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土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定

土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定
土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定

土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定

13级生技426

摘要

本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存,实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定,根据伯杰氏细菌学手册鉴定其种属。实验中通过80℃水浴20min预处理,杀死无芽孢菌体,筛选出芽孢杆菌;再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选;又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化;最后用选择性淀粉培养基进行筛选,得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。

关键词:淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定

一、引言

芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧,产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。多为腐生菌,主要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物,芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体。因此,在工、农业生产上有较高的应用价值。菌体杆状,直或接近直,0.3 – 2.2X1.2 – 7.0微米。多数运动,鞭毛典型侧生,形成抗热内生孢子。在一个孢子囊细胞中,孢子不多于1个。暴露与空气中时,不妨碍孢子的形成。革兰氏反应为阳性,仅在生长早期为阳性、阴性。有机体化能营养,利用多种底物进行严格呼吸代谢,严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。在呼吸代谢中,最终的电子受体是分子氧,在一些种中可以用硝酸盐代替氧,大多数种产接触酶,严格好养或兼性厌氧。淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂,可应用于面包制造业淀、粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶,β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

二、实验目的

1.了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术;

2.掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法;

3.掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法;

4.培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力;

5.对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练;

6.从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌,并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。

三、实验原理

1.淀粉水解试验

细菌分泌到胞外的淀粉酶可以将淀粉水解成糊精、双糖和单糖等,加入碘液后,不出现蓝色反应,菌落周围呈透明圈。

2.VP试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物

3.有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚(靛基质),经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而呈红色,是为吲哚试验阳性。

4.柠檬酸盐利用试验

有的细菌如产气杆菌,能利用柠檬酸钠为碳源,因此能在柠檬酸盐培养基上生长,并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐,使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色。

5.明胶液化试验

有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。

6.耐盐性试验

耐盐性指能耐受高浓度盐类环境而生长发育的性质。微生物耐盐性试验则是检测微生物的耐盐性。

7.糖发酵试验

微生物具有不同的利用各种碳源的能力,其原理在于不同微生物具有不同的酶系。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢气、甲烷、二氧化碳等),有些细菌只产酸不产气。溴甲酚紫是一种酸碱指示剂,在中性时为紫色,碱性时为深红色,而在酸性时呈现黄色。微生物在进行碳源代谢时可以产生不同的代谢产物,有些产物为酸性物质。酸性物质的积累有时会超出培养基的缓冲范围,导致ph下降,溴甲酚紫的颜色由紫色转为黄色。在产酸过程中有时会伴随气体的产生,这可以在杜氏管中的气泡反应出来。若碳源代谢的终产物为中性化合物,既无颜色变化也无气体产生,表明此时的代谢较为复杂。8.酪素水解试验

微生物酪素水解试验是以天然牛奶蛋白为原料,经酶水解、脱色、脱盐、喷雾干燥而成的产品,含有18种游离氨基酸,含氮和蛋白量均大于80%。氨基酸是合成蛋白质的基础,是人、动植物、微生物最基本的营养成分之一。人和微生物可通过蛋白质间接获取氨基酸,但需要胃酸和酶的水解,当蛋白质被盐酸水解成氨基酸组分时药用级可作为能量合剂直接供给人们补充能量。

9.运动性试验

用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。

10.硝酸盐还原试验

有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

四、材料与器皿

1.1.材料:广大生化楼前小河附近(样品1)、B25宿舍附近(样品2)两处的土壤

1.2.培养基

1.2.1.营养琼脂培养基:采用商业化配方,按照比例,33g/1000mL蒸馏水配制

1.2.2.淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(淀粉水解试验):在营养琼脂商业化配方的基础上,按照

比例,加入2%可溶性淀粉

1.2.3.葡萄糖蛋白胨培养基(VP试验用):葡萄糖、蛋白胨、氯化钠各5g、蒸馏水1000mL、

pH7.2-7.4

1.2.4.蛋白胨水培养基(吲哚试验用):蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.4 1.2.5.西蒙氏柠檬酸盐培养基(柠檬酸盐试验用):采用商业化配方,按照比例,33g/1000mL

蒸馏水配制,pH 7.0 , 121℃灭菌20 min

1.2.6.明胶培养基(明胶液化试验用)牛肉膏3 g,蛋白胨10g,明胶120g,蒸馏水1000

mL ,pH 7.0

1.2.7.高盐培养基(耐盐试验用):牛肉膏3 g,蛋白胨10g,NaCl(2g、5g、7g,10g),

琼脂15~20g,蒸馏水1000 mL,pH 7.2~7.4

1.2.8.糖发酵培养基(糖酵解试验用):蛋白胨2 g,NaCl 5g,K2HPO4 0.2 g,1%溴麝香草

酚蓝水溶液3 ml,待试糖10g(一般糖或醇按1 % 量加入,而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入),蒸馏水1000 mL,pH 7.2~7.4

1.2.9.酪氨酸平板(酪氨酸水解试验用)L-酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中,115

度灭菌20分钟,然后于100mL无菌的营养琼脂混合,即成酪氨酸水解平板

1.2.10.酪素平板(酪素水解试验用)取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中(或用50mL

脱脂牛奶),另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中,将两液分开灭菌。待冷至45-50℃时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板

1.2.11.半固体培养基(运动性实验用)琼脂含量0.5%,其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培

养基配制

1.2.12.硝酸盐培养基(硝酸盐还原试验用)硝酸钾0.2g、蛋白5g、蒸馏水1000mL、pH7.4、

溶解,校正pH,分装试管,每管约5mL、121度灭菌15min

1.2.13.斜面种子培养基牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,琼脂15~20 g,蒸馏水1000

ml,pH 7.2~7.4

1.2.14.发酵培养基(%):玉米粉2% 黄豆饼粉1.5% CaCl 0.02% MgSO40.02% NaCl

0.25% K2HPO40.2% 柠檬酸钠0.2% 硫酸氨0.075%(溶解后加) Na2HPO40.2%

校正pH值7.0

1.3.染料与试剂

草酸铵结晶紫染色液、5%孔雀石绿溶液、石碳酸复红液、路哥尔氏碘液、吲哚试剂、95%乙醇、乙醚、40%NaOH溶液、α-萘酚、香柏油、二甲苯、硝酸盐还原试验试剂: 甲液:配制磺胺酸冰醋酸溶液,0.8g磺胺酸/100mL冰醋酸;乙液:配制α-萘胺乙醇溶液,0.5g α-萘胺/100mL乙醇。

1.4.其他器材

无菌玻璃涂棒、无菌吸管、无菌培养皿、试管、接种环、接种针、载玻片、三角瓶、烧杯、洗瓶、玻璃棒、酒精灯、吸水纸、玻璃珠、移液管、移液枪、显微镜超净工作台、水浴箱、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌箱。

五、方法与步骤

1.取样采用5点采样法,在该处1m2内取对角线与对角线交点5点,取表层10cm以下的土壤各200g。装进无菌防水纸袋,编号,封口

2.初步筛选两个土样分别取10g,分别放入装有90mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶内,塞上棉塞,振荡20min,即为稀释10-1土壤悬浮液。

将2个锥形瓶包扎,利用恒温水浴装置,进行沸水浴100℃加热10min,以杀死悬液中无芽孢的细菌。

再分别另取装有9mL无菌水试管8支,编号10-2, 10-3, 10-4, 10-5和。振荡混匀已稀释成1-10-1土壤悬液,用无菌移液枪吸取1mL土壤悬液加入编号为10-2的装有无菌水的试管中,并在试管内轻轻反复吹吸数次,使之充分混匀,即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为1-10-3的无菌水试管中,混匀后即为1-10-3土壤稀释液,依次连续稀释为10-4, 10-5土壤稀释液。取10-2,10-3,10-4这三个稀释度进行涂布平板操作。

3.制作平板每处土壤,每种稀释度悬液取无菌培养皿2副,共12副,各在培养皿底部贴上标签,注明稀释度。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基,无菌操作,倒入无菌培养皿中,冷却,制成平板。

4.涂布平板用一支新的无菌枪头,从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul,对号放入已标记好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上,用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做2个平板。于37度温箱中培养24h 。依次分区画线3次。

5.分区划线接种取出最后依次画线的平板,每处土壤选取形态大小颜色边缘形状不一的菌落5个,标记。分别用接种环以无菌操作挑取之,分别进行分区划线,倒置于37度温箱中培养24h。

6.镜检挑取平板表面单菌落进行单染色,于显微镜下进行镜检,检查获得的菌种是否单一,是否杆菌。若没获得纯培养,继续进行分区划线,再镜检。直到获得纯培养。(判断依据:菌落的形状、颜色、质地、透明度一致,菌体形态为直杆状,长度均一、宽度一致,并能产生芽孢时,确认为芽孢杆菌属的纯培养物)

6.1.单染色镜检步骤:涂片、干燥及固定;

染色:在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液或石炭酸复红液,染1 min,倾去染液,用水冲洗至无染色液颜色为止。

镜检:用油镜观察染色结果;

6.2.芽孢染色镜检步骤:

取37℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌涂片,干燥,固定。于涂片上滴人3~5滴5%孔雀绿水溶液。

用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热,自载玻片上出现蒸汽时,开始计算时间约4-5min。

加热过程中切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。

倾去染液,待玻片冷却后,水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

用石炭酸复红液复染l min,水洗。

制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色,菌体红色。观察芽孢的形状和位置。

7. 若镜检后,得知已得到纯培养,则检验该菌种是否产淀粉酶。

筛选产淀粉酶菌株(判断依据:淀粉水解试验用18-24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂平板(一个平板可分区划“+“字接种),于37℃培养24-48h。然后将碘试剂完全浸于培养表面。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或菌苔周围出现无色透明环。阴性反应则无透明环)

点接平板选用淀粉牛肉膏培养基,点接已经纯化的芽孢杆菌于平板上,检验是否产淀粉酶。若产淀粉酶,则将平行组的菌株接种至斜面上,37度温箱24h。每种菌接种两支,一支用来保存,一支用来进行各种生理生化鉴定试验。

7.1.在斜面培养基上接种时,其正确的操作顺序是:

①用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管,管口并齐,使斜面向上成水平状态

②右手拧松棉塞,但不取下

③在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞,将它们取下,同时左腕转动,灼烧管口一周

④将接种环伸入管内,让环先接触培养基上未长菌的部位,使环冷却,然后轻轻挑取少量菌体

⑤右手拿接种环,在火焰上灼烧灭菌

⑥在火焰旁边迅速将沾有菌体的接种环伸到培养基的底部,由里向外轻轻画蛇形细线

⑦抽出接种环,再用火焰灼烧管口,并在火焰上方将棉塞塞上。

8.菌种的鉴定

8.1.形态学检验

8.1.2 菌落形态学鉴定:将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。

8.1.2 个体形态学鉴定:进行一系列的镜检——革兰氏染色(具体步骤如下)、芽孢染色(具体步骤同上)观察是否符合芽孢杆菌的指标。

8.1.2.1 革兰氏染色

涂片液体培养基:左手持菌液试管,在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖;右手持接种环在火焰中烧灼灭菌,等冷却后从试管中沾取菌液一环,在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm

左右的涂膜,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基:先在载玻片上滴一滴无菌水,再用接种环取少量菌体,涂在载玻片上,使其薄而均匀。

晾干:让涂片在空气中自然干燥。

固定:让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)。

染色:将固定过的涂片放报纸上,滴加草酸铵结晶紫液,染1min。

水洗:用水缓慢冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。

媒染:滴加1滴碘液,染1min,水洗。

脱色:吸去残留水,连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色,立即水洗。

复染:滴加蕃红复染3-5min,水洗。至此,革兰氏染色结束。

8.2.生理生化试验

8.2.1.温度对微生物生长的影响使用牛肉膏蛋白胨培养基,于平板划线接种,分别在5,15,25,30,35,40,45,60,65度中培养24h,观察细菌是否生长。

8.2.2.卵黄反应试验取18-24h 的斜面或培养液中的菌体点种在上述平板上,点的直径约为2-3mm。适温培养18-24h 观察。如菌落四周和下面有不透明的区出现,表示卵磷脂分解生成脂肪,说明有卵磷脂酶。

8.2.3.乙酰甲基甲醇试验(VP试验)

取葡萄糖蛋白胨培养基,接种37度培养两天, 取出以上试管,每管分别加入40%NaOH溶液10~20滴,并加等量α-奈酚,振荡试管,以使空气中的氧溶入,置37℃恒温箱中保温15~30min 后,若培养液呈红色,记为阳性反应;若不呈红色,记为阴性。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.4.吲哚试验取蛋白胨水培养基,接种,37度培养2天,在培养基中加入乙醚1~2ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面,此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂,如有吲哚存在,乙醚层呈现玫瑰红色,为吲哚试验阳性,否则为阴性。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.5.柠檬酸盐试验

取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面的试管,分别将少量菌苔接种于各支相应的管中,然后置于37℃恒温箱中培养24h。观察结果,若培养基变蓝色,则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长,即为阳性。若培养基无变色,则为阴性。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)8.2.6.明胶液化试验

穿刺接种(穿刺接种:用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。)深度至明胶层2/3处,于37度温箱24h。。取出静置冰箱中待其凝固后,再观察其是否被细菌液化,如被液化,则为阳性,能产生蛋白酶。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.7.耐盐性试验将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%,5%,7%,10%的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37℃下培养,观察细菌是否生长。若生长,则为阳性反应;反之,为阴性反应。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.8.糖类发酵试验(甘露醇、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖发酵) 接种,于37度温箱中培养24h,观察培养基是否由紫变黄,杜氏小管中是否有气泡,以证实菌株是否产酸产气。(“—”表示不利用,“+ ”表示产酸,”“⊕”表示产酸产气)

8.2.9.酪氨酸水解试验将营养琼脂融化,冷却至温热,与L-酪氨酸混匀。分别将菌种点接在平板上,37度培养24h,记录菌落周围是否有透明圈。若有,则菌株能够水解酪氨酸,为阳性反

应;反之,为阴性反应。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.10.酪素水解试验将两液分别融化,混匀倒平板,即成牛奶平板。然后将菌种点接在平板上,37度温箱中培养24h。记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。若被分解而呈透明,为阳性反应;反之,为阴性反应。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.11.运动性试验使用半固体营养琼脂试管,将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底1~1.5cm处,沿原穿刺线拔出接种针。于37度温箱24h,观察是否产生树根状生长,若有,则菌株有鞭毛,为阳性反应;若直立生长,则菌株无鞭毛,为阴性反应。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.12.硝酸盐还原试验临试前将试剂的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液于试管内斜面上等量混合, 加入培养基,立即或于10min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.2.13 0.01%溶菌酶试验将菌种制成菌悬液,用无菌玻璃涂棒涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,然后用在溶菌酶试剂中浸湿的滤纸片贴在平板上,培养24h 后观察有无抑菌圈的出现,若有为阳性反应,否则为阴性反应。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)8.2.14 pH5.7肉汤试验将菌种接到pH5.7营养培养基(试管液体培养基)中培养24h,若液体表面长有菌膜,为阳性反应;反之,为阴性反应。(“+”表示阳性反应,“—”表示阴性反应)

8.3 菌种鉴定根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点,选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种,其生理生化指标如下表:

通过对目的菌种进行多项生理生化实验,对比伯杰式手册的实验结果,从而鉴定出目的菌的种别

六、产淀粉酶芽孢杆菌产淀粉酶活性的测定

1.以一环菌种接种于发酵培养基中,摇床培养,160 rpm/min , 37 ℃,48 h。4000 rpm/min离心20 min,收集上清液即为待测粗酶液。

2.1mg/mL标准麦芽糖的制备:准确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水准确定容到100mL;

3. 3,5-二硝基水杨酸试剂的制备:

准确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中,加入50mL蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后,用蒸馏水定容到100mL,盖紧瓶塞,备用;

4. 0.1mol/L Ph

5.6的柠檬酸缓冲液的制备:准确称取4.62g柠檬酸和17.05g柠檬酸钠,用蒸馏水定容至800mL;

5. 1%淀粉溶液的制备准确称取1g淀粉于100mL 0.1mol/L Ph5.6的柠檬酸缓冲液中;

6.标准曲线的绘制取7支20ml预先洁净灭菌干燥的试管,编号,加入试剂见下表

试剂管号 1 2 3 4 5 6 7

麦芽糖标准溶液(mL)0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0

蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0

麦芽糖含量(mg)0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0

3,5-二硝基水杨酸(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

标准样液配制按上表配制完成,摇匀,置沸水浴中煮沸10 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml。以一号管作为空白对照管,520 nm比色测定吸光度。以麦芽糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

7.测定取20 ml 具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥、编号。按以下顺序操作:取粗酶液1.00mL, 0.1mol/L 柠檬酸缓冲液3mL,于60度水浴中预热5分钟,加0.1mol/L 柠檬酸缓冲液(pH5.6)1mL,与60度水浴中保温30分钟,加入1.5mL3,5-二硝基水杨酸,沸水中5分钟,迅速冷却,加蒸馏水定容到20mL。空白对照,加发酵液后加pH3.6硫酸调pH至3.6以下钝化淀粉酶,使酶失活,其余步骤同上,定容后摇匀,用紫外可见光分光光度计在520nm 的波长下测定OD值,每种菌种重复测定OD值1次,最后结果取平均值。

8.计算

根据测到的OD值,在标准曲线中找到相应的麦芽糖量,并在上述条件下以单位体积样品在

30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位(U)

七、实验结果与分析

1.形态学检验

1.1菌落形态学检验

菌落形状近似一个圆形,表面湿润,呈乳白色,容易挑起,并有臭味。

1.2个体形态学检验

1.2.1革兰氏染色

短杆状,被染成紫色,为革兰氏阳性细菌

1.2.2芽孢染色

可观察到菌体被染成红色,而芽孢被染成绿色且长在菌体的中间

分析:从整个形态学检验结果来看,与蜡状芽孢杆菌的较为相似。在做芽孢染色的实验过程中,需要比较注意的就是石炭酸复红染液

要现配现用,一开始做芽孢染色时,没有成功,可能就是因为石炭酸复红染液放置过久,也可能是因为菌体还没有长出芽孢或者培养时间过长,导致芽孢又重新发育,长成菌体。还有比较关键的是加热过程中不能使孔雀绿染液蒸干,必要时要从染液边缘(而不是中部,防止中部的染液温度降低,影响结果)添加少许染液。

2.生理生化试验

2.1耐盐性试验

分析:说明该菌种具有耐盐性

2.2温度试验

分析:当温度为20度时,平板2没有长菌落,而平板1有,可能是因为该菌种在20度时,表现出阴阳不定性,也有可能是因为平板1被污染了,或者是平板2点接菌种不成功。当温度为35度时,看到菌落几乎布满整个平板2,可能是因为被污染了。从整个实验结果来看,该菌种具有耐高温性。

2.3 pH5.7肉汤试验

分析:说明该菌种能在pH5.7液体环境中生长。

2.4 糖发酵试验

分析:说明该菌种只能利用葡萄糖而不能利用阿糖、木糖、甘露醇。

2.5柠檬酸盐试验

分析:说明该菌不能利用柠檬酸盐作为碳源而生长。

2.6运动性试验

分析:说明该菌具有鞭毛。

2.7 VP试验

分析:说明该菌能产生少量吲哚

2.9酪氨酸水解试验

分析:说明该菌株能够水解酪氨酸。

2.10酪素水解试验

分析:说明该菌不能水解酪素

2.11硝酸盐还原试验

分析:说明该细菌具有还原硝酸盐的能力

2.12明胶液化试验

分析:说明该菌不能利用明胶

2.13 0.01%溶菌酶试验

分析:说明溶菌酶试剂对该菌无抑制作用

2.14 卵黄试验

分析:说明该菌有卵磷脂酶

通过对该菌株进行形态学以及多项生理生化试验鉴定,发现该菌与蜡状芽孢杆菌最为相似,可以初步鉴定该菌为蜡状芽孢杆菌。

3.酶活力的测定

3.1标准曲线

即所得酶活力约为0.2U

分析:从实验结果可以看出,所测得的酶活力很低,可能是因为接菌数量太少,也可能是培养时间过短或者过长,也有可能是所用的培养基不是很适合该菌株生长,导致产酶量低。八、个人心得

通过接近两个星期的实验,我受益匪浅。说真的,一开始的时候,我是很期待这个大实验的到来,很想体验一下老师口中所说的辛苦到底是多累。的确,也只有亲身经历过才能体会到其中的苦与甜。

在微生物理论方面,通过这次的实验,我们可以巩固一下在课堂上所学到的知识,特别是有关细菌方面的,也学到了很多有关细菌的课外知识,比如一些生理生化鉴定(明胶液化试验、酪氨酸水解试验等等)。若没有这次的大实验,我想很多同学都不知道什么是明胶液化试验、什么是酪氨酸水解试验吧。是这一次大实验,给了我们一个动力(或者是压力),让我们主动去查找文献、去了解、去学习。总之,这次的大实验让我学到了更多的知识。

在实验操作方面,通过这次大实验,我们的实际操作能力得到了很大的提高。一开始的时候,连倒平板都很生疏,但是,慢慢地,就越来越熟悉这个操作,至少手不会像一开始那样颤抖。也慢慢地意识到无菌操作在微生物学实验中具有十分重要的地位,一弄不好就会被杂菌污染导致整个实验失败。

当我回想起整个实验的时候,给我印象深刻的就是——芽孢染色了。原因就是我们花了七、八个小时,最终也没有成功。一开始的时候,我们认为失败可能是因为操作不够熟悉,掌握的不够好,然后就不断地做,可是结果还是一样,没有成功。我们也考虑到可能是培养时间过短或者过长,但是做单染色却能找到芽孢。最后老师告诉了我们是染色试剂出了问题。通

过这次的芽孢染色实验,让我看到了自己对考虑问题存在的不足,懂得了分析问题要更加全面。或许从另一个角度来看,虽然我们花了很长的时间最终没有成功,但是至少我们为之坚持过、执着过。在这个过程中,我们操作能力也得到了提高。

通过这个实验,也让我意识到团队之间合作的重要性。的确,要是没有队友们的帮助,我们也不能这么顺顺利利地完成实验。因为不是每个人都能把每件事都考虑得周周到到,而通过讨论,才不断地发现自己存在的不足,不断学习。就比拿方案,就是通过我们的讨论,不断地完善,才得到最终的方案。在实验过程中,也是不断地讨论,然后把问题解决。当然,也因为有老师们的帮助,才能把很多我们不懂的问题解决,使我们少走了很多“弯路”。一般来说,很多不懂或者不确定的事,就是找老师帮我们解决的。

总而言之,通过这次的大实验,我学到了很多知识,也懂得了不少。

九、注意事项

1.要严格按照培养基配方配制培养基;

2.观察结果时要注意滴加试剂的量以及反应时间;

3.严格无菌操作,防止污染情况发生;

4.盛药品用的药匙不要混用,盛完药品及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作,避免回调。不同的培养基各有配制特点,要注意具体操作;

5.革兰氏染色时要注意脱色时间的控制,过长或过短会影响结果;

6.在芽孢染色时,应注意温度的控制,避免染液蒸腾,影响实验结果。

十、参考文献

【1】布瑞德——伯杰氏系统细菌学手册(第8版)

【2】沈萍——微生物学实验

【3】傅冰,王东明——土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定及提高产酶能力的研究 [J] 《绿色科技》. 2012,(03)

【4】邹伟, 赵玉军, 陈晓月——土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定[J]. 四川畜牧兽医. 2008,(02)

【5】龚国淑,张世熔,唐志燕——土壤芽孢杆菌分离方法的比较——以成都郊区土壤为例[J] 中国农业科学. 2008,(11).

【6】徐琛——产淀粉酶芽孢杆菌的筛选和分离[J]. 齐鲁师范学院学报. 2011,(7)

【7】王世荣,徐龙,张树华,杨震国——常见几种芽孢杆菌产淀粉酶的比较[B].饲料博览2005,2

【8】杨慧,王振华,潘康成,祝小,吴敏峰——芽孢杆菌产淀粉酶活性的研究.现代农业科技 2007,2

淀粉酶含量测定

淀粉酶(AMS)测定试剂盒说明书 (碘-淀粉比色法) 一、 原理: 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精,在底物浓度已知并且过量的情况下,家人碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物,根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量,从而计算出AMS 的活力。 二、 试剂组成与配制:(100T ) 1、0.4mg/ml 底物缓冲液:60ml ×1瓶,4℃冰箱保存6个月。 2、0.1mol/L 碘贮备液:7ml ×1瓶,4℃避光保存6个月。 0.01mol/L 碘应用液的配制:将碘贮备液:蒸馏水=1:9稀释,现用现配4℃避光保存。 三、 操作表: 测定管(u 管) 空白管(0管) 底物缓冲液(ml )37℃预温5分钟 0.5 0.5 待测样本(ml ) 0.1 混匀,37℃水浴,准确反应7.5分钟 碘应用液(ml ) 0.5 0.5 蒸馏水(ml ) 3.0 3.1 混匀,660nm 波长,1cm 光径,蒸馏水调零,测各管吸光度。 *注:不同样本批量测试前需要做预实验,确定最佳取样浓度,将 (空白OD-测定OD 控制在0.05~0.150之间) 四、 计算: 1、 单位定义:100ml 血清(浆)中的AMS ,在37℃与底物作用30分钟,水解10mg 淀粉为1个单位。 2、公式: 样本测试前稀释倍数空白管吸光度 测定管吸光度空白管吸光度样本测试前稀释倍数分钟分钟空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度??-=?????-=801 .01005.730105.04.0dl AMSu (此公式适用于测定血清中淀粉酶)

血清淀粉酶的含量测定 一、实验准备: 1、实验器材:移液枪(100~1000ul、10~100ul、1000~5000ul、2~20ul)、5mlEP管、0.5mlEP 管、比色皿、100ml烧杯、漩涡仪、水浴箱,分光光度计、计时器。 2、实验药品:NaCl、蒸馏水、0.4mg/ml底物缓冲液、0.1mol/L碘贮备液。 二、实验步骤: 1、0.01mol/L碘应用液的配制: 将碘贮备液:蒸馏水=1:9稀释,现用现配4℃避光保存。 2、生理盐水的配置: 称取9gNaCl置100ml烧杯,加入100ml蒸馏水,溶解即得。 3、样品最佳取样浓度摸索: 取待测血清用生理盐水稀释成不同比例(2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍等倍数进行稀释),取0.1ml进行检测。 取两个5mlEP管,标记为空白、血清所稀释的倍数,分别加入底物缓冲液0.5ml,其中带有倍数的EP管加入相应的稀释好的血清0.1ml,于漩涡仪上混匀,同时放入37℃水浴箱反应7.5分钟,取出后各加入0.5ml 0.01mol/L 碘应用液,空白管加入3.1ml蒸馏水,带有倍数的EP管加入3.1ml蒸馏水,混匀,蒸馏水调零,迅速于660nm波长测定吸光度,控制空白OD-测定OD在0.05~0.150之间。 4、样品测定: 将所需测定样品按摸索确定的倍数稀释,同法测定吸光度,记录数据。 5、数据处理:按给定公式计算待测血清淀粉酶含量。 注:加入碘应用液后不能长时间放置,否则碘见光分解后影响测定结果

测定α淀粉酶活力的方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识,了解测定α-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质,通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有:催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基,辅酶,金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质,称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性,其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化,导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂,铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的,有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂,而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中,反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的:一方面随着温度的增加,反应速度也增加,直至最大反应速度为止;另一方面随着温度的不断升高,而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样,反应中某一PH范围内酶活力可达最高,在最适PH的两侧活性骤然下降,其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂,主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度,以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶,作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键,迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖,使淀粉的粘度迅速下降,淀粉与碘的反应逐渐消失,这种作用称为液化作用,生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键,因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色,糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色,较小的糊精(少于6个葡萄糖单位)遇碘不显色的呈色反应,来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程,从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响

淀粉酶活力测定实验报告

淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热,70? 15min 则被钝化。测定时,使其中一种酶失活,即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖,利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸,测定其吸光度,从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管,分光光度计,酸度计,电热 恒温水浴锅,离心机,电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g,定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g,定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6

的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g,定容至100ml水中,紧盖瓶塞,勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8,加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料,去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液,磨碎后以2000r/min 离心10min,转出上清液备用。取上清液1.0ml,用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍,所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。

实验七尿淀粉酶活性测定

实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶(AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉,它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型(P型)和 唾液型(S型)及其亚型同工酶组成,P型淀粉酶主要来源于胰腺,S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小,故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺,正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释,观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下,恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色)的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位,乘以尿的稀释倍数,即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管(10mn X 100mr)、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液(自备)。 2、取 10支试管,编号,用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管(注意应用刻度到头的)向第一管加尿液1ml,混合,再将试管中的液 体吸起,然后任其流回试管,如此重复三次,以便全管混匀,并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀,并取出1ml 置于第三管中。依此类推,如此继续稀释 至第九管后,吸出1ml混合液弃之,这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml,迅速摇匀(是否充分混匀往

唾液淀粉酶活性的测定

影响唾液淀粉酶活性的研究 摘要:讨论了不同条件下唾液淀粉酶的活性差异,实验结果表明,影响唾液淀粉 酶活性的因素很多,必须在适宜的条件下,才能发挥最佳催化作用;淀粉酶具有 高度专一性,其活性受温度、pH值、激活剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多 种因素的影响;每个人产生唾液淀粉酶的量不同,活性强弱也有差异。 关键词:淀粉酶;活性;温度;抑制剂;激活剂;专一性 2影响唾液淀粉酶的活性的因素 (一)实验目的 观察淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察温度、pH、激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响。 (二)实验原理 人唾液中淀粉酶为α-淀粉酶,在唾液腺细胞中合成。在唾液淀粉酶的作用下,淀粉水解,经过一系列被称为糊精的中间产物,最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下: 淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖、葡萄糖 淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色、麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。 淀粉与糊精无还原性,或还原性很弱,对班氏试剂呈阴性反应。麦芽糖与葡萄糖是还原性糖,与班氏试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。 唾液淀粉酶的最适温度为37-40°C,最适pH为6.8.偏离此最适环境时,酶的活性减弱。 低浓度的Cl-离子能增加淀粉酶的活性,是它的激活剂。Cu2+等金属离子能降低该酶的活性,是它的抑制剂。 (三)器材及试剂 1、器材:试管、酒精灯、烧杯、恒温水浴锅、量筒、冰浴、玻璃棒、试管夹、白磁板、试管架、铁三脚架、唾液淀粉酶 2、试剂:1%淀粉溶液、碘液、班氏试剂、0.4%HCl溶液、0.1%的乳酸溶液、1%NaCl溶液、1%CuSO4溶液、0.1%淀粉溶液 (四)操作步骤

(植物中)淀粉酶活性的测定

(植物中)淀粉酶活性的测定 一实验目的 本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。 二实验原理 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中,有α-淀粉酶及β-淀粉酶,其活性因植物生长发育时期不同而有所变化,其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。 α-淀粉酶和β-淀粉酶都各有其一定的特性,如β-淀粉酶不耐热,在高温下容易钝化,而α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶,测定时,可以根据他们的特性分别加以处理,钝化其中之一,即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β-淀粉酶,便可测定α-淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理,钝化α-淀粉酶,以测出β-淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖,可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团,在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比,故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。 三实验材料 萌发的小麦、大麦或者豆类等(芽长1cm左右) 四实验仪器和试剂 1.仪器: 电子天平、研钵、100mL容量瓶(1个)、50mL量筒(1个)、刻度试管[25mL(9个)、10mL(1个)]、试管6支、移液管[1mL(2支)、2mL(2支)、10mL(2支)]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计 2.试剂: 1%淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、 pH5.6的柠檬酸缓冲液:A、称取柠檬酸20.01g,溶解后稀释至1 000mL;B、称取柠檬酸钠29.41g,溶解后稀释至1 000mL;取A液13.70mL与B液26.30mL 混匀即是。 3,5-二硝基水杨酸:精确称取3,5-二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH 中,加入50mL蒸馏水,在加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL,盖紧瓶盖,勿让CO2进入。 麦芽糖标准液:称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL 容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度。 五操作步骤 1.酶液的提取: 称取萌发的水稻种子0.5g(芽长1cm左右,置于研钵中加石英砂研磨成匀浆,移入25mL刻度试管中,用水稀释至刻度,混匀后在温室下放置,每隔数分钟振荡一次,放置20分钟后离心,取上清液备用。 2.α-淀粉酶活性的测定: (1)取三支试管,编号注明1支为对照管,2支为测试管。 (2)于每管中各加入酶提取液1mL,在70℃恒温水浴中(水文的变化不应该超过±0.5℃),准确加热15分钟,在此期间β-淀粉酶受热钝化,取出后迅速在自来水中冷却。

淀粉酶活性测定实验报告

班级:植物092 姓名:徐炜佳学号:03 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白,几乎所有的生化反应都离不开酶的催化,所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色,因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数,反映的是酶的催化能力,因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征,通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称,按照其水解淀粉的作用方式,可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种,存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中,而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶,分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶,β-淀粉酶不耐热,在高温下易钝化,而α-淀粉酶不耐酸,在下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性,在高温下(70℃)下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的,淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖,可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定,由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团,将其颜色的深浅与糖的含量成正比,故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差,每组实验都做了相应的对照实验,在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间,以减小误差。并且在酶的作用过程中,四支测定管及空白管不要混淆。

实验三、淀粉酶活性的测定实验报告

实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热,70℃ 15min 则被钝化。测定时,使其中一种酶失活,即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖,利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸,测定其吸光度,从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管,分光光度计,酸度计,电热恒温水浴锅,离心机,电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g,定容至1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g,定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g,定容至100ml水中,紧盖瓶塞,勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料,去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液,磨碎后以2000r/min 离心10min,转出上清液备用。取上清液1.0ml,用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍,所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40℃士 0.5℃恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40℃下预热的1%淀粉溶液2m1,摇匀,立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶

淀粉酶活性的测定

淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶(amylase)包括几种催化特点不同的成员,其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端,生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉浆的粘度下降,因此又称为液化酶;β-淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶;葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶,特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强,主要是α-和β-淀粉酶。Α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;而β-淀粉酶不耐热,在70℃15min则被钝化。根据它们的这种特性,在测定时钝化其中之一,就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶的活力,再与非钝化条件下测定的总活力(α+β)比较,求出β-淀粉酶的活力。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料:萌发的小麦种子(芽长约1cm)。 (二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 离心机;3. 恒温水浴(37℃,70℃,100℃);4.具塞刻度试管;5. 刻度吸管;6. 容量瓶。 (三)试剂(均为分析纯):1. 标准麦芽糖溶液(1mg/ml):精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100ml;2. 3,5-二硝基水杨酸试剂:精确称取1g3,5-二硝基水杨酸,溶于20ml2mol/L NaOH溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞,勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用;3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液(0.1mol/L 柠檬酸):称取C6H8O7.H2O 21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L;B液(0.1mol/L 柠檬酸钠):称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g,用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀,即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液;4.1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 三、实验步骤 (一)麦芽糖标准曲线的制作:取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表(详教材)加入试剂。摇匀,置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制标准曲线. (二)酶液制备:称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm),置于研钵中,加少量石英砂和2ml蒸馏水,研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中,用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15~20min,每隔数min搅动1次,使其充分提取。然后在3000rpm 下离心10min,将上清液倒入100ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml,放入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶稀释液。 (三)酶活力的测定:取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表(详教材)进行操作。(四)结果计算:淀粉酶活力=C×V T/(W×V s×T)(mg/g/min)。式中,C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量(mg);VT为淀粉酶原液总体积(ml);Vs为反应所用淀粉酶原液体积(ml);W为样品重量(g);t为反应时间(min)。

测定α-淀粉酶活力的方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH 对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识,了解测定a-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质,通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有:催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基,辅酶,金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质,称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性,其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化,导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂,铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的,有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂,而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中,反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。 温度对酶反应的影响是双重的:一方面随着温度的增加,反应速度也增加,直至最大反应速度为止;另一方面随着温度的不断升高,而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样,反应中某一PH 范围内酶活力可达最高,在最适PH 的两侧活性骤然下降,其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级a - 淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂,主要由枯草芽孢杆菌、 黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对 淀粉的水解程度,以及产物的性质等均有差异。a -淀粉酶属水解酶,作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的a -1,4 糖苷键,迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖,使淀粉的粘度迅速下降,淀粉与碘的反应逐渐消失,这种作用称为液化作用,生产上又称 a -淀 粉酶为液化淀粉酶。a -淀粉酶不能水解淀粉支链的 a -1,6糖苷键,因此最终水解产物是麦芽 糖、葡萄糖和a -1,6 键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色,糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色,较小的糊精(少于6 个葡萄糖单位)遇碘不显色的呈色反应,来追踪a -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程,从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响 (一)试剂及材料 1、1: 30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口,1min后收集唾液,以1: 30倍蒸馏水稀释。

淀粉酶活力测定

淀粉酶活力的测定 一、目的 学习和掌握测定淀粉酶(包括a -淀粉酶和B -淀粉酶)活力的原理和方法。 二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括a -淀粉酶和B -淀粉酶两种。a -淀粉酶可随机地作用于淀粉中的a -1,4- 糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。B -淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使 3,5- 二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3-氨基-5- 硝基水杨酸,其反应如下: 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是a -淀粉酶和B -淀粉酶。两种淀粉酶特性不同,a-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化。B -淀粉酶不耐热,在70C 15min钝化。根据它们的这种特性,在测定活力时钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化B -淀粉酶,测出a-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力(a -淀粉酶活力+B -淀粉酶活力),再减去a -淀粉酶的活力,就可求出B-淀粉酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1 .实验材料 萌发的小麦种子(芽长约1cm) 2.仪器 (1)离心机(2)离心管(3)研钵(4)电炉(5)容量瓶:50mL X 1,100mL X 1 (6)恒温水浴(7)20mL具塞刻度试管X 13 (8)试管架(9)刻度吸管: 2mL X 3,1mL X 2,10mL X 1 (10)分光光度计 3.试剂(均为分析纯)

α–淀粉酶活力测定

α–淀粉酶活力测定 ----目视碘比色法 一实验目的 1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。 2.掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。 二、实验原理 比色法作为一种定量分析的方法,是以生成有色化合物的显色反应为基础,通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种:目视比色法和光电比色法,两种方法都是以朗伯比尔定律 (A=kLC)为基础。 酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位(U)(active unit)表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(IU)来表示酶的活力,规定为:在最适条件(25℃)下,每分钟内催化1微摩尔(μmol)底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位,即1IU = 1μmol /min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示(U/g或U/ml)。 淀粉(紫蓝色,30分子以上)红色糊精(红棕色,7-30分子)无色糊精(7分子以下)、麦芽糖不显色。通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间,以标准糊精(红色糊精)和碘反应的颜色作为终点指示(所给定的淀粉都已转化为糊精的时间)。 碘比色法酶活力规定:在60℃条件下,1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。 三、实验操作 1.取试管1支,加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。 2.取锥形瓶一个,加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3.将锥形瓶置于60℃水浴中,保温5分钟。 4.在比色盘中加入比色碘液,每穴2滴。 5.在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml,摇匀,开始计时。 6.在反应的前4分钟,每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体,与比色稀碘液混合,而后,每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合,直至呈色与终点色一致。 四、酶活性计算 实验注意事项: (1)测定酶促反应在锥形瓶中进行,标准反应在试管中进行。 (2)比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。 (3)应时间大约在10-15分钟。 (4)稀释倍数1250倍。

04碘淀粉比色法测定唾液淀粉酶

碘-淀粉比色法测定唾液淀粉酶 一 实验目的 1、 掌握比色法测定a-淀粉酶的原理; 2、 掌握分光光度计的正确使用方法; 二 实验原理 1、比色法作为一种定量分析的方法,是以生成有色化合物的显色反应为基础,通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种:目视比色法和光电比色法,两种方法都是以朗伯-比尔定律 (A =εbc)为基础。 2、血清中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1,6糖苷键支链的糊精。 a-淀粉酶 淀粉 葡萄糖+麦芽糖+糊精 + 碘液 蓝色复合物 在底物过量的条件下,反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物,其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较,从而推算出淀粉酶的含量。 3、酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位(U )(active unit )表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(IU )来表示酶的活力,规定为:在最适条件(25℃)下,每分钟内催化1微摩尔(μmol )底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位,即1IU = 1μmol /min 。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示(U/g 或U/ml )。 4、 计算公式: A A 1.65100AMY A 55X -=???空白管吸光度测试管吸光度空白管吸光度 其中,A A A -空白管吸光度测试管吸光度 空白管吸光度 代表测定管淀粉的大致水解程度,大小范围为0~l 。当测定管淀粉未被水解时,其蛋白酶活性为0;当测定管淀粉被完全水解时,其值为1。1.61515151100 X ????中,5151100??”为碘一淀粉比色法中淀粉酶活性的单位定义-100ml 唾液中的淀粉酶,在37度5min 水解淀粉5mg 为1个单位,1.6151X ??表示实验的测试条件:X 代表稀释后的唾液量,稀释倍数根据个人的情况而定,若50倍稀释唾液0.1ml ,则唾液量为0.002ml ,反应时间为5分钟,1.6g/L 淀粉溶液1.0ml ,即淀粉量为1.6mg 。1.61515151100 X ????含义即为在实验条件下, Xml 唾液中的淀粉酶在5分钟内水解1.6mg 淀粉,则其活性为32/X 个单位,再将其乘以水解程度,则整个公式代表了测定管淀粉酶的活性。 三 仪器与试剂 仪器:分光光度计及1cm 比色皿;吸量管;水浴锅;量筒;移液器等

淀粉酶活性的测定

淀粉酶活性的测定 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中,其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。植物中有α–淀粉酶和β–淀粉酶,其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。通过本实验掌握淀粉酶的提取和测定方法。 一、原理 α–淀粉酶和β–淀粉酶,各有其一定的特性,如β–淀粉酶不耐热,在高温下易钝化,而α–淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在,测定时,可根据它们的特性分别加以处理,钝化其中之一,即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70℃维持15 min以钝化β–淀粉酶,便可测定α–淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理,钝化α–淀粉酶,以求出β–淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖,可用3,5–二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团,在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比,故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料 萌发的小麦(芽长1 cm左右)。 (二)试剂 1. 1%淀粉:称取1.0g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH 5.6的柠檬酸缓冲液中。 2. 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01 g,溶解后稀释至l000 mL;B液:称取柠檬酸钠29.41 g,溶解后稀释至1000 mL。取A液55 mL与B液145 mL混匀,即为pH5.6之缓冲液。 3. 3, 5–二硝基水杨酸溶液:精确称取3, 5–二硝基水杨酸1 g溶于20 mL 2 mol/L氢氧化钠中,加入50 mL蒸馏水,再加入30 g酒石酸钾钠,待溶解后,用蒸馏水稀释至100 mL,盖紧瓶塞,勿使二氧化碳进入。 4. 麦芽糖标准液:称取麦芽糖0.100 g溶于少量蒸馏水中,仔细移入100 mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度。 (三)仪器设备 小台秤,研钵,容量瓶100 mL,具塞刻度试管,试管,刻度吸管l mL 2 mL 10 mL,离心机,恒温水浴,分光光度计。 三、实验步骤 1. 酶液的提取称取1.0 g萌发的小麦种子,置研钵中加2 mL蒸馏水和少量石英砂,研磨成匀浆后转入离心管中,用7mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管,提取液在室温下放置提取15~20 min,每隔数分钟搅动1次使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10 min,将上清液倒入50mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上速淀粉酶原液5mL,放入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液。2.麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表35–1加入试剂: 表35–1 制作麦芽糖标准曲线配方表 试剂管号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液(mL)0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0

淀粉酶活性测定实验报告

班级:植物092 姓名:徐炜佳学号:0901080223 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白,几乎所有的生化反应都离不开酶的催化,所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色,因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数,反映的是酶的催化能力,因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征,通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称,按照其水解淀粉的作用方式,可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种,存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中,而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α-淀粉酶、萌动种子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。

本实验的目的在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和测定方法。 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶,分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶,β-淀粉酶不耐热,在高温下易钝化,而α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性,在高温下(70℃)下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的,淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖,可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定,由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团,将其颜色的深浅与糖的含量成正比,故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差,每组实验都做了相应的对照实验,在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间,以减小误差。并且在酶的作用过程中,四支测定管及空白管不要混淆。 三、材料、试剂与仪器 实验材料:

实验二淀粉酶活性测定实验报告

实验二淀粉酶活性测定 实验报告 集团文件版本号:(M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988)

淀粉酶活性的测定 一、实验目的 酶的活力是酶的重要参数,反映的是酶的催化能力,因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征,通过计算适宜条件下一定 时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。α-淀粉酶是一种典型 的内切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化阶段,因此又叫液化酶。作 为一种最重要的工业酶制剂,α-淀粉酶广泛存在于动物,植物和微生物中。其中,微生物α-淀粉酶以其经济易得成为工业生产主要来源。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种。 本实验采用杨氏改良法测定α-淀粉酶;掌握测定α-淀粉酶活性大 小与温度关系的方法,通过分析得出酶的最适温度范围。 二、实验原理 酶促反应中,反应速度达到最大值时的温度和pH值称为某种酶作用 时的最适温度和pH值。温度对酶反应的影响是双重的:一方面随着温度的增加,反应速度也增加,直至最大反应速度为止;另一方面随着温度 的不断升高,而使酶逐步变性从而使反应速度降低,其变化趋势呈钟形 曲线变化。 不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度,以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶,作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键,迅速地将直链淀 粉分子切割为短链的糊精或寡糖,使淀粉的粘度迅速下降,淀粉与碘的

反应逐渐消失,这种作用称为液化作用,生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键,因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色,淀粉含量越高,颜色越深。用分管光度计检测显色效应大小,通过分管光度值计算酶活力 注意:实验中为了消除非酶促反应引起的淀粉水解带来的误差,每组实验都做了相应的对照实验,在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间,以减小误差。并且在酶的作用过程中,三支测定管及空白管不要混淆。 三、材料、试剂与仪器 实验材料:α-淀粉酶 仪器:分光光度计、电热恒温水浴锅、小台秤、研钵、玻璃仪器若干 试剂: ① 0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl: ② 0.005%工作碘液:0.5克I2和5.0克KI水中研磨,定容至1000mL; ③1%糊化淀粉溶液:称取1.0克淀粉,加入25mL0.4M NaOH,60℃ COOH,定容至100mL; 5min,冷却后加25mL0.4M CH 3 ④稀释α-淀粉酶溶液:待测样品 四、实验步骤 ① 10mL1%淀粉溶液加入试管中,室温25/45/65℃保温10min

生化实验--淀粉酶活性测定标准实验报告

实验二:酶活力测定方法的研究 一.研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白,几乎所有的生化反应都离不开酶的催化,所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色,因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数,反映的是酶的催化能力,因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征,通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。本实验选取萌发的禾谷类种子为材料,通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。 二.实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶,分别是α淀粉酶和β淀粉酶,β淀粉酶不耐热,在高温下易钝化,而α淀粉酶不耐酸,在pH3.6下则发生钝化[1]。本实验的设计利用β淀粉酶不耐热的特性,在高温下(70℃)下处理使得β淀粉酶钝化而测定α淀粉酶的酶活性[1]。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的,麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性,拟将总活性与α淀粉酶的活性的差值看作β淀粉酶的活性,再做进一步分析。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差,每组实验都做了相应的对照实验,在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 三.材料、试剂与仪器 材料: 萌发的小麦种子 试剂: ①1%淀粉溶液(称取1克可溶性淀粉,加入80ml蒸馏水,加热熔解,冷却后定容至100ml); ②pH5.6的柠檬缓冲液:A液(称取柠檬酸20.01克,溶解后定容至1L)

B液(称取柠檬酸钠29.41克,溶解后定容至1L)取A液5.5ml、B液14.5ml 混匀即可; ③3,5-二硝基水杨酸溶液(称取3,5-二硝基水杨酸1.00克,溶于20ml 1M 氢氧化钠中,加入50ml蒸馏水,再加入30克酒石酸钠,待溶解后,用蒸馏水稀释至100ml,盖紧瓶盖保存); ④麦芽糖标准液(称取0.100克麦芽糖,溶于少量蒸馏水中,小心移入100ml 容量瓶中定容); ⑤0.4M NaOH 仪器: 722光栅分光光度计(编号990695) DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) 离心机(TDL-40B) 配平天平药物天平电热锅 100ml容量瓶50ml容量瓶移液管试管研钵烧杯洗瓶 四.实验方法 本实验按照下列表格的中的操作步骤进行:

淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法 淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶,它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶,性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。 α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键,单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定,它比较耐热但不耐酸,pH 3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键,遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶,不需要Ca 2+ 及Cl —等辅助因子,最适pH偏酸,与α -淀粉酶相反,它不耐热但觉耐酸,60 ℃保温15min 可使其钝化。 通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定(α + β)淀粉酶总活力,然后在60 ℃加热15 min ,钝化β-淀粉酶,测出α -淀粉酶活力,用总活力减去α - 淀粉酶活力,就可求出β- 淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基-5- 硝基水杨酸,生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小。 1 酶活测定方法 (1)标准曲线的制作(见下表) ①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。 表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值 试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液(mL)0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O(mL) 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量(mg)0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520 (2)粗酶液淀粉酶活力测定 ①待测粗酶液的制备: 发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体,在上清液中加入65%饱和度的硫酸铵,待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h,然后5000r/min离心20min,得到初步

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