介质主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等。 (二)ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) NK细胞表面具有FcγRⅢA,主要结合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能区),在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下可杀伤相应靶细胞。IL-2和IFN-γ明显增强NK细胞介导的ADCC作用。 (三)分泌细胞因子 活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。 此外，NK细胞可抑制PWM体外诱导B细胞的分化及抗体应答，其机理可能通过直接抑制B 细胞或抑制辅佐细胞的抗原提呈作用。 （1）NK细胞在体外还可杀伤某些细菌、真菌、原虫等，可能与NK细胞释放某些杀伤介质有关。(2)NK细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比T细胞具有更重要的作用。(3)参与骨髓移植后移植物抗白血病效应骨髓移植后数周内，来自供体的NK细胞在PBL中占相当高的比例。有报道称2【CD8~+Tr、双阴性T(DNT)细胞和NK T 细胞在移植耐受的不同模型中亦发挥重要作用。】此外，在体内NK细胞还可杀伤某些不成熟细胞如骨髓干细胞、胸腺细胞亚群等。 它还和杀死肿瘤细胞有关，可利用分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，摧毁目标细胞。并且3【可以通过细胞因子、单抗及多功能抗体介导NK细胞活化,调节抑制性信号和活化性信号传递加强NK细胞活性,免疫药物刺激及基因修饰提高NK细胞功能等多种途径增强NK细胞的肿瘤杀伤作用。】 4【A comparison of IL-15 stimulation and IL-2 stimulation showed slightly higher efficiency of IL-15 for expansion of CD4 + CD25 + cells, and for FoxP3 expression, IL-15 also showed significantly higher efficacy for inhibition of MLC.】
巨噬细胞功能检测
单核－巨噬细胞吞噬功能测定 单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。 小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法） 1、原理 巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。 2、方法 (1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备 1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠 5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。 2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。 3、操作 取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／ min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。 吞噬率％=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％ 吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞总数/100个巨噬细胞 **(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
单核－巨噬细胞吞噬功能测定 单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。 小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法） 1、原理 巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。 2、方法 (1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当
浓度备用(1~2×106／ml)。 (2)被吞噬物的制备 1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。 2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。 3、操作 取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。 吞噬率％=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％ 吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞总数/100个巨噬细胞**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
实验二 一巨噬细胞吞噬功能实验 【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。【方法】体内法： （1）实验前3小时，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。（2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。 （4）高倍镜下进行观察，计数。 【结果】 【分析】 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。 二沉淀反应双向琼脂扩散实验
【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，二者均可发生扩散，并且随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。本实验是定性实验，常用于分析抗原抗体的纯度关系以及相互关系。 【方法】 （1）制板：将熔化的1%琼脂加在载玻片上约5ml （2）打孔：待琼脂凝固后，将载玻片置于打孔样板上，用打孔器打孔 （3）加样：在中央孔内加抗体，上下两孔加抗原1，左右加抗原二，每孔加10μl （4）结果观察：将琼脂板置于湿盒，37℃一天后观察结果。 【结果】 在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线，有抗原抗体反应，为阳性反应，说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线，说明抗原2与抗体之间不相对应。【分析】抗体与抗原发生扩散时，随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。当有沉淀线出现时，说明有抗原抗体反应。 琼脂铺板时要一次铺成，并且铺设均匀。 打孔时要注意垂直打孔，注意不要有裂隙产生。
实验一巨噬细胞吞噬功能实验? 1、【实验原理】 (１)巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统得主要细胞,具有活跃得吞噬功能、能清除体内抗原物质及变性得细胞,在特异性及非特异性免疫中均起重要作用、MΦ受抗原刺激后活化,可使其吞噬功能明显增强。 (2)此实验采用体内法,即:在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,再给小鼠腹腔注射鸡红细胞３0mｉn后处死小鼠,取出腹腔液,以冷美蓝染色,油镜下计数吞噬鸡红细胞得百分数,及观察巨噬细胞中内因被杀死而染为蓝色得鸡红细胞得形态、数目,以判断巨噬细胞中得杀伤能力,由此间接地测定机体得非特异免疫水平、 ２、【实验步骤】 (1)试验前3d,小白鼠腹腔注射６％无菌淀粉液1ml,诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。 (2)实验时,每只小鼠腹腔注射鸡红细胞液1ml,轻揉腹部,使红细胞在腹腔中分布均匀,利于吞噬 (３)3０mｉn后,将小鼠拉颈处死,固定,打开腹腔暴露肠管,用吸管取出腹腔液,均匀涂布于载玻片上,然后再滴一小滴0、03％冷美蓝溶液,盖上盖玻片。?(4)低倍镜下找到观察区域后,换高倍镜下进行观察,计数 3、【实验结果】
4、【结果分析】 (1)如图所示,在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液,可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞得现象,并且可以瞧到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。 (2)镜下可见吞噬细胞核呈蓝色,被吞噬得鸡红细胞呈椭圆形,其胞浆呈红色而核被染成蓝色。 (3)由于未将腹腔液与冷美蓝溶液充分混合均匀,使得视野中出现大片深染区域。总体实验结果较好,视野中央可见清晰得吞噬了鸡红细胞得巨噬细胞、? 5、【注意事项】 (1)涂片得薄厚要适当,否则影响计数、 (２)小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 (3)如小鼠腹腔液过少,可注入适量生理盐水、 (4)剪开小鼠腹腔时应避免出血,否则将影响试验结果。 (5)被吞噬得鸡红细胞时间过长可被消化,时间过短未被吞噬,必须掌握好吞噬作用时间、
实验报告
使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油的原理是由于自标本玻片透过的光线，因介质（玻片一空气一接物镜）密度不同，部分光线发生折射而散失（如图中A—A'）使射入物镜的光线减少，在使用高、低倍镜时，透镜的孔径比较大，影响尚不显著；但应用油镜头时，因透镜的孔径小，进入的光线则不够，致使物象显 现不清。当油镜与标本片之间加香柏油后，香柏油的折射率（n=1.515）和玻璃的折射率（n=1.52）相近似，因此可增加进入透镜的光线（如图中C—C'），使视野的亮度加强，物象也就看得清楚。 5. 瑞氏染色 1）原理：瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物（天青）组成，其深于甲醇后，解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的力也不一样，因此，染色后各细胞呈现出各自的染色特点。 2）配制： （1）A液：瑞氏染粉0.1g，甲醇(AR）60ml。将瑞氏染粉放入清洁干燥研钵中，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。染液配好后放于室温下，一周后即可使用。（2）B液：瑞氏染液B液为磷酸盐缓冲液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g；加蒸馏水至1000 ml使其溶解。配好后的磷酸盐缓冲溶液应校正pH值，其范围在pH6.4～6.8即可，然后塞紧瓶口备用。
摇匀。 对小鼠进行及时止血，否则易失血过多而死亡。 3.向含血液的小试管加入菌液： 向小试管加入菌液后用塑料吸管吹洗三次，充分混匀，使血液中的吞噬细胞和细菌充分接触，促进吞噬。 4.水浴： 37℃水浴锅中保温20分钟，每隔10分钟取出小试管混匀1次，以使吞噬细胞与细菌充分接触和作用，促进吞噬。 （吞噬细胞的活性在接近体内温度的条件下最强，温度太高细胞活性下降且容易死亡） 5.血涂片的制作： 在载玻片的一端滴加一滴水浴后的血液，用另一个载玻片与载玻片间角度30°推片，用力匀，勿使太薄（白细胞多集中于边缘）或太厚（细胞重叠缩小）于玻片上影响标本的清晰度。 6.染色： 1）待血涂片干燥后，用瑞氏染液A液染色1分钟（染液要适量，能够覆盖住血液即可，一般1-2滴）。 2）加瑞氏染液B液染色的过程中，用吸耳球吹吸混匀（使染色均匀，避免染料颗粒沉积）。3）染色过程中避免血涂片干燥，实时加入相应染色保持湿润，以保证染色效果。 4）用细水流斜着冲去染液，对着血涂片位置冲洗，有可能把血涂片样本冲掉，导致操作失败。 7.显微镜观察： 1）先在低倍镜（10倍镜）下观察样本，确定合适的观察视野，应选择厚薄均匀、紫红色细胞较多的视野进行后续观察。4×物镜，视野大，但放大倍数较小，不容易观察细胞。 2）在要观察的载玻片部位滴加香柏油用油镜头观察，可较好的观察小吞噬的实验结果。 由于油镜头孔径较小，需要充足的光线，因此，需对光源、光圈、聚光镜进行调节，使光线处于最强状态。 3）中性粒细胞核形态多样，主要呈分叶状，中性粒细吞噬时，可见细胞核与被吞噬的细菌均染成紫色，细胞浆则为淡红色。 8.判断结果：
巨噬细胞吞噬功能测定 【实验原理】 巨噬细胞对颗粒性异物具有很强的吞噬功能。当鸡红细胞被注入小鼠腹腔时，会被腹腔中的巨噬细胞吞噬。取小鼠腹腔液涂片、染色，在显微镜下可见到鸡红细胞被吞噬的现象。计算吞噬百分率和吞噬指数，可判断吞噬细胞的吞噬功能。 【试剂和器材】 1. 动物体重20-25g的健康小鼠。 2. 1%鸡红细胞（CRBC）悬液自鸡液静脉或心脏采血，放Alsever液中保存（鸡血与Alsever 液1：5混合），置4℃可有效保存1个月，临用前用生理盐水将CRBC洗3次，按红细胞压积配成1%CRBC悬液。 3. 6%可溶性淀粉肉汤培养基肉汤培养基100ml加入可溶性淀粉6g，混匀，置100℃水浴煮沸消毒。 4. 其他试剂瑞氏（Wright）染液、生理盐水等。 5. 器材无菌注射器及针头、剪刀、镊子、解剖盘、载玻片、显微镜等。 【步骤和方法】 1.试验前3天，于小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉肉汤培养基1ml。 2.于试验当天，小鼠腹腔注入1%CRBC悬液0.5ml，并轻轻揉腹。 3.30min后小鼠颈椎脱臼处死，取腹腔液涂片，自然干燥后瑞氏染色，用油镜观察。 【结果判定】 镜下可见吞噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。呈油镜下随机观察100个巨噬细胞，计数吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数和吞噬的鸡红细胞总数。 吞噬百分率= (吞噬CRBC的巨噬细胞数/100)*100% 吞噬指数= 吞噬细胞吞噬的CRBC总数/100 【注意事项】 1.涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 2.小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 3.如小鼠腹腔液过少，可注入适量生理盐水。 4.剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。 5.被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。 阿氏液配方：葡萄糖2.05克柠檬酸钠0.8克柠檬酸0.055克氯化钠 0.42克加蒸馏水至100毫升，加热溶解后将pH值调到6.1，经过69千帕，15分 钟的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。
巨噬细胞吞噬现象的观察 杨遂群* 马晓红杨薇黄文强安小宁陆祖宁安绍芳 实验目的 1．了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理 2．熟悉细胞吞噬作用的基本过程 实验原理 在高等动物中，单核吞噬细胞系统和嗜中性粒细胞专司吞噬功能，在细胞的非特异性免疫功能中发挥重要作用。单核吞噬系统包括血液中的单核细胞和组织中固定和游走的巨噬细胞。 但静息的巨噬细胞其分泌和杀伤功能低下，受到病原微生物或炎症因子的刺激时，巨噬细胞成为激发或致敏状态，分泌能力得以增强，但杀伤功能仍然很低。只有活化的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力，具有非特异抗感染和抗肿瘤作用。 大吞噬细胞：来源：单核巨噬细胞 存在部位：血液（单核细胞)、全身结缔组织及小血管的基底膜组织（巨噬细胞） 功能：吞噬病原微生物（寄生虫等），死亡细胞。 小吞噬细胞：来源：中性粒细胞 存在部位：血液、炎症部位（全身） 功能：主要吞噬化脓菌 实验用品 1．器材 显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、吸管、吸水纸 2．试剂 生理盐水、Alsever溶液、瑞士染液 3．材料 小白鼠、1%鸡血红细胞。 实验步骤 1、实验前3天取小白鼠腹腔注射6％淀粉液1毫升（连续注射三天效果较好）。 2、小鼠腹腔注射1％的鸡红细胞悬液2ml，轻揉腹部使鸡细胞分散。 3、25～30分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠。并腹腔注射生理盐水2毫升； 4、在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴腹腔液，静置10分钟，腹腔巨噬细胞贴壁，弃去生理盐水，待其标本稍干后瑞氏染液染色。 5、.瑞氏染色：滴加3~4滴瑞氏染液于标本上，以完全盖住标本为宜。 6、分钟后甩去玻片上的染液，自来水轻洗，吸水纸吸干。 干燥后油镜镜检 7、清洗油镜，解剖盘及器具，打扫桌面卫生、实验室卫生，老鼠尸体要掩埋！ 实验报告 画图示出你所观察到的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的各种形态。 思考题 1、在高等动物中哪些细胞具有吞噬功能？ 2、在什么情况下巨噬细胞吞噬功能加强？
题目：巨噬细胞吞噬作用的观察 一．实验目的 1.通过小鼠腹腔巨噬细胞对异物吞噬作用的观察，了解巨噬 细胞在非特异性免疫中的功能。 2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。 3.学习小鼠腹腔注射的操作方法和步骤。 二．实验原理 1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量 巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细 胞。 2.台盼蓝是一种生物染料，专一染色死细胞。活细胞的细胞质膜 对台盼蓝有不透过性。巨噬细胞吞噬含有台盼蓝的淀粉肉汤 后，可以消化其中的淀粉和蛋白质，但是不能消化其中的台盼 蓝，因此台盼蓝会聚集在溶酶体中。是一种溶酶体染色的方法。 3.当向小鼠腹腔中注射鸡红细胞时，鸡红细胞作为外源物质，会 被小鼠细胞识别并吞噬，在适当的的时机，我们就有可以在显 微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程
三．实验材料及设备 1.实验材料： a)连续2~3天向腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤的小鼠一只 b)鸡红细胞悬液 c)生理盐水 2.实验设备： a)普通光学显微镜 b)载玻片、盖玻片若干 c)注射器 d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等
四．实验方法及步骤 1.小鼠处理与巨噬细胞采集 a)连续2-3天（每天一次）向小鼠腹腔中注射含台盼蓝的淀 粉肉汤。 b)选择已注射淀粉肉汤3小时以上的小鼠一只。 c)一人控制住小鼠，露出腹部，另一人用注射器向小鼠腹腔 中注射1ml鸡红细胞悬液。按摩小鼠腹部。 d)20-30分钟后，再注射1-1.5ml生理盐水（0.9%NaCl）按 摩小鼠腹部。 e)3分钟后，引颈法处死小鼠 f)迅速在腹腔剪开一个不大的开口（注意要剪开腹部的肌肉 层），用无针头的注射器吸取腹腔液。 g)在载玻片上滴2-3滴腹腔液，加上盖玻片，在显微镜下观 察。 2.观察 在不同倍数下观察样本，找到正在消化或者吞噬鸡红细胞 的巨噬细胞。注意避免玻片液体干涸。 五．实验结果
题目：巨噬细胞吞噬作用的观察 实验目的 1. 通过小鼠腹腔巨噬细胞对异物吞噬作用的观察，了解巨噬细胞在非 特异性免疫中的功能。 2. 掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。 3. 学习小鼠腹腔注射的操作方法和步骤。 实验原理 1. 向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细 胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养” 。连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。 2. 台盼蓝是一种生物染料，专一染色死细胞。活细胞的细胞质膜对台 盼蓝有不透过性。巨噬细胞吞噬含有台盼蓝的淀粉肉汤后，可以消化其中的淀粉和蛋白质，但是不能消化其中的台盼蓝，因此台盼蓝会聚集在溶酶体中。是一种溶酶体染色的方法。 3. 当向小鼠腹腔中注射鸡红细胞时，鸡红细胞作为外源物质，会被小 鼠细胞识别并吞噬，在适当的的时机，我们就有可以在显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程
．实验材料及设备 1. 实验材料： a) 连续2~3 天向腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤的小鼠一只 b) 鸡红细胞悬液 c) 生理盐水 2. 实验设备： a) 普通光学显微镜 b) 载玻片、盖玻片若干 c) 注射器 d) 染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等
四．实验方法及步骤 1. 小鼠处理与巨噬细胞采集 a) 连续2-3 天(每天一次)向小鼠腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤。 b) 选择已注射淀粉肉汤3 小时以上的小鼠一只。 c) 一人控制住小鼠，露出腹部，另一人用注射器向小鼠腹腔中注射 1ml 鸡红细胞悬液。按摩小鼠腹部。 d) 20-30 分钟后，再注射1-1.5ml 生理盐水( 0.9%NaCl)按摩小鼠 腹部。 e) 3 分钟后，引颈法处死小鼠 f) 迅速在腹腔剪开一个不大的开口 (注意要剪开腹部的肌肉层)，用 无针头的注射器吸取腹腔液。 g) 在载玻片上滴2-3 滴腹腔液，加上盖玻片，在显微镜下观察。 2. 观察 在不同倍数下观察样本，找到正在消化或者吞噬鸡红细胞的巨噬 细胞。注意避免玻片液体干涸。 五．实验结果