抗衰老Klotho基因的功能及与人类疾病的
关系
【关键词】 Klotho基因；基因表达；基因变异；衰老性疾病
抗衰老基因Klotho（KL）是1997年研究自发型高血压时发现的与衰老有关的基因〔1〕。该基因突变小鼠会过早出现与人类衰老相似的多种表现，并使其寿命缩短，而通过转基因使KL过度表达会减轻小鼠的衰老症状，延长寿命。研究显示KL基因缺陷鼠的寿命仅为野生鼠的5%～6%〔2〕，而其过度表达会使小鼠的寿命延长（雌性和雄性分别延长20%和30%）〔3〕。但是，KL基因的基础研究与人类衰老性疾病关系的研究较少。
1 KL的生物学特征
人和小鼠的KL基因定位于染色体13q12区域，大鼠定位于12q12区域，在KL基因结构中，其mRNA存在一个可变剪切位点，因而KL 能表达膜型和分泌型两种蛋白。免疫组化和PT PCR分析表明：KL 基因高表达仅限于肾脏和脑脉络膜〔4〕，但KL蛋白可对其他组织和细胞发挥作用，提示KL蛋白具有激素样作用〔5〕。
2 KL蛋白的功能
2.1 调节体内钙磷水平
体内钙、磷平衡通过3个器官系统的共同作用而维持：消化道、肾脏和骨骼。KL基因缺陷小鼠在衰老同时，往往伴发高钙血症和高磷酸盐血症，提示KL与钙磷代谢有密切的联系。成纤维生长因子23（FGF23）是一种来源于骨骼的激素，作用于肾脏，抑制磷的重吸收和维生素D（VD）的生物合成，增加尿磷排泄和抑制血清1,25(OH)2D3的水平〔6〕。研究证明，肾脏表达的KL蛋白其胞外区可与多种FGF 受体直接结合，在FGF23的信号传导过程中发挥协同受体的作用〔7〕。KL FGF23信号传导刺激增生并且阻止VD介导的凋亡〔8〕。因而，KL和FGF23可能以共同的信号通路调节体内的电解质平衡。KL缺陷大鼠会阻断KL FGF23的信号传导通路，导致体内1,25(OH)2D3产生增多〔1〕，血清1,25(OH)2D3高水平促进钙和磷在小肠的重吸收，导致高钙血和高磷血症〔2〕。1,25(OH)2D3增多可能是KL突变鼠产生衰老症状的主要原因。通过饮食控制磷和VD的摄入或剔除1a 水解酶基因〔编码1,25(OH)2D3合成酶〕可以减轻几乎所有的衰老表型，延长寿命〔4〕。血液中钙水平升高易导致血管和软组织产生异位钙化，这可能是KL缺陷鼠和FGF23敲除鼠出现几乎相同的生理和生化表现的原因。另一方面，膜型KL蛋白可通过增加肾远曲小管上皮细胞膜瞬时受体电位离子通道5（TRPV5）的表达，提高钙在肾脏的重吸收。TRPV5是表达于远曲小管上皮细胞的上皮性钙通道(钙通过此通道进行跨细胞重吸收)，参与维持体内钙平衡〔9〕。KL蛋白的胞外区
（KL 1和2）与糖苷酶家族1糖苷酶具有同源性，已证实KL蛋白具有微弱的葡糖苷酶活性，将重组KL蛋白加入人胚肾细胞(HEK293)细胞（一种表达TRPV5的人肾小管上皮细胞）的培养基中，会增加钙内流和细胞表面TRPV5的表达，说明KL蛋白葡糖苷酸酶活性对激活TRPV5离子通道起重要作用〔4〕。最近研究指出，人类细胞的KL蛋白胞外区通过水解TRPV5 N聚糖链的末端唾液酸而激活胞浆膜固有的TRPV5〔10〕。KL水解末端唾液酸使半乳素1结合于TRPV5，减少TRPV5的内化，增加TRPV5在胞膜表面的储留。KL与TRPV5和钙结合蛋白
D28(VD敏感的细胞内钙转运蛋白)共表达于远曲小管细胞，形成肾单位的特殊区域，使该处的钙进行跨细胞重吸收〔11〕。KL与TRPV5和钙结合蛋白D28的这种共定位对体内的钙平衡起重要作用。
2.2 抵抗氧化应激
机体代谢产生的活性氧类物质（ROS）是造成细胞损伤的重要原因，该损伤被称为氧化应激。氧化应激可引起许多生物大分子如DNA、脂类和蛋白质等的损伤，使细胞功能衰退，最终机体表现出衰老特征〔12〕，转KL基因可通过减少超氧化物的生成阻止自发性高血压的进展、减轻造成的肾脏损伤〔13〕。研究表明，对胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导通路适度抑制是抵抗衰老的机制之一〔14〕。KL 蛋白对胰岛素/胰岛素样生长因子1的调节包括哺乳动物在细胞和生物水平上对氧化应激的抵抗〔15〕。因为哺乳动物特异性转录因子
【篇一】人类基因组计划随着人类基因组计划的完成 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范
人类基因组计划及其意义 摘要：人类基因组计划意义深远，对人类健康、中医药、当代科学研究方法、甚至是商 业等都有影响。 关键词：人类基因组计划意义 人类从古至今都想揭开生命的奥秘，都想了解人类自身，探究人的生老病死是怎么一回事。于是人人心中都有一个疑问：到底什么是生命？但是由于当时知识与技术的限制，人类的疑问得不到科学合理的解释。美国东部时间2000年6月26日，国际人类基因组计划（Human Genome Project ,HGP）的美、英、法、德、日、中6国协作组向世界联合宣布：人类生命蓝图人类基因组“工作框架图”已经完成。它的问世标志着人类在研究自身规律的过程中迈出了至关重要的一步，也预示着人类在探索生命奥秘的历史进程中翻开了新的篇章。 什么是人类基因组计划？ 生物学的原理告诉我们，基因是染色体上的DNA双螺旋链的一段，它由四种碱基通过不同的排列组合而成，并在特定的条件下表达遗传信息和表现特定功能，是生物性状遗传的基本功能单位。基因组指合成具有生物功能的蛋白质多肽链或RNA所必须的全部DNA序列。1985年美国科学家诺贝尔奖获得者杜伯克首先提出了人类基因组计划，目的在于通过国际间的合作，识别人类DNA中所有的十万个以上的基因，测定人类DNA的30亿个碱基对顺序，以建立详细的人类基因组遗传图和物理图，解读人类基因组中所有的基因，最终解读人类生、老、病、死的遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面认识自我。 人类基因组计划的意义 首先，获得人类全部基因序列将有助于人类认识许多遗传疾病以及癌症等疾病的致病机理，为分子诊断、基因治疗等新方法提供理论依据。在不远的将来，根据每个人DNA序列的差异，可了解不同个体对疾病的抵抗力，依照每个人的“基因特点”对症下药，这便是21世纪的医学——个体化医学。更重要的是，通过基因治疗，不但可预防当事人日后发生疾病，还可预防其后代发生同样的疾病。 第二，破译生命密码的人类基因组计划有助于人们对基因的表达调控有更深入的了解。同时，人类基因组图谱对揭示人类发展、进化的历史具有重要意义。对进化的研究，不再建立在假说的基础上，利用比较基因组学，通过研究古代DNA，可揭示生命进化的奥秘以及古今生物的联系，帮助人们更好地认识人类在自然界中的地位。 人类基因组计划带来的革命 1.基因治疗 人类基因组计划将为基因治疗技术的发展提供基础性的支持，对特异致病基因的研究，无疑会给基因治疗技术针对性地指明方向，加速这一技术的发展。基因治疗就是利用基因工程的手段，通过向人体导入功能基因，修补、改变相应的缺陷基因，以对相关疾病进行治疗和预防。对基因治疗的临床研究早在十年前就开始了，90年美国研究人员对一个4岁的小女孩施行了基因治疗，使她的病情大大好转。十年来，基因治疗技术在实验过程中取得了不少的成果，载体的改进和靶细胞的选择使基因治疗技术的效果也不断提高。 2.基因工程药物研究
GO(gene ontology)是基因本体联合会(Gene Onotology Consortium)所建立的数据库，旨在建立一个适用于各种物种的，堆积因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语言词汇标准．GO是多种生物本体语言中的一种，提供了三层结构的系统定义方式，用于描述基因产物的功能． 基因本体论（gene ontology）的建立 现今的生物学家们浪费了太多的时间和精力在搜寻生物信息上。这种情况归结为生物学上定义混乱的原因：不光是精确的计算机难以搜寻到这些随时间和人为多重因素而随机改变的定义，即使是完全由人手动处理也无法完成。举个例子来说，如果需要找到一个用于制抗生素的药物靶点，你可能想找到所有的和细菌蛋白质合成相关的基因产物，特别是那些和人中蛋白质合成组分显著不同的。但如果一个数据库描述这些基因产物为“翻译类”，而另一个描述其为“蛋白质 合成类”，那么这无疑对于计算机来说是难以区分这两个在字面上相差甚远却在功能上相一致的定义。 Gene Ontology (GO)项目正是为了能够使对各种数据库中基因产物功能描述相一致的努力结果。这个项目最初是由1988年对三个模式生物数据库的整合开始：: FlyBase (果蝇数据库Drosophila),t Saccharomyces Genome Database (酵母基因组数据库SGD) and the Mouse Genome Database(小鼠基因组数据库MGD)。从那开始，GO不断发展扩大，现在已包含数十个动物、植物、微生物的数据库。 GO的定义法则已经在多个合作的数据库中使用，这使在这些数据库中的查询具有极高的一致性。这种定义语言具有多重结构，因此在各种程度上都能进行查询。举例来说，GO可以被用来在小鼠基因组中查询和信号转导相关的基因产物，也可以进一步找到各种生物地受体酪氨酸激酶。这种结构允许在各种水平添加对此基因产物特性的认识。 GO发展了具有三级结构的标准语言（ontologies），如表所示。根据基因产物的相关分子功能，生物学途径，细胞学组件而给予定义，无物种相关性。 本体论内容分子功能本体论基因产物个体的功能，如与碳水化合物结合或ATP 水解酶活性等生物学途径本体论分子功能的有序组合，达成更广的生物功能，如有丝分裂或嘌呤代谢等细胞组件本体论亚细胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物等 基本来说，GO工作可分为三个不同的部分：第一，给予和维持定义；第二，将
人类基因组计划 HGP(Human Genome Projects) 1、HGP简介 ?人类基因组计划是由美国科学家于1985年率先提出、于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。 ?诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于1986年发表短文 《肿瘤研究的转折点：人类基因组测序》（Science, 231: 1055－1056）。 ?文中指出：如果我们想更多地了解肿瘤，我们从现在起必须关注细胞的基因组。…… 从哪个物种着手努力？如果我们想理解人类肿瘤，那就应从人类开始。……人类肿瘤研究将因对DNA 的详细知识而得到巨大推动。” 什么是基因组(Genome) ?基因组就是一个物种中所有基因的整体组成 ?人类基因组有两层意义： ——遗传信息 ——遗传物质 ?从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。 人类染色体 HGP的诞生 ?1984年12月Utah州的Alta,White R受美国能源部的委托，主持召开了一个小型会议，讨论DNA重组技术的发展及测定人类整个基因组的DNA序列的意义。 ?1985年6月，在美国加州举行了一次会议，美国能源部提出了“人类基因组计划”的初步草案。?1986年6月，在新墨西哥州讨论了这一计划的可行性。随后美国能源部宣布实施这一草案。?1987年初，美国能源部与国家医学研究院（NIH）为“人类基因组计划”下拨了启动经费约550万美元，1987年总额近1.66亿美元。同时，美国开始筹建人类基因组计划实验室。 ?1989年美国成立“国家人类基因组研究中心”。诺贝尔奖金获得者J.Waston出任第一任主任。?1990年，历经5年辩论之后，美国国会批准美国的“人类基因组计划”于10月1日正式启动。美国的人类基因组计划总体规划是：拟在15年内至少投入30亿美元，进行对人类全基因组的分析。 HGP诞生过程中的质疑 ?计划的必要性问题 ?计划的现实性问题 ?科学研究领域的选择问题 ?为什么不选择基因组小的或有经济意义的生物 ?认为?°制图?±是在沙漠里建公路，?°测序?±是把?°垃圾?±分类，选择?°模式动物?±是拼凑?°诺亚方舟?±。
【引用】关于GO分析 2011-07-13 17:19:27| 分类：默认分类| 标签：|字号大中小订阅 Gene Ontology 现今的生物学家们浪费了太多的时间和精力在搜寻生物信息上。这种情况归结为生物学上定义混乱的原因：不光是精确的计算机难以搜寻到这些随时间和人为多重因素而随机改变的定义，即使是完全由人手动处理也无法完成。举个例子来说，如果需要找到一个用于制抗生素的药物靶点，你可能想找到所有的和细菌蛋白质合成相关的基因产物，特别是那些和人中蛋白质合成组分显著不同的。但如果一个数据库描述这些基因产物为“翻译类”，而另一个描述其为“蛋白质合成类”，那么这无疑对于计算机来说是难以区分这两个 在字面上相差甚远却在功能上相一致的定义。 Gene Ontology (GO)项目正是为了能够使对各种数据库中基因产物功能描述相一致的努力结果。这个项目最初是由1988年对三个模式生物数据库的整合开始：: FlyBase (果蝇数据库Drosophila),t Saccharomyces Genome Database (酵母基因组数据库SGD) and the Mouse Genome Database (小鼠基因组数据库MGD)。从那开始，GO不断发展扩大，现在已包含数十个动物、植物、微生物的数据库。 GO的定义法则已经在多个合作的数据库中使用，这使在这些数据库中的查询具有极高的一致性。这种定义语言具有多重结构，因此在各种程度上都能进行查询。举例来说，GO可以被用来在小鼠基因组中查询和信号转导相关的基因产物，也可以进一步找到各种生物地受体酪氨酸激酶。这种结构允许在各种水平添 加对此基因产物特性的认识。 GO发展了具有三级结构的标准语言（ontologies），如表所示。根据基因产物的相关分子功能，生物学途 径，细胞学组件而给予定义，无物种相关性。 本体论内容 分子功能本体论基因产物个体的功能，如与碳水化合物结合或ATP水解酶活性等生物学途径本体论分子功能的有序组合，达成更广的生物功能，如有丝分裂或嘌呤代谢等 细胞组件本体论亚细胞结构、位置和大分子复合物，如核仁、端粒和识别起始的复合物等 基本来说，GO工作可分为三个不同的部分：第一，给予和维持定义；第二，将位于不同数据库中的本体论语言、基因和基因产物进行联系，形成网络；第三，发展相关工具，使本体论的标准语言的产生和维持 更为便捷。 本体论（The ontologies） GO 的结构包括三个方面?D?D分子生物学上的功能、生物学途径和在细胞中的组件作用。当然，它们可能在每一个方面都有多种性质。如细胞色素C,在分子功能上体现为电子传递活性，在生物学途径中与氧化磷酸化和细胞凋亡有关，在细胞中存在于线粒体质中和线粒体内膜上。下面，将进一步的分别说明GO的 具体定义情况。 基因产物 基因产物和其生物功能常常被我们混淆。例如，“乙醇脱氢酶”既可以指放在Eppendorf管里的基因产物，也表明了它的功能。但是这之间其实是存在差别的?D?D一个基因产物可以拥有多种分子功能，多种基因产物也可以行使同一种分子功能。比如还是“乙醇脱氢酶”，其实多种基因产物都具有这种功能，而并不是所有的这些酶都是由乙醇脱氢酶基因编码的。一个基因产物可以同时具有“乙醇脱氢酶”和“乙醛歧化酶”两种功能，甚至更多。所以，在GO中，很重要的一点在于，当使用“乙醇脱氢酶活性”这种术语时，所指的是 功能，并不是基因产物。 许多基因产物会形成复合物后执行功能。这些“基因复合物”有些非常简单（如血红蛋白由血红蛋白基因产物α－球蛋白、β－球蛋白和小分子的亚血红素组成），有些非常复杂（如核糖体）。现在，小分子的描述
真核mRNA测序是基于HiSeq平台，对真核生物特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA进行测序，既可研究已知基因，亦能发掘新基因，全 面快速地获得mRNA序列和丰度信息。真核mRNA测序方法可以分为：有参考转录组、无参考转录组以及数字基因表达谱（DGE）三大类。 技术参数 案例解析 ［案例一］ mRNA和small RNA转录组揭示新合成异源六倍体小麦杂种 优势的动态部分同源调控 诺禾致源携手中国农业科学院作物科学研究所，利用转录组测序技术，对杂交亲本、新合成异源六倍体小麦的幼苗、穗和种子进行了mRNA和smallRNA测序及信息分析，发现新合成异源六倍体小麦绝大部分基因表现为12类基因表达模式，包括加性表达，少部分的基因表现为非加性，基因的非加性表现出非常强的发育时期特异性，与生长势密切相关；miRNA的丰度随着倍性的增加逐渐下降，新合成异源六倍体小麦中非加性表达的 miRNA也同样表现出亲本显性表 达，miRNA的表达敏感性与生长势和适应性密切相关。该研究揭示了不同倍性 非对等杂种优势的分子基础。 ［案例二］ 磷酸三（2,3-二氯丙基）酯（TDCPP）对四膜虫生长繁殖的 抑制作用与核糖体相关 诺禾携手华中农业大学,利用转录组测序和信息分析技术,研究了TDCPP处理组和对照组差异基因表达,并对差异表达基因进行KEGG通路分析,发现核糖体基因通路显著富集, 同时伴随胞浆和粗面内质网上核糖体数量减少体积增大。这些探索表明四膜虫可以作为TDCPP反应的生物指标，为后续研究TDCPP作用其他生物的毒理机制提供了新视角。 ［案例三］ 转录组揭示寄主植物与宿主之间进行RNA交换的机制 参考文献 菟丝子被称作勒死草，会用被称作吸根的专用器官穿透宿主组织与其建立联系，可以吸取宿主的水份与营养物质，也能吸取RNA(mRNA)分子。本研究分别选取菟丝子和拟南芥及番茄的共生体茎上的三段组织进行转录组学的研究，发现寄生植物与寄主之间mRNA的转移量很大且是一种双向转移的模式；两种宿主相比，更多的拟南芥RNA被转移到菟丝子植物之中，而且菟丝子与拟南芥之间较自由的交换，可表明调节菟丝子吸根选择性的机制可能是宿主特异性的，从而揭示了寄主与宿主之间进行RNA转移的遗传机制。 [1] Li A, Liu D, Wu J, et al . mRNA and small RNA transcriptomes reveal insights into dynamic homoeolog regulation of allopolyploid heterosis in nascent hexaploid wheat [J]. The Plant Cell, 2014: tpc. 114.124388.[2] Jing Li, John P , Giesy, Liqin Yu, et al . Effects of Tris (1,3-dichloro-2-propyl) Phosphate (TDCPP) in Tetrahymena Thermophila: Targeting the Ribosome. Scientific Reports. 2015, 5:10562. [3] Kim G, LeBlanc M L, et al . Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts [J]. Science, 2014, 345(6198): 808-811. 图1 非加性表达miRNA与亲本显性表达miRNA的 等级聚类分析和两者的关联 图2 显著富集的KEGG通路 图3 菟丝子与拟南芥、番茄转移RNA和非转移RNA的表达和富集分析 样品要求文库类型测序策略数据量类型 分析内容 项目周期 真核有参转录组测序 真核无参转录组测序 6 Gb、8 Gb、10 Gb、12 Gb clean data 6 M clean reads 3 Gb clean data 项目数据至少12 Gb clean data 数字基因表达谱（DGE） HiSeq PE150 HiSeq PE150 HiSeq SE50HiSeq PE125普通转录组文库； 链特异性转录组文库 40天50天30天 35天（有参）45天（无参） RNA样品总量≥1.5 μg； RNA样品浓度≥50 ng/μL 参考基因组比对 新转录本预测可变剪切分析SNP/InDel分析 基因表达水平分析RNA-seq整体质量评估 转录因子注释GO/KEGG富集分析蛋白互作网络分析基因共表达网络构建可视化结果展示 参考转录组拼接 转录本/Unigene长度统计 基因功能注释NR，NT，Swiss Prot GO，KEGG，KOG Protein Family CDS预测分析SNP/SSR分析
人类基因组计划原理和基本步骤 人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。 序列图的绘制主要采用两大策略: 即逐个克隆法（Clone by Clone）和全基因组鸟枪法（Whole Genome Shot-gun)。 逐个克隆法的原理 逐个克隆法的原理是Sanger双末端终止法。人类基因组框架图全部采用基于Sanger 双脱氧原理的自动化毛细管测序。在1977年，英国人Frederick Sanger 创建了双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 Sanger双末端终止法的基本原理是利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。具体实验是通过PCR来完成的，但与普通PCR不同，它只需要一个引物而不是一对。在4个相同的反应体系中分别加入普通的dNTP以及4种不同的ddNTP（比如体系1里面缺少dATP，而有ddATP,以此类推）。假设四个体系中分别加入的是ddATP, ddGTP, ddCTP和ddGTP 我们就分别把这个叫做A，G，C，T体系，然后每个体系中，会在遇到相应碱基的时候停止反应，这样就产生了一系列长度不一并且分别在以A,G,C,T时终止的DNA片段，比如A 体系中的DNA片段，都是以A结尾的DNA。通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。 逐个克隆法基本步骤 逐个克隆法的基本步骤是：物理图谱的构建→BAC克隆的筛选→“工作框架图”的构建→序列的全组装与“完成图”构建。 物理图谱的构建的基本步骤如下：确定各STS序列及其在基因组中的位置→大插入片段基因组文库的构建（BAC文库）→以特定STS为标记筛选并定位克隆→含有STS的克隆在基因组中排序。 BAC克隆的筛选的基本步骤如下：用NotI、SacI等处理基因组，通过脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DNA→纯化后与载体连接，得到插有外源DNA片段的BAC载体→通过电转化将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞，在含有抗生素的筛选培养基中筛选带有相同外源DNA片段的单克隆菌落→“STS-PCR反应池”方案筛选种子克隆→相互间具有重叠片段的BAC克隆根据STS信息组装成contig，并定位于基因组上。 值得注意的是，STS的密度尚未达到绘制高精度物理图谱的要求，且在基因组中的分布不均匀，造成很多区域没有阳性克隆覆盖,形成空洞。因此需用指纹图谱（FPC法）或末端序列（Walking by End Sequence)步移等手段对种子克隆进行延伸，形成连续克隆群。利用延伸方法筛选得到的克隆称为延伸克隆。 “工作框架图”的构建：根据序列与STS database进行blastn比较结果，将克隆定位末端序的比较，判定延伸在contig外的一端序列。并可及时进行walking，筛选新的克隆。 鸟枪法 鸟枪法或霰弹法是一个高度计算机化的方法，它是先把基因组随机分成已知长度(2000个碱基对、1万个碱基对、5万个碱基对)的片段，然后用数学算法将这些片段组装成毗邻的
人类基因组计划 一、什么是基因和基因组 1、基因：DNA分子上具有特定遗传效应的一段特定的核苷酸序列。遗传效应：有蛋白质产物或RNA产物或对其它基因起调节效应的功能。 2、基因组：是一个单倍体染色体组中所包含的全部遗传物质。有核基因组和线拉体基因组之分。 二、人类基因组结构 人类基因组结构庞大、复杂：基因组DNA总长度为3×109bp，3-4万个基因分布在24条染色体上，非编码区远远多于编码区，占90%以上，结构基因占3%，以单拷贝形式存在。 1、DNA序列中的组成结构可分为3种类型： （1）单一序列(非重复序列、单拷贝序列）占60-65%，绝大多数为蛋白质编码的结构基因 （2）中度重复序列：占20-30%，拷贝数为104-105 ，包括组蛋白基因、免疫球蛋白基因及RNA基因，绝大多数中度重复序列为不编码序列，成为间隔区，如人类Alu序列家族由300bp的短序列构成，重复达30万-50万拷贝，占基因组3-6%。 （3）高度重复序列：又称为卫星DNA 通常是小于10bp的短小序列组成基本单元，重复达105以上，占基因组的10%，不能转录，组成异染色质。 2、结构基因 （1）概念：为蛋白质编码的基因叫-。其DNA序列大多数是不连续的，编码序列之中往往还插入有非编码序列。 （2）结构： 内含子：非编码的序列叫—。 外显子：编码序列的片段叫—。 一个结构基因常常是由多个内含子和多个外显子相间排列组成的。图4-2，n个内含子嵌合排列在n+1外显子之间，故有内外之分。 （3）功能：内含子的长度比外显子的大好几倍，一起转录成RNA以后，必须经过剪接加工过程，将内含子部分切除，使外显子连接起来，才能形成成熟的mRNA，成为翻译蛋白质的模板。内含子，含而不显的片段对基因的表达有重要的调控作用。图4-3。 3、多基因家族和基因簇： （1）多基因家族：真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为基因家族 如血红蛋白基因家族。（指进化过程中由某一个祖先基因经过多次重复和变异所产生的一大类群序列相似、功能相似的基因群。） a、有的集中在一条染色体上共同发挥作用，合成某些蛋白质，如组蛋白基因家族中的5种组蛋白基因集中在7号染色体的长臂上的。 b、有的多基因家族成员是分散存在于几条染色体上，如人的rRNA基因家族成员分别位于13、14、15、 21、22，5条染色体的短臂的核仁组织区中。 每个区中包含几十个rRNA基因单位，大量转录18S rRNA、 28S rRNA、 5.8S rRNA。 假基因：是基因组中因突变而失活的基因，它和同一家族中的活跃基因在结构上和DNA序列上有相似性，但是没有蛋白质产物。（在多基因家族中，有少数成员不产生有功能的蛋白质，这样的基因叫—。假基因与正常基因从序列上看是同源的，但是在进化过程中发生突变丧失了功能活性。） （2）基因簇或超基因：同一基因家族中，一些结构和功能更为相似的基因彼此靠近成串地排列在一起，形成一个基因簇。如人类类α珠蛋白基因族、类β珠蛋白基因族。 在人类基因组中，有中等重复序列构成的大的基因群，包含有几百个功能相关的基因，紧密成簇状排列，称为超基因。如人类组织相容性抗原复合体HLA，及免疫球蛋白的重链和轻链基因。
人类基因组计划的重要性 “以破解人类遗传和生老病死之谜，解决人类健康问题为目的的人类基因组计划，对人类自身的生存和发展具有重要的意义。其旨在通过测定人类基因组DNA约3×109对核苷酸的序列，探寻所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，明确所有基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面认识自我。” 基因作为掌控人类自身性状、特征和遗传的根本因子，以其简单的双螺旋结构、复杂的排列方式，使全世界范围内的每一个人类都有着相同的本质和不同的特质。基因的轰动范围极为广泛，我们身上的每一处体态特征几乎都由基因所决定，大到一个人的身高、外貌，小到一颗牙形的状，甚至是一根头发的直径都与基因有着密不可分的联系。众所周知，基因由五种碱基对以庞大的数量按一定顺序排列组合而成，其本质是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。在一个活跃的细胞内，特定的基因通过解旋、转录、翻译等一系列过程，来实现RN A、蛋白质等相应物质的合成，这些数以万计的不同形态不同功能的RN A、蛋白质在细胞内外发挥出他们自身的作用，从而达到控制人类机体、完善结构功能、协调组织器官运作的神奇效果。 由以上的事实我们可以看出，要想解开人类自身的秘密，就要从破解基因的密码做起。 人类基因组计划便应运而生了。该计划是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波1罗计划并称为三大科学计划。 “HDP（人类基因组计划）的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。”
类基因组计划的成果（一） 谁来当“亚当”---人类基因组多样性与个体医学已在进行的人类基因组计划，可以说是“代表性个体”人类基因组计划。在美国，现在用于用于绘制人类DNA序列的DNA 来自于几个“无名氏”的男性。这在当时还曾有过争论，谁可以做“亚当”？这个问题也重要也不重要。人类的所有个体、所有的人，在遗传上都是平等的。所有的人类基因组不管是在基因组中的位置，即基因位点，还是每一个基因的结构都是很相似的，绝对不存在好坏优劣之分。不管从哪一个人身上分离到的一个位点上的DNA片段，可以用于任何种族任何个体的这一位点的研究，这一位点致病等位基因的鉴定，将来可能的基因诊断与基因治疗。因此，我们说人类只有一个基因组，不存在黄种人基因组、白种人的基因组之分。一个基因被鉴定、分离了，进而被专利，就是全人类的这一基因组被专利了，我们不能说你专利的是白种人的基因，我们再来专利一个黄种人或中国人的基因。但人与人是不同的，这就是人类在“同一性”的前提下的“多样性”，多样性体现在每个人身上，称为“基因多样性”或“个体特异性”，一般每个人之间5%位点的等位基因不同有0.1%的序列不同。体现在黄种人棗白种人这一人种族差异上，可称为“种族多样性”，体现在民族（遗传上称为“族群”）上，称为“族群多样性”。将来的某一天，如果需要每一个人的全基因的全核苷酸序列也许能不费多少钱就测定了，并且记录在一个光盘上，要诊断疾病就方便啦。医生先把这个光盘装进计算机，检查几个有关的“候选基因”，看看要注意什么，譬如说，某种药物，有人用灵验，有人不灵验，这就是个体差异。这一差异很多是基因决定的，也就是“多样性”决定的，这对医生诊病很有帮助。当然，也许不需要了解一个人的整个基因组棗大家都大同小异，而把重要区域、重要基因、重要位点的“多样性”较高的区域搞清就行了。“全基因组”信息非同小可，表达了每一个人有关生、老、病、死的重要信息，它是一个人全部隐私中的最重要的隐私，可不是一个人一般生理指标，如身高、体重、胸围、血型等等，因此，它的使用可得慎之又慎。
go分析 Gene Ontology可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）三个部分。蛋白质或者基因可以通过ID对应或者序列注释的方法找到与之对应的GO号，而GO号可对于到Term，即功能类别或者细胞定位。功能富集分析: 功能富集需要有一个参考数据集，通过该项分析可以找出在统计上显著富集的GO Term。该功能或者定位有可能与研究的目前有关。GO功能分类是在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目或组成，往往是在GO的第二层次。此外也有研究都挑选一些Term，而后统计直接对应到该Term的基因或蛋白数。结果一般以柱状图或者饼图表示。 1.GO分析根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同GO 分类中某（几）个特定的分支的超几何分布关系，GO 分析会对每个有差异基因存在的GO 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该GO 中出现了富集。GO 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的GO 分析，可以找到富集差异基因的GO分类条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功能的改变有关。 2.Pathway分析根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同Pathway 的超几何分布关系，Pathway 分析会对每个有差异基因存在的pathway 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该pathway 中出现了富集。Pathway 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的Pathway 分析，可以找到富集差异基因的Pathway 条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些细胞通路的改变有关。与GO 分析不同，pathway 分析的结果更显得间接，这是因为，pathway 是蛋白质之间的相互作用，pathway 的变化可以由参与这条pathway 途径的蛋白的表达量或者蛋白的活性改变而引起。而通过芯片结果得到的是编码这些蛋
人类基因组计划的重要意义人类基因组计划(human genome project,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。 人类基因组计划耗资巨大，该计划的原因如下：人类是在“进化”历程上最高级的生物，对它的研究有助于认识自身、掌握生老病死规律、疾病的诊断和治疗、了解生命的起源。 测出人类基因组DNA的30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，找出它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。 在人类基因组计划中，还包括对五种生物基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类的五种“模式生物”。 HGP的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。
我们知道所有生物的遗传物质是DNA，它的总和就是基因组，就人类基因组而言，指合成有功能的人体各类细胞中蛋白质及或多肽链和RNA所必须的全部DNA顺序和结构，人体遗传物质综合就是人类基因组，由大约30亿碱基对组成，分布在细胞核的23对染色体中。人类基因组计划是测定人类基因组的全部DNA序列，从而解读所有遗传密码，揭示生命的所有奥秘。 诺贝尔奖获得者杜伯克于1986年在《科学(Science)》杂志上发表的一篇短文中率先提全面解剖人类基因组的计划。1988年，该计划正式获得美国国会批准，并于1990年10月1日正式启动。其总体规划是：拟在15年内至少投资30亿美元，进行对人类基因组的分析。不久，该计划发展成一个由多国政府支持的国际项目，先后有美、英、日、德、法及中国等6个国家参加。HGP其最初的目标是，用15年时间（1990-2005），构建详细的人类基因组遗传图和物理图，确定人类DNA的全部核苷酸序列，定位全部基因，并对其他生物进行类似研究。1993年，又增加了人类基因的鉴定和分离的内容。其终极目标即：阐明人类基因组全部DNA序列；识别基因；建立储存这些信息的数据库；开发数据分析工具；研究HGP实施所带来的伦理、法律和社会问题。1998年,人类基因组计划增加了基因组多样性研究的内容,强化了功能基因组研究技术平台体系。
人类基因组计划的历史背景 问题的提出 尽管生物机体的尺寸有限,但并未能为研究工作带来任何容易之处。人们经过了不懈的努力,渴望解开生命之谜这个多年的愿望并未向前推进多少,谜仍是个谜!以往研究的艰履或失败教训使人们头脑开始清醒地认识到,任何仅依靠单一学科如细胞学、发青学、肿瘤学、人类遗传学或分子生物学的独自努力都无济于事,都太局限了,难以完成人类对自身的认识和保护。美国曾投巨资但基本上以失败告吹了的肿瘤十年计划也说明了这个问题。所以,要知道某事物的局部作用机制最好先知道全局的看法逐渐主导了人们的认识(Dulbecco R,1986)。在绕了一大段弯路后,人们回过头来决定开始进行人的所有基因即基因组的研究,全面探讨这个“摸得到,猜不透',的人体奥秘,由此形成了基因组学(genomics)和人类基因组计划(Human Genome Project,HGP),其最终目的是对生命进行系统地和科学地解码,以此达到了解和认识生命的起源,种间和个体间存在差异的起因,疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象(Under ES,1996)。人类基因组计划以前的遗传学或称基因学(genetics)偏重于单个基因的研究,而人类基因组计划则是把目光投向整个基因组的所有基因,从整体水平去考虑基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系等。随着数理化、信息和材料等学科的渗透以及具有时代特征的工业化技术管理模式的引进,HGP真正成为了生命科学领域的第一项大科学工程,其规模和意义远远超过阿波罗(Apollo)登月计划和曼哈顿(Manhatton)原子弹计划口HGP的正式启动也就标志着解码生命的真正开始也就很自然地成为人们关注的焦点。 历史的回顾 对人类基因组的研究在70年代已具有一定的雏形,在80年代在许多国家已形成一定规模,并在以下的几个事件的影响下形成了投资额最多、最具规模的美国人类基因组计划。 1984年在Utah州的Aita,White R和MendelSOIlhn M受美国能源部(DOE)的委托主持召开了一个小型专业会议讨论测定人类整个基因组的DNA序列的意义和前景(Cook-y明n则,1989)。1985年5月在加州antaCruz由美国能说部的SindeimerRL主持的议上提出了测定人类基因组全序列的动议,由此形成了美国能源部的“人类基因组计划”草案。1986年3月,在新墨西哥州的Santa Fe 讨论了这一计划的可行性,随后美国能源部宣布实施这一草案。1986年著名遗传学家McK1Mick V 提出从整个基因组的层次研究遗传的科学称“基因组学"。1986年3月7日,诺贝尔奖获得者Dulbecco R在Science杂志上发表的一篇有关开展人类基因组计划的短文。1986年6月在美国冷泉港,另两位诺贝尔奖获得者GIbedW及Berg P主持了有关“人类基因组计划”的专家会议。1987年初,美国能源部与国家健康研究院(NIH)为“人类基因组计划"下拨了启动经费约550万美元(1987年全年1.66亿美元),并开始筹建人类基因组计划实验室。1988年2月,国家科学研究委员会(NRC)的专家撰写了“人类基因组的作图与测序(mapping andsequencing the human genome)”的报告,全面地介绍了有关这项史无前例的、看起来似“胆大妄为',计划的内容(Nati?ml Research Council,1988)。同年,美国成立了“国家人类基因组研究中心",由因提出DNA 分子双螺旋模型的贡献而获诺贝尔奖的沃森(Watson J)出任第一任主任。 Duibeeco短文的功绩 Dulbecco R于1986年在Science杂志上发表的题为“癌症研究的转折点——人类基因组的全序列分析”的短文,回顾了70年代以来癌症研究的进展,使人们认识到包括癌症在内的人类疾病的发
GO数据库使用指南Version No.2010.09.03 （内部资料仅供参考）
目录 目录 第一部分GO是什么？ (2) 1.1基因本体论(gene ontology)的建立 (2) 1.2本体论(The ontologies)简介 (3) 1.3本体论语义之间的关系及其组织结构 (4) 1.3.1语义之间关系的基本理解 (4) 1.3.2关系之间的推导 (5) 1.3.3调节控制关系(the regulates relation)及其推导 (6) 1.3.4本体论的组织结构 (7) 1.4GO的注释(Annotation) (8) 第二部分GO怎么用？ (10) 2.1下载本体论文件和注释文件 (10) 2.2GO语义及其相关注释的浏览与搜索 (17) 2.2.1AmiGO的基本使用说明 (17) 2.2.2语义关系的图形化描述 (20) 2.2.3根据语义检索 (22) 2.2.4根据基因产物检索 (25)
第一部分GO是什么？ GO(gene ontology)是基因本体联合会(Gene Onotology Consortium)所建立的数据库，旨在建立一个适用于各种物种的，对基因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO是多种生物本体语言中的一种，提供了三层结构的系统定义方式，用于描述基因产物的功能． ontology))的建立 1.1基因本体论(gene ontology 现今的生物学家们浪费了太多的时间和精力在搜寻生物信息上。这种情况归结为生物学上定义混乱的原因，不同的生物学数据库可能会使用不同的术语，好比是一些方言一样。不光是精确的计算机难以搜寻到这些随时间和人为多重因素而随机改变的定义，即使是完全由人手动处理也无法完成。举个例子来说，如果需要找到一个用于制抗生素的药物靶点，你可能想找到所有的和细菌蛋白质合成相关的基因产物，特别是那些和人体中蛋白质合成组分显著不同的。但如果一个数据库描述这些基因产物为“翻译类”，而另一个数据库描述其为“蛋白质合成类”，那么这无疑对于计算机来说是难以区分这两个在字面上相差甚远却在功能上相一致的定义。 Gene Ontology就是为了解决上述问题，使各种数据库中基因产物功能描述相一致而发起的一个项目。这个项目最初是由1988年对三个模式生物数据库的整合开始：the FlyBase(果蝇数据库Drosophila)，the Saccharomyces Genome Database(酵母基因组数据库SGD)和the Mouse Genome Informatics(小鼠基因组数据库MGI)。从那开始，GO不断发展扩大，现在已是包含数十个动物、植物、微生物的数据库(详见GO Consortium Page)。 GO开发了具有三级结构的语义词汇标准(Ontologies)，根据基因产物的相关生物学途径、细胞学组件以及分子功能而分别给予定义，与具体物种无关。GO的工作大致可分为三个部分：第一，给予并维持语义(terms)；第二，将位于数据库当中的基因、基因产物与GO 本体论语言当中的语义(terms)进行关联，形成网络；第三，开发相关工具，使本体论标准语言的产生和维持更为便捷。 GO的定义法则已经在多个合作的数据库中使用，这使在这些数据库中的查询具有极高
基因组注释主要包括四个研究方向：重复序列的识别；非编码RNA的预测；基因结构预测和基因功能注释。我们将分别对这四个领域进行阐述。 1：重复序列的识别。 重复序列的研究背景和意义：重复序列可分为串联重复序列（Tendam repeat）和散在重复序列(Interpersed repeat)两大类。其中串联重复序列包括有微卫星序列，小卫星序列等等；散在重复序列又称转座子元件，包括以DNA-DNA方式转座的DNA转座子和反转录转座子(retrotransposon)。常见的反转录转座子类别有LTR,LINE和SINE等。 重复序列识别的发展现状：目前，识别重复序列和转座子的方法为序列比对和从头预测两类。序列比对方法一般采用Repeatmasker软件，识别与已知重复序列相似的序列，并对其进行分类。常用Repbase重复序列数据库。从头预测方法则是利用重复序列或转座子自身的序列或结构特征构建从头预测算法或软件对序列进行识别。从头预测方法的优点在于能够根据转座子元件自身的结构特征进行预测，不依赖于已有的转座子数据库，能够发现未知的转座子元件。常见的从头预测方法有Recon，Piler，Repeatscout,LTR-finder，ReAS等等。 重复序列识别的研究内容：获得组装好的基因组序列后，我们首先预测基因组中的重复序列和转座子元件。一方面，我们采用RepeatScout、LTR-finder、Tendem Repeat Finder、Repeatmoderler、Piler等从头预测软件预测重复序列。为了获得从头预测方法得到的重复序列的类别信息，我们把这些序列与Repbase数据库比对，将能够归类的重复序列进行分类。另一方面，我们利用Repeatmasker 识别与已知重复序列相似的重复序列或蛋白质序列。通过构建Repbase数据库在DNA水平和蛋白质水平的重复序列，Repeatmasker能够分别识别在DNA水平和蛋白质水平重复的序列，提高了识别率。 重复序列识别的关键技术难点： 1）：第二代测序技术测基因组，有成本低、速度快等优点。但是由于目前产生的读长（reads）较短。由于基因组序列采用kmer算法进行组装，高度相似的重复序列可能会被压缩到一起，影响对后续的重复序列识别。 2）：某些高度重复的序列用现有的组装方法难以组装出来，成为未组装reads （unassembled reads）。有必要同时分析未组装reads以得到更为完整的重复序列分布图。之前，华大已开发了ReAS软件，专门用于识别未组装reads中