天然药物化学实验讲义
重庆医科大学药学院
目录
一、黄柏中生物碱的提取、分离和鉴别
二、槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别
三、穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别
四、八角茴香挥发油的提取及鉴别
五、大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别
六、苦参生物碱的提取、分离与鉴别
前言
《天然药物化学实验》是一门实践性很强的课程，理论教学与实验教学是一个不可分割的完整体系。通过实验课的学习使学生能印证并加深理解课堂讲授的理论知识，掌握由天然药物中提取、分离、精制有效成分，并对其进行鉴别的基本方法和技能，提高学生独立动手、观察分析、解决问题的能力，培养学生严谨的科学态度和良好的科研作风。
实验一黄柏中小檗碱的提取、分离和鉴别
【实验目的】
1.掌握从黄柏中提取小檗碱的原理和方法。
2.掌握小檗碱的理化性质和鉴别方法
3.熟TLC的基本操作以及在中药有效成分提取分离中的应用。
【实验原理】
1.小檗碱(berberine)，含量为1.4%-4%(川黄柏含量较高)
性状：黄色结晶，有5.5个结晶水，mp145℃。
溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃时分解并转变为棕红色小檗红碱，285℃时完全熔融。
2.小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，首先用石灰乳沉淀黏液质，用碱水提出小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。
【实验仪器与试剂】
1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉。
2.川黄柏粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，1%硫酸，浓硫酸，浓盐酸，浓硝酸，次氯酸钠，10%氢氧化钠，丙酮，乙醇，稀硫酸，锌粒，食盐，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），甲醇，氨水，盐酸小檗碱对照品。
【实验步骤】
1.提取称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸600mL，搅拌均匀，浸泡过夜，纱布过滤。或称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸200mL，搅拌均匀，使湿润度合适，放置30min后，装入渗漉筒内，用1%硫酸浸泡过夜，渗漉，速度以5～6mL/min为宜。收集渗漉液500～600mL 即可停止渗漉。
2.取上项提取液，加入石灰乳调pH11～12,静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调pH2～3，再加入溶液量10%食盐，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸小檗碱粗品。
3.精制将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过，滤液加浓HCI调pH2左右，静置过夜，滤取结晶，80℃以下干燥，得精制盐酸小檗碱。
4.盐酸小檗碱的鉴别
（1）取盐酸小檗碱少许，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，即显樱红色。
（2）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸1～2滴，即显樱红色。
（3）取盐酸小檗碱约0.05g，溶于5mL热水中，加入10%NaOH溶液2mL，显橙色。溶液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。
（4）取盐酸小檗碱少许，加水2mL溶解后，加锌粉少许，再分数次加入浓硫酸数滴，振摇，每隔10min加一次，观察其黄色是否消退。
（5）薄层色谱鉴别
吸附剂：硅胶H-CMC-Na板。
展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），氨蒸气预平衡10min 后展开。
样品液：自制盐酸小檗碱甲醇液（每1mL含0.5mg）。
对照品液：盐酸小檗碱对照品甲醇液（每1mL含0.5mg）。
显色：置紫外灯（365nm）下检视，显黄色荧光斑点。
结果：记录样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。
【基本操作注意事项】
1.实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者粘液质较多过滤麻烦。
2.加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中的溶解度。其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。
3.在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。
【思考题】
1.怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？
2.通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。
3.用薄层色谱法检识盐酸小檗碱时，选用氧化铝或硅胶作吸附剂，二者有何区别？展开剂有何不同？
实验二槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别【实验目的】
1.掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。
2.掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。
3.熟悉和了解采收与炮制对芦丁含量的影响。
【实验原理】
1.槐花为豆科植物槐Sophora japonica L．的干燥花及花莆。前者习称槐花Flos Sphorae；后者习称槐米Flos Sophorae Immaturus。主产于河北、山东、河南、陕西、江苏、广东、广西、辽宁等地。以河北、山东、河南产量大。性能：苦，性微寒。功效：凉血止血、清肝泻火。应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。
2.主要含有芦丁（芸香苷）、槲皮素，还含少量皂苷类
及多糖、粘液质等。近代研究表明槐米含芦丁可高达23.5%，
槐花开放后降至13.0%。芦丁可用于治疗毛细血管脆性引起的
出血症，并用作高血压辅助治疗剂。芦丁还可以作为制备槲
皮素、羟乙基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的
原料。
3.芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C
27H
30
O
16
·3H
2
O），
加热至185℃以上熔融并开始分解。芦丁的溶解度，在冷水中1:10000，沸水中1:200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7，可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。
【实验仪器与试剂】
1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，色谱专用滤纸，聚酰胺色谱膜，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机。
2.槐花米粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，硼砂，2%硫酸，浓硫酸，稀盐酸，浓盐酸，10%氢氧化钠，乙醇，10%α-萘酚乙醇溶液，镁粉，1%醋酸镁甲醇溶液，1%三氯化铝乙醇溶液，2%二氯氧锆甲醇溶液，2%枸橼酸甲醇溶液，Ba(OH)
2
，滑石粉，甲醇，氨水，芸香苷、
槲皮素、葡萄糖、鼠李糖对照品，展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱），90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱），显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂。
【实验步骤】
1.芸香苷的提取称取50g槐花米粗粉，于500mL烧杯中，加入0.4%硼砂沸水溶液300mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH8～9，加热微沸30min，注意添加水，随时补充蒸发掉的水分保持原体积并维持pH8～9，趁热用脱脂棉过滤；药渣同样操作再提取一次，合并滤液，稍冷，用浓盐酸调至pH4～5，静置过夜使沉淀完全，抽滤，用蒸馏水洗3～4次，抽干置空气中自然干燥得淡黄色粗制芸香苷。
2.芸香苷的精制将芸香苷粗品置500mL烧杯中，加适量（约100mL）蒸馏水，再用石灰水调至pH8。加热煮沸数分钟，使充分溶解。趁热抽滤，滤液滴加3mol/LHCl调至pH7，放置18h以上，即析出沉淀。减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2～3次。抽干，于70～80℃干燥1h，即得精制芦丁。称重，计算产率。
3.芸香苷的水解取精制芦丁2g，研细，置于500mL圆底烧瓶中，加2%硫酸溶液150mL，于直火回流30min，放置至室温，析出黄色槲皮素结晶，抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。沉淀水洗后再用95%乙醇重结晶一次，得黄色针状结晶，于70～80℃以下干燥，即得精制槲皮素。
4.检识
（1）取芸香苷、槲皮素少许，分别用10mL乙醇溶解，制成试样溶液，照以下方法进行实验。
①Molish反应：取试样溶液各2mL，分置于两支试管中，加10%α-萘酚乙醇溶液1mL，振摇后倾斜试管45°，沿管壁滴加2mL浓硫酸，静置，观察两液面交界处颜色变化（棕色环）。
②盐酸-镁粉反应：取试样溶液各2mL，分别置于两支试管中，各加入镁粉少许，再加入浓盐酸数滴，观察并记录颜色变化。
③醋酸镁反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%醋酸镁甲醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化，并记录。
④三氯化铝反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%三氯化铝乙醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化，并记录。
⑤锆-枸橼酸反应：取试样溶液各2mL，分别置于两支试管中，各加2%二氯氧锆甲醇溶液3～4滴，观察颜色，然后加入2%枸橼酸甲醇溶液3～4滴，观察并记录颜色变化。
（2）糖的纸色谱鉴定取水解母液20mL，用Ba(OH)
的细粉（约2.6g）中和至pH7，
2
沉淀（可用滑石粉助滤），滤液浓缩至约1mL，供纸色谱点样用。
滤去生成的BaSO
4
样品：水解浓缩液
色谱滤纸：新华滤纸
对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液
展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液。
显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后105℃烘10min，显棕红色斑点。苯胺-邻苯二甲酸的配制：将1.66g苯二甲酸和0.93g的苯胺溶于100mL水饱和的正丁醇中。
（3）芦丁、槲皮素的纸色谱和聚酰胺薄层色谱鉴定
样品：自制芦丁、槲皮素的乙醇液
色谱材料：新华滤纸，聚酰胺薄膜
对照品：芦丁、槲皮素的乙醇溶液
展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱）。90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱）。
显色：
①可见光下观察及紫外灯下观察。
②喷三氯化铝试剂后再观察。
【基本操作注意事项】
1.加入石灰乳即可达到碱溶解提取芸香苷目的，又能使槐米中含存的大量粘液质生成钙盐沉淀除去，但应严格控制在pH8～9，不得超过10。pH过高，在加热提取过程中可促使芸香苷水解破坏，造成产率明显下降。酸沉时加浓硫酸调pH3～4，不宜过低，否则会使芸香苷生成盐溶于水，也会降低收率。
2.加入硼砂的目的是使其与芸香苷邻二酚羟基结合，这样既保护邻二酚羟基不被氧化破坏，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香苷不受损失。同时还有调节碱性水溶液PH值的作用。
3.芸香苷的提取还可以利用芸香苷在冷、热水中的溶解度不同，采用沸水提取法。
【思考题】
1.苷类水解有几种催化方法？
2.试解释芸香苷水解过程中出现的混浊→澄清→混浊现象。
3.怎样正确鉴定芸香苷？
4.本实验提取过程中应注意哪些问题？
实验三 穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别
【实验目的】
1.掌握从穿心莲药材中提取亲脂性成分的原理和方法。
2.掌握除去叶绿素的原理和方法。
3.熟悉内酯类成分的主要理化性质及鉴别方法。
【实验原理】
1.穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees 的全草。穿心莲中含有多种二萜类化合物，主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯等。
（1）穿心莲内酯(andrographolide)。分子式C 20H 30O 5，分子量350.44。无色方形或长
方形结晶，味极苦。mp.230～231℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶中，微溶于氯仿、乙醚、难溶于水、石油醚、苯。
（2）新穿心莲内酯(neoandrographolide)。分子式C 26H 40O 8，分子量480.58。无色柱
状结晶，无苦味。mp.167～168℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶中，微溶于水，较难溶于苯、乙醚、氯仿及石油醚。
（3）去氧穿心莲内酯(deoxyandrographolide)。分子式C 20H 30O 4，分子量334.44。无色
片状（丙酮、乙醇或氯仿）或无色针状结晶（醋酸乙酯），味稍苦。mp.174～175℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、氯仿，可溶于乙醚、苯中，微溶于水。
（4）脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide) 分子式C 20H 28O 4,分子量332.42。无
色针状结晶（30%或50%乙醇），mp.204℃。易溶于乙醇、丙酮，可溶于氯仿，微溶于苯，几不溶于水。 O
HO
O CH 2
CH 2OH
HO
161315111718201910O O CH 2CH 2OH HO O
O CH 2CH 2O glc O O H CH 2OH HO
2.本实验是利用穿心莲内酯类成分易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂的性质，选用乙醇为提取溶剂进行提取。穿心莲中含有大量叶绿素，故用活性炭吸附，除去叶绿素等脂溶性杂质。又根据穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯在氯仿中溶解度不同而进行分离。也可利用穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯及新穿心莲内酯结构上的差异所表现的极性不同，用氧化铝柱色谱分离。
【实验仪器与试剂】
穿心莲内酯 去氧穿心莲内酯 新穿心莲内酯 脱水穿心莲内酯
1.减压浓缩器，1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，超声波振荡器，层析柱（Ф1.5cm）
2.穿心莲粗粉，滤纸，pH试纸，活性炭，氯仿，中性氧化铝（柱层析用），7%盐酸羟胺甲醇溶液，氢氧化钾甲醇溶液，稀盐酸，1%三氯化铁溶液，0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液，10%氢氧化钠溶液，碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，穿心莲内酯对照品，展开剂：①氯仿-甲醇（9∶1），②氯仿-正丁醇-甲醇（2∶1∶2）【实验步骤】1.提取
方法Ⅰ：穿心莲叶粗粉200g
浓缩至小体积
总浓缩液
加原料量15%～20%活性炭，加热回流30min
内酯类结晶粗品
方法Ⅱ：穿心莲叶粗粉200g
回收乙醇至500ml左右
总浓缩液
加原料量15%～20%活性炭，加热回流30min
内酯类结晶粗品
2.精制
内酯类结晶粗品
加15倍量95%乙醇溶解，加1%活
滤液活性炭渣
回收乙醇至半，放冷析晶，滤过
内酯类结晶精制品
3.分离
内酯类结晶精制品
加少量氯仿溶解
氯仿溶液
50%乙醇洗脱去氧穿心莲内酯粗晶新穿心莲内酯
95%乙醇重结晶
穿心莲内酯
4.穿心莲内酯类成分的检识
（1）异羟肟酸铁反应取穿心莲内酯结晶数毫克，加乙醇1ml溶解，加7%盐酸羟胺甲醇溶液2～3滴，加10%氢氧化钾甲醇溶液1～2滴使呈碱性，于水浴上加热2分钟，放冷后，加稀盐酸使呈酸性，加1%三氯化铁溶液1～2滴，混匀，呈紫红色。
（2）Legal反应取穿心莲内酯结晶少许，加乙醇1ml溶解，加0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液2～4滴，加10%氢氧化钠溶液1～2滴，呈紫色。
（3）Kedde反应取穿心莲内酯结晶少许，加乙醇1ml溶解，加碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂2滴，呈紫色。
（4）穿心莲内酯类成分的薄层色谱检识
薄层板：硅胶H-CMC-Na
试样：自制穿心莲内酯乙醇溶液
对照品：穿心莲内酯对照品乙醇溶液
展开剂：①氯仿-甲醇（9∶1）
②氯仿-正丁醇-甲醇（2∶1∶2）
显色剂：喷雾Kedde试剂，加热显色
【基本操作注意事项】
1.穿心莲内酯类化合物为二萜类内酯，性质极不稳定，易氧化、聚合而树脂化。因此提取所用的穿心莲应是当年产的新药材，并且要未受潮变质的茎叶部分，否则内酯含量明显下降至极低，难以提取得到。
2.提取时，如用热乙醇加热回流提取穿心莲总内酯，能同时提出大量穿心莲中的叶绿素、树脂以及无机盐等杂质。使析晶和精制较为困难，因此本实验用冷浸法和超声波振荡法提取。
3.以超声波振荡法提取省时，浓缩析晶时脂溶性杂质少，易得到黄色结晶，得率高。
4.穿心莲内酯的析晶宜在含乙醇量稍高的情况下进行，此时晶形与结晶的纯度都较好。当溶液的含水量较高，或粘稠度太大时，往往不易析出结晶。
【思考题】
1.叶绿素除用活性炭吸附法去除外，还可采用哪些方法去除？
2.穿心莲总内酯的分离可采用哪些方法？试比较各种方法的优缺点。
3.根据穿心莲内酯类成分的结构，试判断其极性的强弱，在进行吸附薄层色谱时其R f 值大小如何？
4.Legal反应和Kedde反应的机理是什么？什么样的结构才有阳性反应？
实验四八角茴香挥发油的提取及鉴别
【实验目的】
1.掌握挥发油的水蒸气蒸馏提取法。
2.掌握挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识。
3.熟悉挥发油的一般检识。
4.了解挥发油单向二次薄层色谱检识。
【实验原理】
1.为木兰科植物八角茴香Illicium verum Hook..f.的干燥成熟果实。分布于广西、贵州、云南等省区。含挥发油4％～9％，脂肪油约22％（主要存在于种子中）及蛋白质、树胶、树脂等。挥发油中主要成分是茴香醚，约为总挥发油的80％～90％，冷时常自油中析出，故称茴香脑。此外，尚含莽草酸及少量甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸等。
茴香醚（脑）甲基胡椒酚茴香醛莽草酸茴香酸
（1）茴香脑(anethole) 又称大茴香醚、茴香烯、茴香醚。分子式C
10H
12
O，分子量
148.21。为白色结晶，mp.21.4℃，bp.235℃。与乙醚、氯仿混溶，溶于苯、醋酸乙酯、丙酮、二硫化碳及石油醚，几不溶于水。
（2）莽草酸(shikimic acid) 又称毒八角酸。分子式C
7H
10
O
5
,分子量174.15。无色
针状结晶（甲醇—醋酸乙酯），mp.190～191℃。在100ml水中可溶解18g，100ml无水乙醇中可溶解2.5g，几乎不溶于氯仿、苯、石油醚。
（3）甲基胡椒酚(methylchavicol) 分子式C
10H
12
O，为无色液体，bp.215～216℃。
（4）茴香醛 (anisaldehyde) 分子式C
8H
8
O
2
，有两种状态：棱晶，mp.36.3℃，bp.236℃；
液体，mp.0℃，bp.248℃。
（5）茴香酸 (anisic acid) 分子式C
8H
8
O
3
，针状结晶，mp.184℃，bp.275～280℃。
2.本实验是水蒸气蒸馏法提取挥发油的通法。挥发油的组成成分较复杂，常含有烷烃、烯烃、醇、酚、醛、酮、酸、醚等官能团。因此可以用一些检出试剂在薄层板上进行点滴试验，从而了解组成挥发油的成分类型。挥发油中各类成分的极性互不相同，一般不含氧的烃类和萜类化合物极性较小，在薄层色谱板上可被石油醚较好的展开；而含氧的烃类和萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚与醋酸乙酯的混合溶剂较好的展开。为了使挥发油中各成分能在一块薄层色谱板上进行分离，常采用单向二次色谱法展开。
【实验仪器与试剂】
1.100、10ml烧杯，250ml三角烧瓶，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，洗瓶，蒸馏装置，电热套，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），
玻棒，牛骨匙，显色剂喷瓶，小型空压机。
2.八角茴香粗粉，滤纸，三氯化铁试剂，2,4-二硝基苯肼试剂，碱性高锰酸钾试剂，香草醛-浓硫酸试剂（临时配用），0.05%溴酚蓝试剂，硝酸铈铵试剂，柠檬油，丁香油，薄荷油，樟脑油，桉叶油，松节油，丙酮，石油醚（30～60℃），醋酸乙酯。
【实验步骤】
1.茴香脑的提取分离
取八角茴香粗粉50g ，置圆底烧瓶中，加适量水浸泡湿润，按一般水蒸气蒸馏法进行蒸馏提取。也可将捣碎的八角茴香置于挥发油测定器的烧瓶中，加蒸馏水500ml 与数粒玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止。缓缓加热至沸，至测定器中油量不再增加，停止加热，放冷，分取油层。将所得的八角茴香油置冰箱中冷却1小时，即有白色结晶析出，趁冷滤过，用滤纸压干。结晶为茴香脑，滤液为析出茴香脑后的八角茴香油。
2.检识
（1）油斑试验 取八角茴香油适量，滴于滤纸片上，常温下（或加热烘烤），观察油斑是否消失。
（2）薄层色谱板点滴反应 取硅胶G 薄层色谱板1块，用铅笔按表画线。将挥发油试样用5～10倍量乙醇稀释后，用毛细管分别滴加于每排小方格中，再将各种检识试剂用滴管分别滴于各挥发油试样斑点上，观察颜色变化。初步推测每种挥发油中可能含有化学成分的类型。
实-表1 挥发油薄层板点滴反应
八角茴香油
柠檬油
丁香油
薄荷油
樟脑油
桉叶油
松节油
空白对照 （3）挥发油薄层色谱单向二次展开检识 取硅胶H-CMC-Na 薄层板（6cm ×15cm ）一块，在距底边1.5cm 及8cm 处分别用铅笔画起始线和中线。将八角茴香油溶于丙酮，用毛细管点于起始线上呈一长条形，先用石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（85∶15）为展开剂展开至薄层板中线处取出，挥去展开剂，再放入石油醚（30～60℃）中展开至接近薄层板顶端时取出，挥去展开剂后，分别用下列几种显色剂喷雾显色。
试剂 1．三氯化铁试剂 2．2,4-二硝基苯肼试剂 3．碱性高锰酸钾试剂 4．香草醛-浓硫酸试剂 5．0.05％溴酚蓝试剂 6．硝酸铈铵试剂
①1％香草醛-硫酸试剂：可与挥发油产生紫色、红色等。
②荧光素-溴试剂：如产生黄色斑点，表明含有不饱和化合物。
③2,4-二硝基苯肼试剂：如产生黄色斑点，表明含有醛或酮类化合物。
④0.05％溴甲酚绿乙醇试剂：如产生黄色斑点，表明含有酸性化合物。
观察斑点的数量、位置及颜色，推测每种挥发油中可能含有化学成分的种类及数量。
【基本操作注意事项】
1.通过观察馏出液的混浊程度来判断挥发油是否提取完全。最初的馏出液中含油量较多，明显混浊，随着馏出液中油量的减少，混浊度也随着降低，至馏出液变为澄清甚至无挥发油气味时，停止蒸馏。
2.提取完毕，须放冷，待油水完全分层后，再将油层放出，尽量不带出水分。
3.进行单向二次展开时，先用极性较大的展开剂展开至中线，然后再用极性较小的展开剂展开。在第一次展开后，应将展开剂完全挥干，再进行第二次展开，否则将影响第二次展开剂的极性，从而影响分离效果。
4.挥发油易挥发逸失，因此进行色谱检识时，操作应迅速及时，不宜久放。
5.喷洒香草醛-浓硫酸显色剂时，应于通风橱内进行；用溴甲酚绿试剂显色时，应避免在酸性条件下进行。
【思考题】
1.从八角茴香中提取分离茴香脑的原理是什么？
2.利用点滴反应检识挥发油的组成优点是什么？
3.单向二次展开薄层色谱法检识挥发油中各成分时，为什么第一次展开所用的展开剂极性最好大于第二次展开所用的展开剂的极性？单向二次展开薄层色谱法有什么优点？
实验五大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别【实验目的】
1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。
2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。
3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。
4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。
5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。
【实验原理】
1.大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim.ex Reg.和药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄蒽醌及其苷。
（1）大黄酸(rhein) 分子式C 15H 8O 6，分子量284.21。黄色针状结晶（升华法），mp.321～
322℃，330℃分解。能溶于碱水、吡啶，溶于乙醇、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。
（2）大黄素(emodin) 分子式C 15H 10O 5，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256～
257℃，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。
（3）芦荟大黄素(aloe-emodin) 分子式C 16H 10O 5，分子量270.23。橙色针状结晶（甲
苯），mp.223～224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。
（4）大黄酚(chrysophanol) 分子式C 15H 10O 4，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜
结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。
（5）大黄素甲醚(physcion) 分子式C 16H 12O 5，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，
mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
2.本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH 梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH 梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。
【实验仪器与试剂】
1.索氏提取器，500、100、10ml 烧杯，1000、500ml 分液漏斗，10ml 试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm 薄层板，10×20cm 薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm ）
2.大黄粗粉，滤纸，pH 试纸，乙酸乙酯，石油醚（60～90℃），氯仿，20％硫酸，pH8缓冲液，pH9.9缓冲液，浓盐酸，5％碳酸钠，5％氢氧，丙酮，10％氢氧化钠，0.5%醋酸镁乙醇试剂，薄层用硅胶H ，0.2%CMC-Na ，甲醇，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对照品，展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液，浓氨水。
【实验步骤】
大黄酚 R 1=CH 3 R 2=H 大黄素 R 1=CH 3 R 2=OH 大黄酸 R 1=COOH R 2=H 大黄素甲醚 R 1=CH 3 R 2=OCH 3 芦荟大黄素 R 1=CH 2OH R 2=H
O O OH R 2
OH
R 1
1. 提取与分离
大黄粗粉100g
水洗余酸至中性
乙酸乙酯、石油醚提取液
加pH8缓冲液150ml萃取
pH9.9缓冲液300ml萃取
冰醋酸精制
大黄酸盐酸调pH3，滤过
化钠（9∶1）540ml 沉淀
丙酮精制
大黄素
盐酸调pH3，滤过
沉淀
醋酸乙酯精制
芦荟大黄素
沉淀
硅胶柱色谱
大黄酚大黄素甲醚
1ml乙醇溶解，加数滴10％氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。
（2）乙酸镁试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5％乙酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。
（3）薄层色谱检识
薄层板：硅胶H-CMC-Na
试样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的乙醇溶液。
对照品：上述各成分对照品乙醇溶液（约1mg/ml）。
展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液。
显色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5％乙酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。
【基本操作注意事项】
1.大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。
2.萃取用pH8缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH9.9缓冲液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。配制好的缓冲液要测pH值。一般萃取大黄酸用pH7～8范围的，萃取大黄素用pH9.5～11范围的。
3.用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。
4.本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。
5.色谱分离大黄酚及大黄素甲醚时，先用氯仿洗脱至出现黄色色带时，改用氯仿—醋酸乙酯（8∶2）混合溶剂继续洗脱，并更换收集器，每10ml为一份，按顺序编号，直至色谱柱的第一色带全部洗脱下来为止。各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿－醋酸乙酯(8∶2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。
【思考题】
一、大黄游离蒽醌的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。
二、（1）大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？
（2）pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？
（3）蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？
（4）蒽醌类与乙酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？
实验五苦参生物碱的提取、分离与鉴别
【实验目的】
1.掌握用离子交换树脂提取、分离生物碱的原理和方法。
2.掌握苦参生物碱的提取、分离与鉴别
3.学习离子交换树脂的处理与再生方法。
【实验原理】
1.苦参中生物碱主要是苦参碱和氧化苦参碱。除此之外还含有羟基苦参碱(hydroxymatrine)、N-甲基金雀花碱(N-methylcytisine)等多种生物碱。分子结构中均有两个氮原子，一个为叔胺，一个为酰胺。
消肿利尿、抗肿瘤、抗病原体作用，同时具有抗心率失常、正性肌力、抗缺氧、扩张血管、降血脂、抗柯萨奇病毒、调节免疫等作用。临床上除治疗常规疾病外，还用于治疗心率失常、心力衰竭、病毒性心肌炎、冠心病等。
（1）性状苦参碱有α-、β-、γ-、δ-四种形态。其中α-、β-、δ-苦参碱为结晶体，γ-苦参碱为液体。常见的是α-苦参碱，为针状或棱柱状结晶，mp.76℃。氧化苦参碱为无色正方体状结晶（丙酮），mp.207～208℃（分解）。含一分子结晶水的氧化苦参碱mp.77～78℃。
（2）溶解性苦参碱既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等亲脂性溶剂。氧化苦参碱是苦参碱的N-氧化物，具有半极性配位键，其亲水性比苦参碱更强，易溶于水，可溶于氯仿，但难溶于乙醚。可利用二者在乙醚中的溶解性差异进行分离。苦参中生物碱的极性大小顺序是：氧化苦参碱＞羟基苦参碱＞苦参碱。
（3）水解性及氧化还原反应苦参碱、氧化苦参碱和羟基苦参碱具有内酰胺结构，可水解生成羧酸衍生物，酸化后又脱水环合为内酰胺结构。如苦参碱在5% KOH中加热，水解成苦参酸钾，酸化后又环合为苦参碱。N-甲基金雀花碱是芳香性的内酰胺碱，稳定性大，在同样水解条件下不易水解生成钾盐，可利用这一性质与苦参碱分离。
在植物体内，70%以上苦参碱以氧化苦参碱状态存在。
2.苦参中生物碱主要有苦参碱和氧化苦参碱。分子结构中均有两个氮原子，一个为叔胺，一个为酰胺。苦参生物碱可与酸结合成盐，因此用酸水提取后，生物碱呈阳离子状态而被阳离子交换树脂所交换，再用氨水碱化后使生物碱游离，用有机溶剂回流提取之。
苦参碱既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等亲脂性溶剂。氧化苦参碱
是苦参碱的N-氧化物，易溶于水，可溶于氯仿，难溶于乙醚。也可利用二者在乙醚中的溶解性差异进行分离。氧化苦参碱的极性大于苦参碱。
【实验仪器与试剂】
1.索氏提取器，参漉筒，阳离子交换树脂，500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm 薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm）
2.苦参粗粉，滤纸，pH试纸，2mol/L盐酸，浓盐酸，丙酮，改良碘化铋钾试剂（临时配用），薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，0.2%氢氧化钠，甲醇，苦参碱、氧化苦参碱对照品，苦参碱展开剂：甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:4:2:1）10℃下放置的上层溶液，氧化苦参碱展开剂：氯仿-甲醇－浓氨试液（5:0.6:0.3）10℃下放置的下层溶液，2mol/LNaCl，无水硫酸钠。
【实验步骤】
1.树脂的处理由于市售的阳离子交换树脂为钠型，同时含水量不足未充分膨胀，而且往往含有杂质。因此使用前须进行转型、除杂和吸水膨胀处理，其方法如下：取市售阳离子交换树脂（如聚苯乙烯磺酸型树脂，交联度1×7）120g，置烧杯中，加蒸馏水洗至水色较浅，再加蒸馏水浸泡树脂并在80℃水浴上加热1h（或室温下浸泡1天），以便树脂充分膨胀。减压抽干后加入2mol/LHCl200mL，不断搅拌，浸泡1h，倾去酸水，再加2mol/LHCl 400mL浸泡过夜。将树脂装入色谱柱中，再将浸泡用的2mol/LHCl全部通过树脂（4～5mL/min），然后用蒸馏水洗至pH4～5，备用。
2.苦参生物碱的提取和交换取苦参粗粉100g，加适量0.1%HCl湿润膨胀后，装入渗漉筒中，以0.1%HCl1500mL渗漉，流速2～3mL/min。渗漉筒与交换柱相联，渗漉液通过装有湿重60g树脂的阳离子交换柱交换，交换速度为2～3mL/min，测定不同交换时间的pH 变化。然后将吸附树脂倒入烧杯中，以蒸馏水洗至洗液无色，抽干后置搪瓷盘中室温晾干。
3.总生物碱的洗脱将上述晾干的树脂置烧杯中，加入适量10%氨水，搅匀，以手摸有潮湿感但不粘手为宜。放置20min，装入滤纸袋中置索氏提取器中，以氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应（取提取液中部的氯仿液滴在滤纸上喷改良碘化铋钾试剂）。氯仿液加无水硫酸钠脱水后，回收氯仿至干。残留物用丙酮20mL回流溶解，必要时抽滤，然后回收2/3的丙酮，放置，结晶，抽滤，干燥，即得粗品总碱的白色结晶。
4.薄层鉴定
吸附剂：0.2%氢氧化钠制硅胶H-CMC-Na板二块。
样品液：总碱乙醇液（每1mL含0.5mg），点样5μL。
标准品：苦参碱对照品乙醇液（每1mL含0.5mg），氧化苦参碱对照品乙醇液（每1mL 含0.5mg），分别点样5μL。
苦参碱展开剂：甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:4:2:1）10℃下放置的上层溶液。
氧化苦参碱展开剂：氯仿-甲醇－浓氨试液（5:0.6:0.3）10℃下放置的下层溶液。
显色剂：依次喷碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液，显橙色斑点。
结果：记录对照样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。
5.树脂再生使用过的树脂用蒸馏水洗去杂质并抽干。然后以2mol/LHCl浸泡后装柱，使酸液通过树脂进行交换，再用水洗去酸液。接着再用1～2mol/LNaOH（或NaCl）进行交换，再用水洗去碱液，复用2mol/LHCl浸泡后通过树脂，用水洗去酸液后即可再用。树脂不用时应加水，保存在广口瓶中。
【基本操作注意事项】
1.苦参粗粉过10目筛即可，不宜太粗或太细。
2.树脂使用前应用水充分膨胀，否则交换效率低，重现性差。
3.喷改良碘化铋钾试液前薄层板上残留展开剂要挥干。
【思考题】
一、苦参生物碱的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。
二、（1）离子交换树脂分离苦参生物碱的基本原理是什么？
（2）为什用氢氧化钠制硅胶板？为什么苦参碱、氧化苦参碱用不同的展开剂？二者的展开剂交换使用结果会怎样？
（3）树脂再生应注意什么问题？
陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心
叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。 2. 叶绿体色素的分离 (1)将11cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条。 (2)用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。 (3)在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中，而色点略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。 0.5-1小时后，观察色素带分布：最上端橙黄色(胡萝卜素)，其次黄色(叶黄素)，再崐次 蓝绿素(叶绿素a)，最后是黄绿色(叶绿素b)。（4）当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实 验，此时可看到不同色素的同心圆环，各色素由内往外的顺序为：叶绿素b（黄绿色）、叶 绿素a（蓝绿色）、叶黄素（鲜黄色）、胡萝卜素（橙黄色），再用铅笔标出各种色素的位置 和名称。
实验2-菠菜中色素的提取和分离
实验2 菠菜中色素的提取和分离 扬州大学化学化工学院张磊 091301223 一．实验目的： 1．了解分离与提纯过程在科学研究和生产生活中的应用； 2．掌握分离与提纯实验设计的一般思路和方法； 3. 掌握菠菜中色素提取的原理，步骤和影响因素； 二．实验原理： 1．叶绿体中的色素是有机物，不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂中，所以用石油醚、乙醇等能提取色素。 2．本实验选用的是吸附色谱，氧化铝作为吸附剂（极性），色素提取液为吸附液，色素提取液中各成分极性大小为：叶绿素b（黄绿色）>叶绿素a（蓝绿色）>叶黄素（黄色）> β-类胡萝卜素（橙色）。 2
3. 柱层析法的分离原理是根据物质在氧化铝上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被吸附，极性较弱的物质不易被吸附，所以由上到下为：叶绿素b（黄绿色），叶绿素a（蓝绿色），叶黄素（黄色），β-类胡萝卜素（橙色）。 三、实验材料： 仪器：研钵、分液漏斗、层析柱(20×10 cm)，表面皿，普通漏斗，量筒 试剂：石油醚、乙醇(95%)、菠菜叶、丙酮(化学纯)、中性氧化铝，无水硫酸钠 四、实验步骤与内容【探究：菠菜（或青菜）的处理方式】 （1）小组讨论处理菠菜的各种方式，然后按照“手撕”，“划几刀，再手撕”，“剪成丁状”，“剪碎后稍加研磨”，“研磨成浆”共五种方式分为五组进行实验，最后确定控制菠菜叶取25克，加入有机溶剂15mL（9mL石油醚+6mL乙醚），浸泡时间取25min为统一条件； 3
（2）开始分组实验，各自处理好各组的菠菜，放置在烧杯中，加入15mL有机溶剂并盖上表面皿浸泡25min。 （3）在浸泡的时间内开始装柱，首先在滴管下口装上橡皮管并夹上弹簧夹（夹紧），在管的出口处放入一小撮棉花，在棉花上放置已剪好的和滴管内径一般大小的圆形滤纸，然后用普通漏斗往里面装入中性氧化铝，最后在氧化铝上再加上和滴管内径一般大小的圆形滤纸，夹在铁架台上备用。 （4）25min后，把浸取液用纱布过滤，滤液转移至分液漏斗中，加等体积的水洗一次，弃去下层的水-乙醇层。石油醚层再用等体积的水洗二次。有机相用无水硫酸钠干燥后转移至烧杯中做柱层析分离。 （5）把得到的叶绿素分几次倒入柱中，缓慢放开弹簧夹，再用9:1的石油醚—丙酮溶液滴加，一段时间后在层析柱上出现了一条条的不同颜色的条纹，即叶绿素b，叶绿素a，叶黄素，β- 4
植物叶绿体中色素的提取与分离实验报告 用具：剪刀一把、干燥的定性滤纸、50ml的烧杯及100ml的烧杯各3个、白纸3张、试管架一个、研钵一个、玻璃漏斗一个、尼龙布或纱布、毛细血管一只、药勺一个、10ml 量筒一只，天平一只，试管3支、纸板一块、棉塞3个、培养皿3个、刻度尺、注射器一只、盖玻片 试剂：丙酮、无水乙醇、层吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、白沙（二氧化硅）、碳酸钙、碳酸钠 材料：新鲜的紫茎泽兰叶、其他野生植物叶片 背景资料： 1、叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。 2、叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。 3、破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合太，镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙，同时加入碳酸钠的道理亦如此。 4、在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸；（2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。 5、根据物理学中的毛细现象，画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。 6、由于液面的不同位置表面张力不同，纸条接近液面时，其边缘的表面的张力较大，层析液沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，在插入层析液的滤纸条一端剪去两个角。 7、为了防止滤纸条倒入层析液中而使层析实验失败。同时，防止因液体表面张力引起层析液沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。 8、色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。符合我国的资源友好型社会。 操作步骤 1．称取新鲜叶子2g，放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙(防止叶绿素被破坏）和石英砂（帮助研磨），研磨成匀浆，再加丙酮5ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。
绿叶中色素的提取与分离实验 一、实验原理 1、提取的原理：利用色素溶于有机溶剂无水乙醇而不溶于水的性质。 2、分离的原理：利用各种色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液在滤纸上扩散的速度不同。（纸层析法） 二、目的要求 1、进行绿叶中色素的提取和分离； 2、探究绿叶中含有几种色素 三、材料用具 1、材料：新鲜的绿叶（如菠菜、韭菜的绿叶）。 2、用具：剪刀、药匙、研钵、量筒、漏斗、试管、棉塞、尼龙纱布、盖玻片、试管架、干燥的定性滤纸、铅笔、直尺、烧杯、穿针的细线、滴管。 3、试剂：无水乙醇、层析液、二氧化硅（石英沙）和碳酸钙。 四、方法步骤 1、提取绿叶中的色素 （1）取深绿色的植物叶片，洗净，抹干水分，并称取5g，剪成小块置于研钵中。（2）在研钵中加入少许二氧化硅（SiO2）、碳酸钙（CaCO3），再加入6ml无水乙醇。（3）迅速、充分地研磨成糊状。 （4）在漏斗基部放一小块单层尼龙纱布，将研磨液迅速倒入玻璃漏斗中进行过滤。将滤液收集到试管中，及时用棉塞将试管口塞严。 剪碎绿叶加二氧化硅、碳酸钙，（迅速）研磨成糊状 再加入10ml无水乙醇 过滤收集滤液，棉塞封口 2、制备滤纸条（如下图） 3、画滤液细线（如下图） 滤纸条：长6cm，宽1cm，用盖玻片一端蘸取滤液，沿铅笔线画线， 距一端1cm处用铅笔和直尺等滤液细线风干后，再画下一道细线，重复 画一条细的横线。2—3次。画线要求：细、直、齐。
4、分离色素 将3ml 层析液倒入小烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）轻轻插入层析液中，随后用培养皿盖盖住小烧杯。注意：不能让滤液细线接触到层析液。 5、观察与记录 观察烧杯中滤纸条上出现了几条色素带，以及每条色素带的 颜色和宽度。 将观察结果记录下来，并将层析结果的分离结果贴在上面。 “培养皿法” 五、讨论 1、滤纸条上有几条不同颜色的色带？其排序怎样？宽窄如何？这说明了什么？ 2、滤纸条上的绿叶细线为什么不能触及层析液？ 3、将有色素带的滤纸条夹在书里，几天后会出现什么现象？这说明了什么？ 4、到了秋天叶色变黄、变红的原因是什么？ 注：无水乙醇-------------------溶解、提取色素 二氧化硅（SiO 2）--------研磨充分 碳酸钙（CaCO 3）--------防止色素破坏 层析液----------------------分离色素 胡萝卜素叶绿素b 叶绿素a 叶黄素 橙黄色 黄色 蓝绿色 黄绿色
叶绿素的提取和分离 --------新兴惠能中学李广梅 一、.教学内容 《捕获光能的色素和结构》是人教版高中生物第一册《分子与细胞》第5章第4节《能量之源──光与光合作用》的第1节课教学内容，主要学习叶绿体的结构和色素的种类，掌握提取、分离色素的实验技巧，学习科学家探索光合作用原理的科学思维和科学方法。 二、学生分析 在实验操作方面，学生已经能进行研磨、过滤等操作，但纸层析法是首次进行，需老师仔细指导。掌握有关化学试剂的使用方法与技巧，可能存在一定的难度。 三、设计思想 （1）以问题引发兴趣。整个教学过程要设置好问题，层层展开，层层递进，让新知识与旧知识融为一个整体，让学生在步步上升中攀登到知识的顶峰。 （2）以实验说明结论。生物学的教学就是实验的教学过程，实验的展示形式有学生分组实验、老师示范实验、动画和图片演示实验等，让实验现象说明问题，而不是直接让学生记住结论。 （3）科学探究的思想贯彻始终。用科学家的经典实验来学习科学的实验方法和思维，在学生分组实验中学习设计实验的基本原则，学会分析实验，改进实验，学会科学地评价自己。 四、教学方法 学生自主、探究、合作学习与师生共同探究相结合（含自学、实验、讨论、讲授等）。 五、.教学目标 （一）知识目标 掌握绿叶中色素的提取和分离的方法及操作技巧。 概述绿叶中色素的种类和作用。 （二）情感态度与价值观 通过实验设计与实施，形成科学态度观，培养观察能力以及合作的科学精神。 六、教学的重点和难点
绿叶中色素的提取和分离的操作技巧。 对实验进行自我评价，总结成功与失败之处。最后总结出绿叶中色素的种类和含量的多少。 七、教学过程
叶绿素a测定实验报告 （一）实验目的及意义 水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。 （二）水样的采集与保存 1.确定具体采样点的位置 2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍 3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L 4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL 5.将采样瓶拧上并编号 6.用GPS同步定位采样点的位置 （三）仪器及试剂 仪器： 1.分光光度计 2.比色池：10mm 3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm） 4.研钵 5.常用实验设备 试剂： 1.碳酸镁悬浮液：1%。称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。每次使用时要充分摇匀 2.乙醇溶液 （四）实验原理 将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。 将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。 （五）实验步骤 1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。 2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。 3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。 4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。
实验二、叶绿体色素的提取、分离与性质分析 一、实验目的 ?掌握叶绿体色素的提取方法；掌握板层析法分离叶绿体色素的原理和步骤；掌握叶绿体色素的部分理化性质。 二、实验原理 （一）叶绿体色素： 1.叶绿素 叶绿素a：叶绿素b=3：1 2.类胡萝卜素 胡萝卜素：叶黄素=2：1 叶绿素：类胡萝卜素=3：1 （二）叶绿素的光学性质 叶绿素a在663nm有吸收峰；叶绿素b 在645nm有吸收峰。但在蓝光区也有一个吸收峰。 胡萝卜素和叶黄素的吸收峰是在蓝光区（440nm）。 三、叶绿素含量测定： 1．取新鲜叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉）混匀。 2．称取剪碎的新鲜样品1.0g ，放入研钵中，加少量石英砂及2－3ml （或80％丙酮）研成匀浆，继续研磨至组织变白，静置3－5分。 3．取滤纸1张，置漏斗中，用80％丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒人漏斗中，过滤到25ml。 4．用滴管吸取80％丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。 直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80％丙酮定容至25ml，摇匀。 5．把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以80％丙酮为空白，在波长663nm、645nm下测定吸光度。 6 计算：按下列公式： Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645 Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663 C总(mg/L) = Ca+ Cb分别计算叶绿素a、b的浓度。 四、光合色素鉴定（板层析） ?支持物：硅胶层析板 ?流动相：石油醚：丙酮：（v：v=65：35） ?步骤：1、取板划线 2、点样 3、配展开剂 4、展开 5、前沿到达2/3处时停止，取出凉干并观察各色素带计算Rf值 叶绿素a：蓝绿色；叶绿素b：黄绿色；胡萝卜素：桔黄色 叶黄素：黄色 六：叶绿素前驱物的荧光观察 七、作业 1、计算你的实验中植物叶片中叶绿素的含量。 ２．研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？ ３．画图说明叶绿体色素板层析结果，并解释原因。
叶绿素的提取和分离实 验报告 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
陕西师范大学远程教育学院 生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心 叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH
HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75
叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成及测定生物资源系食卫101 韦琪（20102023） 指导老师：张倩、刘新梅 一、实验目的 1.从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率； 2.研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件； 3.分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率； 4.通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。 二、实验原理 蚕沙是桑蚕的排泄物，由蚕沙制取天然色素——叶绿素酮钠盐，是国外普遍采用的最佳途径。叶绿素是一种酯，因此不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。 叶绿素是植物吸收太阳能进行光合作用的主要色素，叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．高等植物中含有叶绿素a和叶绿素b分子式如下： 蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。 叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：
C55H72MgN4O5 + 2 NaOH →C34H30O5N4MgNa2 + CH3OH + C20H39OH 在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸： C34H30O5N4MgNa2+ 4 H+→C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+ 叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐： C34H34O5N4 + Cu2+→C34H34O5N4Cu + 2 H+ C34H34O5N4Cu + 2 NaOH →C34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O 由叶绿素转化成叶绿素铜钠的过程也可用化学反应方程表示： （1）皂化： COOCH3COONa C32H30ON4Mg + 2NaOH → C32H30ON4Mg + CH3OH + C20H39OH COOC20H39 COONa （2）酸化： COONa COOH C32H30ON4Mg + 2H2SO4 → C32H30ON4H2 + MgSO4 + NaSO4 COONa COOH （3）铜代： COOH COOH C32H30ON4H2 + CuSO4 → C32H30ON4Cu + H2SO4 COOH COOH （4）成盐： COOH COONa C32H30ON4Cu + 2NaO H → C32H30ON4Cu + 2H2O COOH COONa 三、实验仪器和试剂 1.仪器：（一个），分液漏斗（2个）,250mL锥形瓶（1个），烧杯（100ml、250 mL、 500mL ）各1个，容量瓶（100mL、250mL）各1个，蒸馏装置，减 压过滤装置，玻璃棒，电子天平，圆底烧瓶（250mL）2个，酸度计， 分光光度仪（一台）。 2.试剂：（50g）、95%乙醇，丙酮，石油醚，2%～5%NaOH乙醇溶液，硫酸铜溶
绿叶中色素的提取和分离实验 1．叶绿体色素的纸层析结果显示，叶绿素b位于层析滤纸的最下端，主要原因是( ) A．分子量最小 B．分子量最大 C．在层析液中的溶解度最低 D．在层析液中的溶液度最高 2.为研究高光强对移栽幼苗光合色素的影响，某同学用乙醇提取叶绿体色素，用石油醚进行纸层析，如图为滤纸层析的结果(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为色素条带)。下列叙述不正确的是( ) A．强光照导致了该植物叶绿素含量降低 B．类胡萝卜素含量的增加有利于该植物抵御强光照 C．色素Ⅲ、Ⅳ吸收光谱的吸收峰波长不同 D．画滤液线时，滤液在点样线上只能画一次 3．下图为新鲜菠菜叶中四种色素的相对含量及在滤纸条上的分离情况。下列说法不正确的是( ) A．叶绿体中的四种色素分布在类囊体薄膜上 B．四种色素均可溶于有机溶剂无水乙醇中 C．四种色素在层析液中溶解度最大的是甲 D．发黄的菠菜叶中色素含量显著减少的是甲和乙 4．下列关于绿叶中光合色素的提取和分离的叙述，不正确的是( ) A．用无水乙醇提取到的各种色素的含量不同
B．色素在层析液中的溶解度不同，导致在色素带的位置不同 C．研磨绿叶时不加CaCO3，则滤纸条上四条色素带变窄的比例相同 D．只画一次滤液细线会导致滤纸条上四条色素带的宽度变窄 5．下列关于“菠菜叶中色素的提取和分离”实验的相关叙述，错误的是( ) A．提取色素后，试管不加棉塞会导致滤液颜色变深 B．若发现菠菜严重缺乏Mg，则会导致叶绿素的含量降低 C．菠菜叶中含量最多的色素在层析液中的溶解度最小 D．光合色素的获得至少需要破坏3层磷脂双分子层 6．苋菜叶片细胞中除了叶绿体含有色素外，液泡中也含有溶于水但不溶于有机溶剂的花青素(呈现红色)。某探究小组用适量体积分数为95%的酒精提取苋菜叶片中的色素，然后用层析液分离。层析结束后滤纸条上出现了不同的色素带，对色素带由上到下分析有关叙述正确的是( ) A．第一条色素带对应的色素是叶黄素 B．第二条色素带对应的色素主要吸收蓝紫光 C．第三条色素带对应的色素是呈现红色的花青素 D．第四条色素带对应的色素在层析液中溶解度最大 7．列关于“绿叶中色素的提取和分离”实验的叙述，不正确的是( ) A．可以用无水乙醇提取叶绿体中的色素 B．叶绿体中色素能够分离的原因是不同色素在层析液中的溶解度不同 C．研钵中需加入二氧化硅、醋酸钙、无水乙醇和绿叶 D．滤液细线要画得细而直，避免色素带间的部分重叠 8．颜色变化常作为生物实验结果观察的一项重要指标，下列叙述正确的是( ) A．烘干的口腔上皮细胞经健那绿染液染色后，线粒体呈蓝绿色 B．取新鲜的菠菜叶，加人少许SiO2和无水乙醇，研磨液呈黄绿色，原因是菠菜叶用量太少C．紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞发生质壁分离复原过程中，细胞液颜色变浅是液泡里的色素渗透出细胞所致 D．吡罗红染色剂可将口腔上皮细胞大部分染成红色 9．在做“绿叶中色素的提取和分离”实验时，甲、乙、丙、丁四位同学使用相关试剂的情况如表所示(“＋”表示使用，“－”表示未使用)，其余操作均正常，他们所得的实验结果依次应为( )
一、实验目的： 1、了解植物组织中叶绿素分布及性质。 2、掌握测定叶绿素含量的原理和方法。 3、了解紫外分光光度计的用法。 4、了解一阶导数的含义。 5、了解如何如何排除互相干扰。 二、实验原理： 叶绿体中的色素都能够溶解于有机溶剂丙酮中，所以，可以用丙酮提取叶绿体中的色素。 层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂。根据叶绿体中的四种色素在层析液中的溶解度不同来进行分离，溶解度高的在滤纸上扩散的快，溶解度低的扩散地慢。溶解度最高的是胡萝卜素，它随层析液在滤纸上扩散得最快，叶黄素和叶绿素a的溶解度次之；叶绿素b的溶解度最低，扩散速度最慢。这样，四种色素就在扩散过程中分离开来。 叶绿素a和叶绿素b的分子结构相似，它们的吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱重叠，用常规分光光度法和荧光方法难以实现其同时测定。但利用一阶导数光谱技术和同步荧光技术，消除了叶绿素a和叶绿素b的光谱干扰，可以同时测定它们的含量。 在600~700之间胡萝卜素一阶导数为零，没有吸收，在某个特定波长下，叶绿素a有一定的导数值，而叶绿素b的导数为零；同理，在另一个特定波长下，叶绿素b有一定的导数值，而叶绿素a的导数值为零。这样可以实现叶绿素b和叶绿素b的同时测定，又不受胡萝卜素的干扰。 三、实验材料： 1、仪器 干燥的定性滤纸、烧杯（100ml）、研钵、玻璃漏斗、分液漏斗、剪刀、小试管、试剂瓶、药勺、量筒（10ml)、天平、试管架、载玻片、铅笔、 直尺、棉花、移液管、洗耳球、毛细吸管、铁架台、胶头滴管、紫外分光 光度计。 2、药品 新鲜的菠菜叶、石英砂、碱式碳酸镁、90％丙酮、层析液（石油醚：丙酮：苯=20:2:1） 四、实验方法与步骤： 1．提取叶绿素中的色素 （1）取几片绿叶，去掉主脉，用天平称取20g叶片，剪碎，放入研钵。 （2）向研钵中加入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨。用量筒量取15ml丙酮。倒入研钵中，迅速充分研磨。 （3）将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤。将滤液收集到一个小试管中，及时用棉塞将试管塞紧。 2.制备过滤纸 取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长6cm，宽1cm的滤纸条，
《叶绿体色素的提取和分离》实验报告 实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 实验原理 叶绿体色素包括绿色的叶绿素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色的类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类,它们均以色素蛋白复合体形式存在于类囊体膜上。两类色素均不溶于水而溶于有机溶剂,故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。由于提取液中不同色素在固定相和流动相中的分配系数不同,所以可借助分配层析方法将其分离。 实验仪器与药品 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸(直径11cm)。 3. 95%乙醇、石英砂、碳酸钙、展层剂。展层剂按石油醚:丙酮:苯10:2:1的比例配制(V/V)。 实验步骤 1. 叶绿体色素的提取
(1)取菠菜或其它新鲜植物叶片4~5片(4g左右),将其洗净、擦干并去掉中脉,剪碎后置入研钵中。 (2)研钵中加入95%乙醇2~3 ml及少许石英砂、碳酸钙研磨至匀浆,再加95% 乙醇5ml,然后以漏斗过滤之,即为色素提取液。 2. 叶绿体色素的分离 (1)取圆形定性滤纸一张(直径应小于康维皿直径)于其中心扎一圆形小孔(直 径约3mm),另取长方形滤纸条一张(5cm×1.5cm),用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取 液沿滤纸条的长度方向涂抹,注意涂抹色素扩散宽度应限制在0.5cm以内,风干后再重复操作数次。然后沿长度方向将滤纸条卷成纸捻,使涂抹过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。 (2)将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中,使与滤纸刚刚平齐(勿突出)。 (3)在康维皿中央小室中加入适量的展层剂,把带有纸捻的圆形滤纸平放在康 维皿中央小室上,使纸捻下端浸入展层剂中,迅速盖好培养皿。展层剂将借助毛细管作用顺纸捻扩散至圆形滤纸上,使叶绿体色素在固定相(滤纸中吸附有水分的纤维素)和流动相(展层剂)间反复分配,从而使不同色素得到分离,分离结果为滤纸上可见到各种色素的同心圆环。无康维皿时亦可用底、盖直径相同的培养皿进行实验,实验时可在培养皿底中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖以替代康维皿中央小室盛装展层剂,其余相同。 (4)当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实验,此时可看到不同色素的同心 圆环,各色素由内往外的顺序为:叶绿素b(黄绿色)、叶绿素a(蓝绿色)、叶黄素(鲜黄色)、胡萝卜素(橙黄色),再用铅 笔标出各种色素的位置和名称。
从菠菜中提取叶绿素实验报告三篇 【实验目的】 1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质的分离提纯与方法。 2、通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。 【实验原理】 叶绿色存在两种结构相似的形式即叶绿素a{C55H77O5N4Mg}和叶绿素 b{ C55H70O6N4Mg }；胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，有三种异构体；叶黄素C40H56O2是胡萝卜素的羟基衍生物。当提取时，从上到下颜色依次为：黄绿色，蓝绿色，黄色和橙色。 【实验仪器】 研钵，色谱柱，丙酮，乙醇，乙醚，中性氧化铝，菠菜叶，烧杯，漏斗，玻璃棒，滤纸，剪刀，脱脂棉，纱布。 【实验步骤】 1、称取30g洗净后用滤纸喜感的新鲜菠菜叶，用剪刀剪碎，放入研钵中研磨，研磨时放入少量碳酸钙，防止研磨过猛破坏叶绿素结构，研磨至烂。 2、将研磨碎的菠菜叶转入小烧杯中，加入30mL配好的乙醇乙醚溶液，盖上表面皿，防止有机溶剂蒸发。按小组成员分别浸泡 10,15,20,25,30,35,40,45,50,55分钟。 3、浸泡期间，填充色谱柱，在最下面垫入脱脂棉，再盖上一个小滤纸片，装入氧化铝至4/5处，再盖上一层滤纸片。
4、将烧杯中的菠菜叶连带着有机溶剂用纱布挤入漏斗中，转入分液漏斗，加入10mL水洗涤，除去水层（下层），再用10mL水洗涤一次。 5、将分页漏斗中的溶液慢慢倒入色谱柱中，加几滴丙酮既可以看到颜色变化。 6、洗净仪器，收拾实验室，打扫卫生。 【实验记录】 虽然分层现象不是非常明显，但是还是可以看得见分层现象。 【结果与讨论】 1、做这个实验的时候，我觉得不应该用纱布挤干，因为个人感觉很多色素都被 纱布吸走了，导致后来的实验现象没有很明显，经过对比，没用纱布直接过滤的同学做出的现象比用纱布做的现象要明显的多。 2、有机溶剂往往比较容易挥发，所以加入后要盖上表面皿。 3、此实验浸泡15分钟以后现象就可以很明显，因此以后在课堂上给学生演示的时候浸泡的时间不是越长越好的，15分钟足矣。 4、若最后颜色没有明显的分层，可以加入几滴丙酮帮助分层。 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素 b(C55H70O6N4Mg))，差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是
一．实验目地 、学习从植物中提取色素地方法. 、学习柱色谱(层析)地原理及其操作方法. 、掌握天然药物化学实验报告地一般写法. 二．实验原理 、绿色植物叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素.各种色素能溶解在有机溶剂（无水乙醇等）中形成溶液，使色素从生物组织中脱离出来.文档来自于网络搜索 、柱色谱是通过色谱柱来实现分离地.在色谱柱内装有固体吸附剂(固定相)如氧化铝或硅胶.液体样品从柱顶加入，当液体流经吸附剂时，由于吸附剂表面对液体中各组分吸附能力不同而按一定地顺序吸附.然后从柱顶加入洗脱剂(流动相)，样品中地各组分随洗脱剂按一定地顺序从色谱柱下端流出，根据不同颜色分段收集.吸附剂，常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁等.吸附剂对化合物地吸附能力与分子地极性有关，极性越强，吸附能力越大，分子中含有极性较大地基团，其吸附能力也越强.溶剂，溶剂分为溶解样品地溶剂和洗脱剂.选择溶剂时还要考虑到被分离物各组分地极性和溶解度.通常是先将要分离地样品溶于非极性溶剂中，从柱顶加入柱中.然后用稍大极性地溶剂使各组分在柱中形成若干谱带.再用极性更大地溶剂洗脱被吸附地物质.为了提高洗脱效果，有时也使用混合溶剂.在本实验中色素成分在不同比例混合洗脱剂地作用下可以分离出来.文档来自于网络搜索 三．实验仪器及试剂 仪器：烧杯、量筒、色谱柱、分液漏斗、玻璃棒、干燥地锥形瓶、滤纸、旋转蒸发仪、酸式滴定管、布氏漏斗、研钵、胶头滴管、剪刀、天平文档来自于网络搜索 试剂：新鲜植物叶、中性氧化铝、甲醇( ％，分析纯) 、乙醇、石油醚( ～％) 、丙酮、无水硫酸钠、正丁醇、新鲜植物叶、文档来自于网络搜索 四．实验内容 . 绿叶色素地提取 把新鲜绿叶洗净晾干或用滤纸吸干，称取绿叶，剪碎后放入研钵，再加入乙醇.研磨后用布氏漏斗抽滤，弃去滤渣.文档来自于网络搜索 将滤液放回研钵，每次用（体积比）地石油醚甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤.把两次滤液合并，转入分液漏斗中.用水洗涤两次，弃去水甲醇层, 洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化.石油醚层转入干燥地锥形瓶中用无水硫酸钠干燥.干燥后地液体在旋转蒸发仪上蒸除石油醚至体积约左右.文档来自于网络搜索 .柱色谱分离色素 取一支干净地酸式滴定管，向柱内加入石油醚至柱高约处.再缓慢加入氧化铝，并打开活塞，控制流出速度约为滴，并保持液面不低于固定相.打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下－高时关上活塞.注意，在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面.文档来自于网络搜索 色素浓溶液用滴管小心加到色谱柱顶部，并要旋转加入.加完后打开下部活塞，让液面下降到柱面以下左右关闭活塞.旋转加入数滴石油醚，重新打开活塞使液面下降，重复几次使有色物质全部进入柱体内，待色素全部进入柱体后，观察并记录下此时实验地现象.在柱顶小心加洗脱剂—石油醚丙酮溶液（体积比）.打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用试管收集.当第一个有色成分即将滴出时，取另一试管收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素.用石油醚丙酮（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素（）.再用丁醇乙醇水（体积比）洗脱叶绿素（蓝绿色）和叶绿素（黄绿色）.文档来自于网络搜索
谈对《叶绿素的提取与分离》实验的改进 摘要：从教材原实验及不足，到其他生物教师对实 验的创新改进以及对实验改进的体会，总结出实验并没有个固定的模式。为了达到实验目的，教师也要善于学习，勇于探索，敢于创新，这样才会影响到学生，使学生不拘泥于课本，养成质疑、求实、创新、勇于实践的科学精神和科学态度。 关键词：叶绿素的提取与分离实验；色素提取液；层析 液；实验改进 光合作用是高中生物学的重点和难点内容之一，叶绿体 是进行光合作用的场所。“叶绿素的提取与分离”是必修 《分子与细胞》中一个非常重要的实验。通过实验有助于学 生掌握叶绿体中色素的种类和含量，进而加深对光合作用相关内容的理解。教材对该实验设计了一个比较详细的实验方案，但学生按照教材的要求操作，实验成功率并不高。如何提咼实验成功率，许多生物教师在不断探寻。于是，在对教材原实验过程分析的基础上，将实验进行了一些创新改进，取得了较好的实验效果。笔者通过学习和实践，也受益匪浅，对实验教学有了更深的体会。 、教材原实验及不足
1）教材介绍：称取 5 g 绿色的叶片（如菠菜叶片） 剪碎，放入研钵中。向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙，再加入10 mL 无水乙醇，进行迅速、充分的研磨。将研磨液 迅速倒入玻璃漏斗（漏斗基部放一块单层尼龙布）进行过滤， 将滤液收集到试管中，及时用棉塞将试管口塞严。 （2）不足之处：①材料的选择受限，只能选择容易研 磨的叶片，革质叶等不能用。②材料用量多、所用药品多、所用仪器多、操作步骤多，所需时间长。③实验中对二氧化硅和碳酸钙的用量不好把握，多了，难以过滤，而且会残留在滤液中，导致滤液杂质多，颜色浅；少了，研磨不充分，色素含量少，实验效果差。④迅速、充分研磨的程度难把握。 2.滤纸条的制备与画滤液细线 1）教材介绍：将干燥的定性滤纸剪成长和宽略小于 试管长和宽的滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，并在距这 端 1 cm 处用铅笔画一条细的横线。用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀画出一条细线。待滤液干后，再画一两次。 2）不足之处：色素带分离效果的好坏与滤液细线划 得是否细、直、齐直接相关。学生在实际操作时，往往难做到，结果色素带弯弯曲曲，或者滤液细线中色素过少，色素带颜色很淡不易区分。
叶绿体色素的提取、分离 及理化性质的测定 班级：11级生科2班 组员：XXX XX 实验名称：叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
实验原理：叶绿体色素又称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包括叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色），后者包括胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色），它与们类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取。 层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即一种液体或气体）带动着试样经过固定相（一种支持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同，以及这些色素分子在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子向四周移动时，各种色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合色素分离，出现不同颜色的环。将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，种这现象称为荧光现象。在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激状发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量子。叶绿素的化学性质很
不稳定，容易受强光、高温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏。 材料与设备试剂： 1. 材料 新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。 2. 设备 电子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤纸、小漏斗等。 3. 试剂 丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6mol/L 盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙等。 方法与步骤： 一、1. 叶绿体色素的提取 2. 取菠菜或其他植物新鲜叶片5g，洗净，擦干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中。
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从菠菜中提取叶绿素实验报告文档 前言语料：温馨提醒，报告一般是指适用于下级向上级机关汇报工作，反映情况， 答复上级机关的询问。按性质的不同，报告可划分为：综合报告和专题报告；按行 文的直接目的不同，可将报告划分为：呈报性报告和呈转性报告。体会指的是接触 一件事、一篇文章、或者其他什么东西之后，对你接触的事物产生的一些内心的想 法和自己的理解 本文内容如下：【下载该文档后使用Word打开】 从菠菜中提取叶绿素实验报告一 【实验目的】 1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质的分离提纯与方法。 2、通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。 【实验原理】 叶绿色存在两种结构相似的形式即叶绿素a{C55H77O5N4Mg}和叶绿素b{C55H70O6N4Mg}；胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，有三种异构体；叶黄素C40H56O2是胡萝卜素的羟基衍生物。当提取时，从上到下颜色依次为：黄绿色，蓝绿色，黄色和橙色。 【实验仪器】
研钵，色谱柱，丙酮，乙醇，乙醚，中性氧化铝，菠菜叶，烧杯，漏斗，玻璃棒，滤纸，剪刀，脱脂棉，纱布。 【实验步骤】 1、称取30g洗净后用滤纸喜感的新鲜菠菜叶，用剪刀剪碎，放入研钵中研磨，研磨时放入少量碳酸钙，防止研磨过猛破坏叶绿素结构，研磨至烂。 2、将研磨碎的菠菜叶转入小烧杯中，加入30mL配好的乙醇乙醚溶液，盖上表面皿，防止有机溶剂蒸发。按小组成员分别浸泡10,15,20,25,30,35,40,45,50,55分钟。 3、浸泡期间，填充色谱柱，在最下面垫入脱脂棉，再盖上一个小滤纸片，装入氧化铝至4/5处，再盖上一层滤纸片。 4、将烧杯中的菠菜叶连带着有机溶剂用纱布挤入漏斗中，转入分液漏斗，加入10mL水洗涤，除去水层（下层），再用10mL 水洗涤一次。 5、将分页漏斗中的溶液慢慢倒入色谱柱中，加几滴丙酮既可以看到颜色变化。 6、洗净仪器，收拾实验室，打扫卫生。 【实验记录】 虽然分层现象不是非常明显，但是还是可以看得见分层现象。【结果与讨论】 1、做这个实验的时候，我觉得不应该用纱布挤干，因为个人感觉很多色素都被 纱布吸走了，导致后来的实验现象没有很明显，经过对比，