1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液：
将蛋白溶解在：
·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。
溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法：
·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚
蓝。
2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。
·将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。
在-18?C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素，
2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。
3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。
尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。
CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合
还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE
载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。
经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。
***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。再水化至少需要十个小时。
矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。
****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。
4.可选操作：加入分子量标准蛋白。
分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，然后加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。
其它可选的方法是，将标准蛋白以15-20 μl的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上。如要少加样量，将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上。然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧的凝胶表面。进行考马斯亮蓝染色标准溶液的各种蛋白成分必须含有200-1000 ng；而进行银染色必须在10-50 ng之间。
5.****上下电泳槽大概需要加多少电极缓冲液使上下电极与缓冲液相接触？
问题可能原因解决方法
开始电泳时无电流。在上下电泳槽中缓冲液
体积不够。
确保两个缓冲液储液槽盛有足
够的SDS电泳缓冲液，使上下
电极与缓冲液相接触。
第二向电泳分离速度太慢。SDS电泳缓冲液制备不
正确或溶解凝胶缓冲液
制备不正确。
重新配制新鲜的溶液。
丙烯酰胺溶液储存时间
太久。
配制新鲜的单体储存液。
染料前沿边缘向上弯曲（微笑样）凝胶没有正确降温。在电泳过程中，用恒温循环水浴
对凝胶进行冷却降温。
在底部储存槽中尽可能多地使
用缓冲液。
电流强度或功率过大。按表20推荐值限定电流或功
率
染料前沿向下弯（皱眉样）凝胶在垫片附近聚合不
完全。
除去凝胶溶液中的气体或增加
过硫酸铵和TEMED量的50%。
仪器安装不正确
（SE600）。
确保密封管条没有收缩。
上部储液槽渗漏。在上部储液槽中确保有足量的
缓冲液。
第二向分离电流高、速度慢密封装置的槽未被胶模
具或空白插板
由于阴极或阳极缓冲液
过量导致两种缓冲液混
合
确认12个插槽都被占满
下槽不要超过建议体积(7.5 L)。
电泳单元完全装好后确认阳极
液面没有超过密封装置。如果多
余的阳极缓冲液在上槽，需要排
出。
确认阴极缓冲液的液面没有超
过上槽角落的通气孔。可通过在
装胶前向下槽加入溴酚蓝染料
来加入来检查上下槽的混合。几
滴1%溴酚蓝足够染阴极液
染料前沿
不规则。
凝胶聚合不均匀。
第二向上表面不平
在放置IPG胶条时破坏
了凝胶上表面
凝胶与玻璃板之间存在
气泡
凝胶和玻璃板之间存在
液体除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。灌胶后立即用水饱和丁醇来覆盖凝胶表面
在放置IPG胶条时小心不要损坏凝胶
用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体
确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动
凝胶一侧染料前沿明显向下弯曲凝胶与垫片之间的缝隙
未被填充
预制凝胶模具未正确合
住
在封IPG胶条时，确认密封液
也封住凝胶与垫片之间的缝隙
确认模具合闭正确，重新电泳
2-D图像扭曲凝胶与玻璃板之间存在
气泡
凝胶与玻璃板之间存在
液体
第一向存在干扰性物质
用滚子除去凝胶和玻璃板之间
的气泡和多余的液体
确认无可见的气泡，凝胶紧贴着
玻璃板，不可移动
样品中的干扰性物质会导致扭
曲或IPG胶条局部肿胀，这些
变化又会影响第二向。改变样品
制备方法限制污染物
2-D图像垂直缺失IPG胶条和第二向凝胶
上表面之间存在气泡
确认IPG胶条和第二向凝胶上
表面之间没有气泡
垂直拖尾平衡液配制不正确
蛋白从IPG胶条向第二
向转移不充分
平衡不够根据说明准备平衡液
在转移步骤中采用低功率和低电流。如果需要延长转移步骤时间
延长平衡时间
垂直出现双点或“重点”IPG胶条放置不正确确认IPG胶条的塑料支持膜紧
贴着第二向胶的玻璃板
高分子量蛋白损失平衡液准备不正确
蛋白从IPG胶条向第二
向转移不充分
根据说明准备平衡液
在转移步骤中采用低功率和低
电流。如果需要延长转移步骤时
间
干胶条的尖端是酸性端，应当正对着正极（+）。
6. 12.5%凝胶制备：丙烯酰胺16.7ml；分离胶缓冲液10ml ；10×SDS 400μl；无菌水12.8ml；10％过硫酸胺200μl；TEMED*13.3μl
*在灌胶之前加入，药品配制：丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许
附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）
7.植物组织蛋白质提取方法(summer)
三氯醋酸—丙酮沉淀法
（1）在液氮中研磨叶片
（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1
小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4）上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml）
，使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样
适用，只是电泳的条带会减少！
8.蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入
10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇），再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37℃育30min，（含有尿素的溶液加热温度不能超过30°）期间搅动几次，16000 r/min离心15 min28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰），离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
9.双向电泳操作步骤及相关溶液配置
一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：
1. 样品的溶解
取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振荡器上振荡10min 左右，共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80℃保存。
2. Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA 溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液（10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液（磷酸盐缓冲液）复溶），再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml 的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，
2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。（测量过程要在一个小时内完成）。
3. 双向电泳第一向——IEF（双向电泳中一律使用超纯水）
3.1 水化液的制备
称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后，加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合，13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶
分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels （18cm，pH 3-10）胶条，从正极到负极将胶条压入槽中，胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油（Bio-Rad），两个上样槽必须与底线齐平。
3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20℃）
S1 （30v, 12hr, 360vhs, step）
S2 （500v, 1hr, 500vhs, step）
S3 （1000v, 1hr, 1000vhs, step）
S4 （8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad）
S5 （8000v, 5hr, 40000vhs, step）共计44110vhs, 19.5小时
其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
用镊子夹出胶条，超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注：平衡时要注意保持胶面始终向上，不能接触平衡管壁。
平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker,转入SDS-PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml.
4. 双向电泳第二向——SDS-PAGE
4.1 配胶（两根胶条所用剂量）
4.2 灌胶
将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，倒入浓缩胶，正丁醇压胶，凝胶后，用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再加入超纯水，用保险膜封好。
4.3 转移
剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS-PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG 胶条贴靠在玻璃板上，加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上（琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好，水浴加热溶解，并保持烧杯中水处于沸腾状态，至用之前再拿出来），再将IPG 胶条缓缓加入SDS- PAGE胶面，其中不断补加5%的琼脂糖溶液，注意不能产生气泡。
4.4 跑胶
浓缩胶13mA 分离胶20mA 共约5.5个小时
实验相关试剂配制
1.Bradford 工作液
95%乙醇25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷
85%磷酸52ml 酸，最后超纯水定容至500ml.过滤后置于棕色瓶考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）2.裂解液
尿素8M
硫脲2M
CHAPS 4%
DTT 60 mM
Tris-base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）3. 水化液储液
尿素8M
硫脲2M
CHAPS 4%
Tris-base 40 mM
4. 分离胶buffer （pH8.8）250ml
SDS 0.4% 1g
Tris-HCl 1.5M 45.4275g
5. 浓缩胶buffer （pH
6.8）100ml
SDS 0.4% 0.4g
Tris-HCl 0.5M 6.07g
6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）250ml
Acr 29.2% 73g
Bis 0.8% 2g
7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）
甘氨酸43.2g 36g
Tris 9g 或7.5g
SDS 3g 2.5g
超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml
8. 0.5M Tris -HCl pH 6.8储液
6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml,3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9.平衡液储液
脲（即尿素）36g
甘油30% 30ml
SDS 1% 1g
0.5M Tris-HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml
10. 平衡液A（一根胶条）
DTT 20mg
平衡液储液10ml
11.平衡液B（一根胶条）
碘乙酰氨300mg
平衡液储液10ml
0.05%溴酚兰15ul （平衡液A、B均需临时配制）
12.0.5%琼脂糖10ml
琼脂糖0.05g
电极缓冲液10ml
溴酚兰25ul
补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4℃备用。
双向电泳常见问题 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？ 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ 这是因为BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 ％满）的矿物油。 3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？ 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。 5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 10. 怎样估计2D 胶上蛋白质点的分子量和pI 值？ 可以用BioRad 生产的2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。11. 为什么2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？ 横的脱尾可能是：1 ）一向等电聚焦不完全；2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3 ）
XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法 文件编号XXXX-02 制定部门研发部 版本A/0 页码1/3 生效日期2014/4/9 一、目的 建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。 二、范围与权责 适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。 品控主管负责审核。 三、原理 SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 四、实验仪器及试剂 1.DYCZ-24DN 双垂直电泳仪 2.DYY-8C 电泳仪电源 3.STS-2A 脱色摇床（水平） 4.标准蛋白Marker 5.平皿：直径150mm 6.TEMED:四甲基乙二胺 7.DTT:二硫苏糖醇 8.储存液 ①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。 ⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚 合的染料。 9. 工作液 ①A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操 作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。 ②B液—分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ③C液—浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ④10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中，
1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液： 将蛋白溶解在： ·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。 溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法： ·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚 蓝。 2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。 ·将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。 在-18?C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素， 2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。 3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。 尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。 CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合 还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE 载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。 经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。 ***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。再水化至少需要十个小时。 矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。 ****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。 4.可选操作：加入分子量标准蛋白。
蛋白质肽谱制备 1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。 ★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色 ★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒 2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。 ★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。 ★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤： ①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min ②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机） 3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min. 4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。 ★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。 6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。 7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。（冻干的肽段放-20度冰箱保存） 8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。） 9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。待干，再点0.5ul基质，上质谱。 溶液配制 1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中 2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:1 3. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中 4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中 5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug -20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。) 6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul） 7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液 8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1
双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景 1 双向电泳技术 1.1双向电泳技术概述 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。 1.2 双向电泳技术的原理 双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。IPG - DALT系统双向电泳技术原理简明：首先利用等电聚焦( isoelectric focusing ,IEF) 将蛋白质沿pH 梯度分离至各自等电点(isoelectric point ,pI)，通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulphate polyacryla -mide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)，通过分子量分离蛋白质。所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高，一般可分离
福建农林大学学报(自然科学版)第39卷第5期Journa l of Fujian A griculture and Forestry U n i versity(N a t ura l Sc i ence Ed iti on)2010年9月 锥栗果实双向电泳体系的建立 郑诚乐,钟凤林,潘东明,刘小芝 (福建农林大学园艺学院,福建福州350002) 摘要:通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同p H值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于p H4-7. 关键词:锥栗;蛋白质组;双向电泳 中图分类号:S664.2;Q946.33文献标识码:A文章编号:1671-5470(2010)05-0475-05 Establis h m ent of t wo-di m ensional electrophoresis syste m for chinquapin fruits Z HENG Cheng-le,Z HONG Feng-li n g,PAN Dong-m ing,LI U X iao-zh i (Co lleg e o fH o rti culture,Fu ji an A g ricu lt ure and F orestry U niversity,Fuzhou,F uji an350002,Ch i na) Abstrac t:T he conven tiona l t w o-di m ensi onal electropho res i s techno l ogy w as i m proved i n o rder to deve l op an appropriate approach for proteo m ics of ch i nquapin fruits.T he study w as done by opti m izi ng different prote i n extraction me t hods and co m pa ri ng IPG str i ps at d ifferen t p H values.W it h the i m proved pro tein extraction m ethod,a stab l e,reproduc i b l e and h i gh reso l u tion2-D e l ectrophoresis m ap w as obta i ned.A fter sil ver staini ng,m ore than400prote i n spo ts w ere detected,w ith t he ir isoe l ec tric po i nts(pI)m a i nly at p H 4-7. K ey word s:chinquapi n(Castanea henry i R ehd.&W il s.);pro teom e;t w o-di m ensi onal e l ec trophoresis 双向电泳(t w o-d i m ensional e lectropho resis,2-DE)是蛋白质组学研究中的核心技术之一,是目前常用的能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法,广泛应用于生物学研究的各个方面.双向电泳技术利用蛋白质的等电点和相对分子质量差别将各种蛋白质区分开来,其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段.对蛋白进行分离、鉴定,分析特异蛋白的功能及其作用机制已成为当今研究热点[1-3]. 锥栗(Castanea henry i Rehd.&W ils.)是我国南方栽培驯化最早、利用最久的经济林树种之一,也是我国古老的名特优稀落叶果树[4,5].锥栗果实外形光洁美观、果肉细嫩香甜,含有淀粉、糖、蛋白质等主要营养成分及18种钙、锌、磷、钾、铁等矿物质[6].目前对锥栗果实营养品质的研究主要集中在成分分析方面[4-9],有关其营养品质的变异和相关性的研究尚未见报道.应用双向电泳对锥栗蛋白质组分进行质谱分析在国内外都少见报道.因此,本试验通过建立适于处暑红锥栗果实蛋白质分离的双向电泳体系,对蛋白质样品的制备、电泳参数和固相p H梯度干胶条等进行优化,以期提高锥栗果实蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,得到适于其分析的双向电泳试验条件. 1材料与方法 1.1试剂与仪器 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、I PG胶条(pH3-10,13、18c m;p H4-7,13、18c m)、I PG buffer(p H3-10;p H4-7)、胶条覆盖液(矿物油)、Phar m y lte、碘乙酰胺、C HAPS、二硫苏糖醇(DTT)和TE M ED均购自Am ersha m Phar m acia公司;苯甲基磺酰氟(P M SF)购自Sig m a公司;其他试剂为国产分析纯. 收稿日期:2009-09-22修回日期:2010-03-10 基金项目:国家支撑计划项目(2007BAD07B01);福建省科技厅资助项目(K02058). 作者简介:郑诚乐(1963-),男,副教授,博士.研究方向:果树栽培.Ema i:l zcl2003@126.co m.通讯作者潘东明(1956-),男,教授,博士生导师.研究方向:果树栽培生理及生物技术.Em ai:l pdm6666@126.co m.
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合
对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具 （1）移液器、吸头、锥形瓶 （2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 （3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并
电泳原理 阳极电泳用水溶性树脂是一种高酸值的羧酸盐，在水中溶解后以分子和离子平衡 状态存在于直流电场中，通电后，由于两极的电位差，离子定向移动，阴离子沉积在阳极表面，而阳离子在阴极表面获得电子还原成胺，它是一个电化学反应，包括电泳、电解、电沉 积和电渗四个同时进行的过程。 1.电泳：在直流电压作用下，分散在介质中的带电胶体粒子在电场作用下向与其所 带电荷相反的电极方面移动，叫电泳。 2.电沉积：阴离子树脂放出电子沉积在阳极表面，形成不溶水的漆膜，此过程叫电 沉积。 3.电渗：电泳逆过程，当阴离子树脂在阳极上，吸附在阳极上的介质在内渗力的作 用下，从阳极穿过沉积的漆膜进入漆液，称电渗。 4.电解：电流通过漆液时水便发生电解阴极放出氢气，阳极放出氧气，此过程 即为电解。 电泳涂料 有人说，电泳涂料可划分为三代，第一代为环氧树脂涂料，第二代为丙烯酸树脂涂料， 第三代为聚氨酯涂料。由于环氧涂料主要应用于汽车底盘，第三代主要用于阴极电泳漆，涂覆于首饰表面，故目前主要介绍第二代，即丙烯酸树脂涂料。此树脂如一团乱麻，羧基藏于里，胺基接于外,其中最先的羧基有70%被胺基取代，因其树脂中存在-COONHR，使树脂成为水溶性。铝型材表面涂覆的丙烯酸树脂多采用胺基树脂为固化剂进行交联固化，同时， 涂料分子均匀性对工艺操作有很大影响，一般说，乳化越好，分子越均匀。 涂装工艺流程 1 .除油：如有酸回收装置，推荐采用碱性除油，因碱性除油后，铝型材表面比较光亮，且 不会与后面的碱蚀发生副作用，如用碱性除油，其主要成份是 Na 2 CO 3 和NaOH。 2 .水洗：自来水洗去前道工序的酸或碱。 3 .蚀：加入碱蚀剂的碱蚀工序，会降低型材表面光亮度，但效果并不十分明显,主要应注意不可使槽中Al 3 含量过大，温度过高，否则易产生洗不去的花斑，涂漆烘干后呈黄色。 二道水洗：最好有喷淋或加大溢流，以保证清洗彻底。 除灰：用HNO 3 效果较好，但要注意加强水洗（最少二道+喷淋）。 水洗：自来水用H 2 SO 4 除灰，一道水洗即可，用HNO 3 除灰，需二道水洗 氧化：H 2 SO 4 氧化一般为20min，使氧化膜达到9ｕ，某些公司推销的所谓的 高温氧化剂，其主要成份是一种混酸，建议不要使用，对氧化膜的色泽、硬度、可着色性均 无好处。 水洗：自来水二道加大溢流。 着色：用单锡盐、单镍盐、锡镍复合盐均可，注意不要有色差，因为色差会在 电泳涂漆后加大。 水洗：最好加喷淋，以期尽量减少对后道工序酸的带入量。 热纯水洗：要求电导率＜100ｕs/cm，温度70-80℃，PH=4-6，尤其是银白涂漆型材或氧化中电压较大的型材应在此槽中处理较长的时间，PH值可用三乙胺进行调整。
附：双向电泳完整的操作步骤 （一）第一向等电聚焦 1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。 2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。 3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。 4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。 5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。 8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。 （二）第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。 3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 4. 配制胶条平衡缓冲液I。 5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 7. 配制胶条平衡缓冲液II。 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
双向电泳操作步骤 水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出IPG 胶条，室温放置10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化11~15h。 第一向等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I ，在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 6. 配制胶条平衡缓冲液II 。 7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。 9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。 10. 在100ml 量筒中加入TGS 电泳缓冲液。 11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。 13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。 14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。
双向凝胶电泳技术原理与应用 Principle and application of two-dimensional gel electrophoresis 姓名：XX 班级：检验本科1113班 学号：XXX 【摘要】人类基因组计划与美国塞莱拉遗传信息公司于2001年在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱，至此，人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。包括蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组学和结构基因组学等新的概念的提出，蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2.DE）是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一 【abstract】Human gene group plans and United States sailaila genetic information company Yu 2001 in United States Science under magazine and United Kingdom natural under magazine joint announced, they draws out has accurate, and clear, and complete of human gene Group map, at this point, human gene group plans has basic completed, as Hou gene group era of comes, protein group learn get has unprecedented of development, protein group research aimed at reveals gene express of real implementation life activities of all protein of express law and biological function. Includes proteome, proteomics, structural proteomics and functional genomics of new concepts, such as proposed, proteomics has become extremely active in the field of biological sciences. Two-dimensional gel electrophoresis (two-dimensional electrophoresis,2.DE) is one of the three key core technologies of proteome research
电泳实验细节 实验步骤操作要点： ① 每组将2只50 mL 、2只100 mL 容量瓶，3只200ml 烧杯洗净待用。 ② 用100ml 的容量瓶准确配制0.10 mol/L 的KI 、AgNO 3各100 mL 待用，并配置0.010 mol/L 两种溶液各50 mL 备用。 ③ 用0.010 mol/L 的KI 和AgNO 3分别配制0.005mol/L 的KI 和AgNO 3新鲜溶液100 mL 待用。 ④ 在洗净的200 mL 烧杯中准确移入0.005 mol/L 的KI 26.0 mL ，在搅拌条件缓缓滴入22.0 ml 左右的0.005 mol/L 的AgNO 3，直至形成透明晶莹的AgI 溶胶。 ⑤ 将制备好的溶胶沿洗净的电泳管中央细管缓缓加入，使溶胶高度与电极管口插入的电极头部同高（图二中刻度6）。 ⑥ 沿电泳管的管壁（图中2）滴入0.005mol/L 的KNO 3辅助液，并且使辅助液要高出铂片约2 cm （图中刻度5），将滴加完KNO 3的溶液静置8-10分钟，观察辅助液与胶体间有无界面，无界面则重做。 ⑦ 打开电源之前,检查电源粗调旋钮是否在零位,若不在:一定要调至零点,然后再打开电源;再分别调节粗调 、细调两个旋钮,使电压稳定在160伏，电泳一段时间，使负极一端界面下降2.0 cm （即图中刻度5到刻度6）,记下移动所用时间（s ）.注意:关闭电源时, 电压粗调旋钮也必须调至零点,方可关掉电泳电源开关。 ⑧ 用导线测量两电极铂片间溶胶的长度。 相关公式：)]/(/[t /h 43002 L V E ）（πηζ?= h ：2cm ,E=81 ,V=160V , η：在试验温度下水的黏度80，L ：胶体的长度 ，t ：上升所用时间。
细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22μm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g
CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1）40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装 考马斯亮蓝G-250： 考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备： 1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）； 2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃； 3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶
第一部分蛋白质组学操作规程 一、蛋白质组学样品制备规程（01 ） P1. 双向电泳样品缓冲液选用的基本原则 P3. 细胞样品制备（分步）操作规程 P4. 细胞总蛋白提取操作规程 P5. 螺旋藻组织蛋白质提取方法 P6. 嗜热菌蛋白质提取方法 P7. TCA- 丙酮沉淀法样品制备操作规程 P9. 植物材料可溶性蛋白的双乙法制备流程 P10. 动物细胞的样品制备 P10. 动物组织的样品制备——胃 P11. 肺癌组织样品制备 P12. 食管癌样品制备 P13. 羊绒/毛蛋白提取 P13. 大鼠海马组织蛋白提取 P14. 使用Cibacron Blue 3GA Agarose 去除小鼠血浆/血清中的白蛋白P15. E.Coli 样品制备方法 P15. 微生物细胞样品制备操作规程 P16. 去除血浆/血清中的白蛋白和Ig-G P17. 植物根蛋白提取方法 P17. 2D-LC鼠肝样品shotgun消化实验路线 P18. 小鼠肝组织蛋白质提取方法 P18. 小鼠肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P25. 人肝蛋白质组织提取方法 P27. 人肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P27. 丙酮丁醇菌蛋白质提取方法（选用嗜热菌蛋白质提取方法） P27. 嗜碱菌蛋白质提取方法（尚在摸索阶段） P27. 脑脊液蛋白质提取方法 二、蛋白质定量标准操作规程（02 ） P1. 改良的Bradford 法测定蛋白质含量 P3. Lowry 法（DC 试剂）测定蛋白质含量 P5. Lowry 法测定蛋白质含量（自配试剂） P7. 安玛西亚定量试剂盒使用方法 P8. 利用微板（96 孔板）定量测定蛋白质浓度 P9. BIO-RAD PROTEIN ASSAY 使用方法P10. BCA Protein Assay Kit 使用操作规程 三、蛋白质电泳及凝胶染色操作规程（03） P1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 P3. 固相pH 梯度-SDS 双向凝胶电泳实验操作程序