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MTT法测定乳酸菌活菌数的研究
黄立坤，杜鹏2，霍贵成*
乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学） (哈尔滨 150030)
摘要建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。以乳酸菌中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为研究对象，探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围、反应时间、MTT 的用量、是否加入溶解剂等实验条件。结果：保加利亚乳杆菌在(1.0×105～2.18×107) cfu/mL内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间1.5 h，MTT添加量20 μL，测量前用DMSO溶解；嗜热链球菌在(2.0×105～5.12×107) cfu/mL范围内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间2.0 h，MTT添加量20 μL，可不添加溶解剂直接测量。MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。关键词MTT；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；活菌计数
Inquiring into the Method of Counting Live Germ with MTT
Abstract To establish a rapid, steady and sensitive bacteria-counting method that could reflect the bacteria’s activity. Lactabacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and St reptococcus thermophilus were employed to discuss the feasibility of application of MTT method to bacteria-counting and determine the conditions of the assay, including linear range, reaction time, MTT dosage and whether solvent is added etc.. Results: The optical density at 570 nm is positively related to the concentration of L.delbrueckii ssp. bulgaricus when the number of the bacteria is in the range of (1.0×105~2.18×107) cfu/mL, and reacting time is 1.5 h, MTT dosage is 20 μL, and DMSO is used as solvent before assay; For St.thermophilus , the optical density at 570 nm is positively related to the concentration of the bacteria when the number of the bacteria is in the range of (2.0×105~5.12×107) cfu/mL, and reacting time is 2.0 h, MTT dosage is 20 μL and solvent is not added.. Conclusion: MTT colorimetry could be used to measure the viability of lactic acid bacteria.
Keywords MTT colorimetry ；lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；live germ counting 基金项目：国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-08）资助。* 通讯作者
活菌计数在科研生产中有着广泛的应用，用于细菌计数的常规方法有平板稀释计数法(SPC)，自动菌数测定仪法，浊度法，菌体干重法等。SPC法为经典方法，但方法繁琐，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合于做大批量的实验；后几种方法不能区分细胞的死活，且测定结果受培养基、代谢产物的影响较大[1]。试验用MTT快速活菌计数法，以克服上述缺点，且工作量小，操作简单，快速，重复性好，能区分死活菌等。
MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，结构式如图1。MTT法基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT的四唑环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Fonmazan），而死细胞无此作用[2]。形成的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，在一定细胞浓度范围内，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性[3]。1 材料与方法
1.1 材料
图1 MTT的分子结构式
1.1.1 菌种
保加利亚乳杆菌（L . delbrukki subsp. bulgaricus ，L.b ）1.8501菌株和嗜热链球菌（S .thermophilus ，S.t ）3.8501菌株，均为乳品科学教育部重点实验室（KLDS ）提供。1.1.2 试剂及溶液
（1）试剂：MTT，二甲亚砜(DMSO)。
（2）MTT溶液配制：称取100 mg MTT (Amresco 分装)于小烧杯中。加20 m L P B S (0.0l m o l /L ，pH=7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存。两周内使用，时间过长，溶液中易进微生物起反应，改变MTT溶液的浓度。
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（3）PBS溶液配制（用于溶解MTT）：8 g氯化钠，1.15 g磷酸氢二钾，0.2 g磷酸二氢钾去离子水定容至1 000 mL，用精密pH计调节pH=7.2，溶液浓度为0.01 mol/L。121℃灭菌15 min，室温保存。
（4）PBS溶液配制（用于稀释菌液）：8.5 g氯化钠，0.2 g氯化钾，2.85 g磷酸氢二钠，0.27 g磷酸二氢钾，去离子水定容至1 000 mL，pH值调至7.0，121℃灭菌15 min，室温保存。
（5）培养液的配制：保加利亚乳杆菌用液体MRS培养，嗜热链球菌用M17+1.5%乳糖培养。1.1.3 设备
BID-RAD 680全自动酶标仪：日本；HVE-50高温高压灭菌锅：HIRAYAMA，日本；DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；VD-1320洁净工作台：北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；METTLER-TOLEDO320pH计：瑞士；GL-21冷冻离心机：上海市离心机械研究所；芬兰可调式移液器：热电上海仪器有限公司。1.2 方法
1.2.1 乳酸菌的培养方法
将500 mL的液体培养基装入三角瓶中，121℃灭菌15 min后，接入3％的种子培养液，1.8501菌株于37℃培养12 h~15 h，3.8501菌株于42℃培养14 h～16 h，然后收获菌体。1.2.2 平板菌落计数法
将不同稀释度的菌液0.1 mL加入到预先准备好的固体平皿培养基中，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20 min～30 min，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温箱中培养，48 h后计数。1.2.3 MTT比色实验
（1）取发酵好的菌液，用灭好菌的PBS稀释液倍比稀释成10个浓度，分别对不同浓度的菌液做MTT比色实验，同时选择合适的稀释度，做平板菌落计数。
（2）用微量吸液器吸取不同浓度的发酵液100 μL，分别加入96孔酶标板中，每个样液做5个复孔，同时设阴性对照。
（3）用微量吸样器在96孔酶标板中含有样品的各孔分别加入10 μL或20 μL的MTT应用液，1.8501菌株于37℃、3.8501菌株于42℃恒温培养箱放置数小时后取出，向各孔分别加入100 μL的DMSO，用全自动酶标仪于570 nm处测定OD 570值，测量前振动60 s。2 结果与讨论
2.1 甲臜在DMSO溶剂中的光吸收值
甲臜的DMSO溶液呈蓝紫色，不同的文献报道其吸收峰值有所差异，分别有在525 nm [3] ，550 nm [4]，570 nm [5]处的。考虑到实验的具体影响因素不同，需
具体测定实验中甲臜溶液的吸收光谱。扫描范围为450 nm~650 nm，测量结果如图2所示，由图可知，甲臜
的最大吸收峰在570 nm处。
?? QP
2'?
图2 甲臜最大吸收峰的确定
2.2 最佳反应条件的确定
不同菌种因活性不同其反应时间也不一样。通过观察菌液颜色变化，分别设定三个反应时间：1.8501菌株为0.5 h，1.0 h，1.5 h；3.8501菌株为2.0 h，3.0 h，4.0 h。加入MTT的量设为10 μL或20 μL两个梯度，反应结束后立即测定OD 570值，每孔加入100 μL 的DMSO后再测一次。
由测量结果可知，各孔OD 570值随反应时间的延长、MTT的量增加而有所增加，在测量范围内，细菌数与OD 570值均呈正相关。但1.8501菌株在反应1.5 h，加入20 μL MTT，并且添加DMSO溶剂时，相关性最好，相关系数r＝0.997，P<0.01，差异极显著；3.8501菌株在反应2.0 h，加入20 μL MTT，不添加DMSO溶剂时，相关性最好，相关系数r＝0.987，P<0.01，也具有极显著的相关性。不同条件下的线性相关分析如表1、表2所示。
表1 1.8501菌株活菌数与OD 570值线性相关结果
反应时间 /h MTT添加量 /μL R 2（反应后直接测OD 570值）
R 2（添加DMSO 后再测OD 570值）
0.5100.9580.9681.010
0.943
0.868
1.5100.9370.9270.5200.9610.9921.0200.9500.9131.5
20
0.957
0.997
表2 3.8501菌株活菌数与OD 570值线性相关结果
反应时间 /h MTT添加量 /μL
R 2（反应后直接测OD 570值）
R 2（添加DMSO后再测OD 570值）
2.03.04.02.03.04.0
101010202020
0.9620.9340.9540.9870.9780.962
0.9590.9550.9170.9520.9730.970
2.3 干扰物对测定结果的影响
对实验过程所要接触到的介质作干扰实验，在这里以DMSO为参比，MTT溶液、PBS溶液、空白培养基，死菌体(将活菌液在100℃沸水浴煮30 min)作为干扰物，用上述的MTT测定方法分别测定吸光值，结果如表3所示。
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表3 不同干扰物在570nm处的OD值
OD 570
DMSO 0.07MTT 溶液0.034PBS 溶液0.026MRS 0.14MRS 调pH 值0.144MRS 二次灭菌0.215死菌体0.767空酶标板
0.035
由表3可知，各种背景对OD 570值的测量结果都会有影响，尤其是菌体自身的影响最大，与其他组数据差异显著。所以，在做阴性对照时，一定要考虑到菌体浓度对OD 570值的影响；MRS液体培养基在570 nm处也有一定的吸光值，pH值的变化并没有引起OD 570值的显著差异，但是二次灭菌后，OD 570值显著增大，这可能是由于再次高压灭菌后，使培养基的颜色加深造成的，所以做阴性对照时，不能用高温高压的方法来灭菌，这会使测得的OD 570值偏小；DMSO，MTT，PBS稀释液在570 nm处的吸收值尽管存在，但都很小。
2.4 菌液浓度对测定结果的影响
将菌液离心后，菌泥用PBS溶液溶解，混匀，再离心，重复三次，最后加入与发酵液等量的PBS，制成PBS菌悬液。将菌悬液10倍梯度稀释，测OD 570值，结果如表4所示。
表4 不同浓度菌液的OD 570值
菌液浓度/cfu/mL
1231070.8720.9130.8591060.1410.1280.139105
0.0380.0340.034104
0.0240.0250.0221030.0240.0240.02210
2
0.0240.0240.023PBS溶液
0.023
0.025
0.021
将不同浓度的菌液的OD 570值进行单因素方差分析，分析结果如下表所示。
由表5可知，F＝2496.143，P<0.01，可以认为不同稀释度菌液的OD 570值存在极显著的差异，故须进行多重比较。
多重比较采用S-N-K法，由分析结果可知，菌液浓度为102、103、104、105以及PBS五组数据的样本均数两两之间均无显著差异；菌液浓度为106和107的两组数据的样本均数之间差异显著；而且在样本均数上，菌液浓度为106的样本与前5组的差异显著，菌液
浓度为107样本与前5组数据差异是极显著的。因此可知，当菌液浓度少于105 cfu/mL时，对OD 570值的影响是不显著的，而当菌液浓度达到106 cfu/mL以上时，会显著的增大OD 570值。
以上结论，与任娇蓉推断：MTT法测得的吸光值只跟活菌数有关系，而与培养基和细菌的代谢产物没有关系[6]，有不同的观点。
2.5 光吸收值与菌液浓度的关系
在最佳反应条件下，用SPSS软件包[7]将两株菌的菌液浓度Y(107 cfu/mL)与光吸收值OD 570进行线性回归分析，得到一直线关系，如图1、2所示。
表6 最佳反应条件下的菌液浓度与OD 570值
稀释倍数 1.8501（107cfu/mL）
OD 570值 3.8501（107cfu/mL）
OD 570值0 2.18 1.847 5.120.89121 1.090.900 2.560.417220.550.428 1.280.320230.280.3370.640.223240.140.2050.320.141250.070.040.020.01260.1290.0630.040.02270.160.080.040.0228
0.07
0.040.017
0.014
2'?
??? h F I X P /
<
乘? < ??
图1 1.8501菌株OD值与活菌数线性回归拟合图
01234560
0.2
0.4
0.6
0.8
1
OD 值 /570 nm
活菌数（1×107c f u /m L ）
Y 预测 Y 线性
图2 3.8501菌株OD值与活菌数线性回归拟合图
表7 两株菌的回归方程的方差分析
回归分析F Significance F 1.8501菌株1346.46 2.9E-093.8501菌株
270.2624
7.52E-07
由表7可知，两株菌的P值均小于0.01，说明活菌数与OD 570值之间存在极显著线性回归关系。故可以根据图3、图4中的回归方程，通过测定吸光值OD 570，来计算试验过程中培养液中活菌浓度。
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3 结论
3.1 活细胞体内的线粒体脱氢酶将淡黄色的MTT代谢后形成蓝紫色的甲臜,该物质在570 nm处有一个较宽的最大吸收峰，用酶标仪可对其进行直接测量，其值与活细胞的数量有良好的线性关系。
3.2 确定了MTT反应出现最好线性关系的反应条件：保加利亚乳杆菌为反应1.5 h，添加20 μL MTT，测量吸光值前用DMSO溶解；嗜热链球菌为反应2.0 h，添加20 μL MTT，不添加溶解剂直接测量吸光值。
3.3 背景会对OD 570值的测量有一定的影响，尤其是菌体浓度超过106 cfu/mL后，影响极其显著。因此，需将含有死菌体的培养液作为阴性对照。
3.4 MTT法作为一种间接测定方法，其使用的前提在于建立待测菌种的直接数据与菌体浓度之间的回归关系或标准曲线；使用的关键在于待测菌液的浓度必须调整到适用范围之内。而适用浓度下限存在的原因在于整套方法本身的灵敏度，当菌体数量太低时，由于系统误差造成的数据偏差相对于测定结果已经非常显著，因而线性关系弱化，方法不再适用。扩大MTT法的适用菌体浓度范围的办法在于提高操作的精确性，采用更加精密和灵敏的仪器，尽量减小系统误差。但
是，这样也会抬高MTT法的使用条件，影响其推广。
参考文献
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豆芽中6-苄基腺嘌呤的测定方法研究
林琳
上海市质量监督检验技术研究院 (上海 200233)
摘要建立豆芽中6-苄基腺嘌呤的液相色谱检测方法。以甲醇为提取剂，样品匀浆后超声波提取30 min，采用甲醇∶(0.1% HAC+0.02 moL/L乙酸铵)=1∶1做流动相，紫外检测器267 nm检测，不需浓缩，可达到检出限0.2 mg/kg，回收率97.1%，线性相关性r=1.000。与其它方法相比，该方法样品处理简单，毒性小，可操作性更强。
关键词6-苄基腺嘌呤；液相色谱法；提取剂
Method for Determination of 6-Benzylaminopurine in Bean Sprout
Lin Lin
Shanghai Technique Institute of Product Quality Supervision & Inspection (Shanghai 200233)
Abstract A method for determination of 6-benzylaminopurine in bean sprout was developed by high performance chromatography. The jam samples were extracted by methanol in ultrasonic apparatus for 30 minutes, then detected by UV detector with mobile phase 50% methanol and 0.1% HAC plus 0.02 moL/L acetic ammonium. The detection limit of this method reach to 0.2 mg/kg and the recoveries achieve 97.1% with linear relativity r=1.000. The preparation of samples was simple, no toxicity, without concentration, therefore this method has much more maneuverability than any other method.
Keywords 6-benzylaminopurine ；high performance chromatography ；extracting agent 6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine )又称N-苄基腺苷，简称6-BA，分子式为C 12H 11N 5，是目前国内外使用非常广泛的植物生长调节剂，其特点是用量少、效率高、毒性低。在细胞培养中用于诱导细胞分裂、
1121 抑菌效力检查法
抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。抑菌效力检查法 系用于测定灭菌及非灭菌制剂的抑菌活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也 可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。 如果药物本身不具有充分的抗菌效力， 那么应根据制剂特性 （如水溶性制剂） 添加适宜的抑菌剂， 以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染 和繁殖使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。 在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的 GMP 管理，不能作为 非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径， 也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前 的生物负载的手段。所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低 有效量。同时，为保证用药安全，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有 害的浓度。 抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影 响而变化， 因此，应验证成品制剂中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。 本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。 培养基 培养基的制备 胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、 沙氏葡萄糖琼脂培养基 照无菌检查法（通则 1101）制备。 培养基的适用性检查 抑菌效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱 水培养基或按处方配制的培养基均应检查。 菌种 试验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的冷
冻干燥菌种为第 0 代） ，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株 的生物学特性。培养基适用性检查的菌种及新鲜菌体培养见表 1。 表 1 培养基适用性检查、方法适用性试验、抑菌效力测定用的试验菌培 养条件 试验菌株 试验培养基 培养温度 培养时间
紫薯原名川山紫，又名黑薯、紫甘薯、紫红薯，富含花青素、膳食纤维及硒、碘、锌等矿物质，除具有普通红薯成分及功能外，还具有多种生理功能，是食品、饮料、医药、化妆品等领域的重要原料。我国紫薯资源丰富，但目前国内对其利用除鲜食外，主要用于加工紫薯红色素和紫薯全粉。紫薯的风味不及普通红薯，因此鲜食比例小、加工品种单一，研发适合大众消费的紫薯食品已成为当今研究热点。 乳酸菌及其发酵制品对人体健康有良好作用，具有助消化、改善肠道微生态环境、抑制腐败菌、合成营养素、提高免疫力等生理功效。为尽可能多地保留紫薯中的营养成分和生物活性物质，采用现代生物工程技术人工接种乳酸菌发酵，研发乳酸菌发酵紫薯系列营养食品，对于提高紫薯原料利用率、扩充产品品种、提升产品档次、促进农户增收具有重要意义。适宜的发酵工艺条件是保证乳酸菌发酵紫薯系列营养食品优质原料的首要环节，因此，以紫薯为发酵基质，探究乳酸菌发酵最优工艺条件，为后续产品开发提供理论依据。 发酵剂制备 1 ）菌种活化：将引进的菌种分别接种至 MRS 固体培养基（重复 3 次）， 28 ℃恒温培养 48 h ，备用。 2 ）菌种扩大培养：将活化菌种转接至 MRS 液体培养基， 28 ℃恒温培养 24 h ，备用。 3 ）菌种驯化：乳酸菌液体菌种（二级种）→甘蓝紫薯汁（甘蓝∶紫薯汁 =3∶2 ）→培养→甘蓝紫薯汁（甘蓝∶紫薯汁 =2∶3 ）→培养→甘蓝紫薯汁（甘蓝∶紫薯汁 =1∶ 4 ）→培养→甘蓝紫薯汁（甘蓝∶紫薯汁 =1∶9 ）→培养→30% 纯紫薯汁→培养。驯化后的菌种穿刺保存 发酵条件的确定 1 ）发酵剂接种量的选择：以紫薯片为发酵原料（加水 50% ），设定 0.5% ， 1.0% ， 1.5% ， 2.0% ， 2.5% ， 3.0% 6 个接种量，在 28 ℃恒温培养，测定不同时期的产酸（ pH 值）情况，确定发酵剂接种量。 2 ）发酵温度和时间的选择：以紫薯片为原料（加水 50% ），在接种量为 2.0% 的情况下，设定16 ， 18 ， 20 ， 22 ， 24 ， 26 ， 28 ， 30 ℃ 8 个发酵温度，定期测定其产酸（ pH 值）情况，结合感官评价标准确定发酵温度和时间。 不同发酵剂配比对紫薯发酵效果的影响
乳酸菌的筛选（初筛） 一、实验目的 对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。 二、实验材料 PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。 三、实验步骤 1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。 2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。 3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10- 4、10-5梯度菌液进行平板涂布。 4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。 5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。
乳酸菌的筛选 一、实验目的 利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。 二、实验原理 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 四、实验步骤 1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。 2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。 3、划线：于超净工作台中，将涂布平板中的单菌落用接种环挑取，按图1中所示的方法与平板上划线。 4、将接种好的平板置于37℃厌氧培养箱中培养24h。 5、培养期间，注意观察菌的生长情况，培养结束后，拍照留底。
微生态制剂（农业部官方称为“微生物饲料添加剂”）在20世纪70年代兴起时，被认为只有活的微生物才能起到微生态的平衡作用，因此认定微生态制剂是活菌制剂，甚至有一段时间，把微生态制剂就称为“活菌制剂”。但随着科学研究的不断深入，大量资料证明，死菌体、菌体成分、代谢产物也具有调整微生态失调的功效。因此，在1994年德国海德堡召开的国际微生态学术讨论会上，修改了微生态制剂（益生菌）的定义：“益生菌是含活菌和（或）死菌，包括其组分和产物的活菌制品，经口或经由其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面处微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制”。人们对活菌的作用比较容易理解，而对死菌的作用了解甚少，有资料证明，从电镜也能直接观察到死菌体也可黏附在肠壁，排斥有害菌，从而调节微生态平衡；菌体的细胞壁成分—— —脂磷壁酸（LTA）及胞壁肽聚糖（PG），二者都能抑制腐败菌的致癌作用，并有很强的免疫激活作用。死菌体的特点是质量较稳定，比活菌更安全，并可以与抗生素同时使用。代谢产物是指细菌在生命活动过程中产生的代谢产物（排泄物），如酸性物质及细菌素对有害菌有拮抗、杀灭作用，细菌分解食物后的氨基酸以及合成的维生素、酶具有营养作用，菌体碎片对动物体也有免疫促进作用。代谢产物的特点是对动物体的作用较快。 按照最新的益生菌概念内涵来理解，则给微生态制剂的质量评定增加了不少困难。即从成分上至少包括三个方面：活菌数量、死菌体含量、代谢产物的种类及含量。FAO/WHO对益生菌也作了定义：益生菌是活的微生物，当摄入足够数量时，对宿主起有益健康作用。大家公认的观点是：益生菌首先在销售过程中要保持活性（存活），而且在动物饲用后还要抵抗胃液、胆汁的强酸性消化作用。在国标《微生物饲料添加剂技术通则(NY/T1444—2007)》（以下简称《通则》）中指出，微生物饲料添加剂(microbial feed additive)是指在饲料中添加或直接饲喂给动物的微生物或微生物及其培养物，参与肠内微生态平衡或者刺激特异性或非特异性免疫功能、具有促进动物生长和提高饲料转化效率的微生物制剂。在此处的定义中，显然忽略了“死菌”成分和“改善肠道酶的平衡”的功能。作为官方规定，以“严格”为好，由于死菌会给质量评定带来许多困难。由于除《微生物饲料添加剂技术通则》外，微生物饲料添加剂还没有统一的标准，因此，目前还要根据执法部门—— —农业部的《微生物饲料添加剂技术通则》来进行质量评定。 1微生态制剂产品最常见的质量问题有哪些，如何快速鉴别 1.1微生态制剂最常见的质量问题 1.1.1菌种成分标示不明、扩大功能、使用技术不明确 有些微生态制剂不标明菌种和主要成分，难以进行质量监督和检验；还有些企业任意扩大微生态制剂的作用和用途，用法与用量含糊不清或千篇一律，导致目前市场上微生态制剂产品参差不齐，用法与用量等技术内容不完善，难以确保使用的有效性。 1.1.2活菌量标示值与实际值不相符、甚至活菌很少 微生态制剂中的活菌数是阐明其质量的重要指标之一。活菌制剂在饲料加工、运输、贮存过程中容易失去活性。一些厂家的微生态产品的标示值(label claims)与实际含量(actual contents)不符，通常表现为标示值远大于保证值，即微生态制剂中能添加到饲料的中有效活菌数(指每克成品当中所含有的有效活菌数量)。在国外产品也有类似的问题，如南非的Elliot 和Teversham(2004)评价了9个从美国和欧洲进口的益生素产品，结果发现仅有5/9产品的标示值与实测值相符，3/9的产品标示的菌种与实际相符。 1.1.3杂菌污染 微生态制剂的质量鉴别与选择、 检测指标和标准 张日俊 张日俊，中国农业大学饲料生物技术实验室，动物营养学 国家重点实验室，教授，100193，北京市海淀区圆明园西路2号。 收稿日期：2010-09-27 《饲料工业》·2010年第31卷第20期专家论坛
食品微生物之檢驗方法－乳酸菌之檢驗 101年6月7日署授食字第1011902050號公告 1. 適用範圍：本方法適用於食品中乳酸菌之檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以選擇性培養基培養及計數之方法。 2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好， 儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 C FU／培養皿。 2.2. 器具及材料 2.2.1. 乾熱滅菌器。 2.2.2. 高壓滅菌釜。 2.2. 3. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。 2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0℃以內者。 2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差± 1.0℃以內者。 2.2.6. 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。 2.2.7. 天平：可稱量到2000 g ，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g ，靈敏度為5 mg。 2.2.8. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 2.2.9. 酸鹼度測定儀（pH meter）。 2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。 2.2.11. 厭氧缸（Anaerobic jar）或厭氧培養箱：適用於厭氧培養者。 2.2.12. 吸管輔助器（Pipette aid）。 2.2.1 3. 吸管（Pipette）：已滅菌。 1 m L吸管應有0.01 m L之刻度； 5 m L及10 m L吸管應有0.1 m L 刻度。 2.2.14. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm ，深度約15 mm ，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他 缺點。 2.2.15. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、99 m L及90 m L標記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点 1．生产工艺流程 A．发酵乳生产 鲜牛乳→验收→净化→标准化→杀菌→高压均质→冷却→接种发酵→纯酸奶 Ｂ．乳酵菌乳饮料生产 糖和稳定剂干粉混合→搅拌溶解→杀菌→加入山梨酸钾和甜味剂→加入酸奶→加入酸味剂→加入香精→高压均质→灌装→（杀菌）→成品 2．关键控制点 关键点①：发酵乳的制作：A．原料奶收购。刚收购鲜奶一般要求在5℃下低温保存，抑制微生物的繁殖，牛奶酸度控制在16-18，细菌总数≤200000个/ mL，芽孢总数≤10 0个/mL，耐热芽孢总数≤50个/ mL，嗜冷菌≤10 个/mL，体细胞数≤500000个/mL,密度(20℃/4℃)1.028～1.032 ，脂肪≥3.0g/100g；蛋白质≥3.0g/100g；乳糖≈4.5g～5.0g/ 100g，抗生素残留≤0.007IU/ml(0.004μg/ml)。B.原料奶热处理。对原料乳的热处理（9 0℃保持10分钟或95℃保持5分钟）主要有两个目的：杀死原料乳的致病菌和有害微生物；使原料乳中的蛋白质适度变性，增加蛋白质的持水能力，增加发酵乳的网状结构，同时还有利于发酵菌的利用。C．菌种选择．对乳酸菌饮料的发酵剂一般选择嗜热链球菌和保加利亚杆菌，通常它的比例为1：1或2：1，杆菌不能占优势，否则酸度太强．Ｄ．发酵控制．目前常用菌种最适当生长温度为42-43℃，因此在接种前后奶的温度应控制在42±1℃（在活性乳加入发酵乳的温度应低于20℃）接种温度过低会使菌种的活化时间延长，发酵缓慢而且污染杂菌的机会增加，对发酵不利，接种温度过高不但会抑制菌种的活力而且可能杀死发酵菌影响甚至终止发酵。菌种的接种量应该严格控制，接种量太大则发酵过快，不利发酵乳的风味完全形成和良好组织结构的构建，接种量太小，则发酵周期太长，污染杂菌的几率增加。一般直投式的接种量为10-20U/T，继代式菌种的接种量为2-3%。发酵过程温度和时间控制也是重要因素，在整个发酵过程中，发酵罐（发酵室）的温度都应恒定（42-43℃），温度波动太大会严重影响发酵的进程，使发酵乳的品质变差；发酵的时间也应该严格控制，时间太短，发酵风味不好，结构差；时
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
苹果汁饮料加工工艺研究 摘要：以浓缩苹果汁为原料，经过稀释、调配、护色、杀菌等重点工序处理，生产苹果汁饮料。通过正交试验，确定产品的最佳生产配方，同时比较了半胱氨酸、亚硫酸氢钠、Vc 对苹果汁饮料的护色效果。试验得出，苹果汁饮料的最佳生产配方为：柠檬酸0.15%，柠檬酸钠0.20%，单宁酸0.06%，白砂糖6%，浓缩苹果汁16%。半胱氨酸、亚硫酸氢钠、Vc 3种物质对苹果汁饮料的护色效果存在较大差异，综合考虑产品的质量安全，选择0.60%Vc为最佳护色剂。 关键词：苹果汁；饮料；配方；护色 Study on the Technology of Apple Juice Beverage Abstract:Concentrated apple juice was used as the raw material in this experiment, apple juice beverage was produced through dilution, blending, color protection, sterilization and other key processes. By using orthogonal test, the best formula of the apple juice beverage was determined, and then the color protection effects of three color protection agents Cys, NaHSO3 and Vc on the apple juice beverage were compared. The best formula of the apple juice beverage was composed of 0.20%citric acid, 0.20%sodium citrate, 0.06%tannic acid, 6%white sugar and 16%concentrated apple juice. Besides, there was a big difference among the three kinds of' color protection agents in the color protection effects on the apple juice beverage. Considering the quality safety of the product, 0.60%Vc was chosen as the best color protection agent. Key words:apple juice; beverage; formula; color protection 0 引言
微生物总数检测方法（真菌） 一、检测用培养基配方与培养条件 1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基） 配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。 2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。 二、检测与计数方法 1. 梯度稀释 称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。 2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。 3. 加样及培养 取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。 4. 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。 5. 菌落计数 以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。 有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数： nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1） 式中：
乳酸菌饮料的研究现状及展望 摘要：阐述了乳酸菌饮料的概念及其营养与保健作用及其发展的现状，指出了我国乳酸菌饮料市场存在的问题并给出了解决对策，同时预测其发展前景。 关键词：乳酸菌饮料：问题：对策； 随着我国消费饮食习惯已经从精细转变为健康、绿色，代表着健康的益生菌制品将会进一步扩大市场份额。乳酸菌饮品也不断走向成熟，新技术不断发展，迎合消费者口味和理念的新产品不断涌现。 1乳酸菌发酵饮料的概念及其保健作用 1.1乳酸菌及其代谢产物的营养与保健作用 乳酸菌是指那些能发酵糖产生大量乳酸的细菌总称。从形态上可分为球菌和杆菌。呈球形的菌有乳球菌、片球菌及明串珠菌属;呈杆状的菌有乳杆菌及双歧杆菌两个属。从发酵类型来看,可分为同化和异化两个类型。常用的菌株为乳杆菌、乳球菌及双歧杆菌属。乳酸菌的作用可分为活菌、死菌及其代谢产物两方面功能。活菌占据定居场所,抑止并排除腐败菌,其活性物质直接或间接作用于机体;死菌及其代谢产物可被机体吸收能增强机体免疫功能,促进并维持肝功能正常运转[1]。 1.2乳酸菌发酵饮料的营养和保健作用 1.2.1乳酸菌发酵饮料的营养作用 1.2.1.1蛋白质乳酸菌发酵饮料含有较丰富的蛋白质,这些蛋白质通过乳酸作用可以变成微小的凝乳,如:多肽类、胨等易被消化酶作用而被机体吸收,为机体提供能量和重新构成机体蛋白。 1.2.1.2脂肪和维生素通过乳酸菌作用可以增加发酵饮料中脂肪酸含量和维生素含量,而且脂肪酸的结构不同程度地被改变,易于消化吸收。 1.2.1.3矿物质元素发酵饮料中富含多种矿物质,如钙、钾、镁、锌、铁等。这些元素是构成机体的重要成分,同时也是维持机体正常功能的重要 物质。 1.2.2乳酸菌发酵饮料的保健作用 1.2.2.1对乳糖不耐症的治疗作用 众所周知,黄种人、黑种人肠道中的乳糖分解酶比白种人少,因此,饮用牛奶后易发生腹泻等不良反应。对于发酵饮料,由于乳酸菌可以将牛奶中20%~40%乳糖分解掉,所以喝发酵饮料不会发生 腹泻现象。 1.2.2.2降低胆固醇、抑止肾病发生 有人调查食用高胆固醇膳食的东非麻塞族人,他们同时饮用发酵饮料(酸奶),经测试其血液中胆固醇含量较低。有人用高肉食喂饲地鼠进行致肾病试验,一组用高肉食饲喂,另一组是高肉加酸奶饲喂进行对比,结果是高肉食组地鼠致肾病,而加酸奶饲喂组的地鼠血液中胆固醇、尿素氮和肌酸酐都降低,可抑制肾病发生[2]。 1.2.2.3抑菌和抗感染 乳酸菌产生的乳酸和醋酸具有杀菌作用,有些菌种如嗜酸杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌还能产生H2O2,抑制葡萄球菌生长;此外有些菌种还可产生抗菌素,对沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌等均有拮抗作用[3]。
果汁悬浮饮料的技术难点及稳定性探讨果汁悬浮饮料常见的问题及造成原因 果汁饮料的悬浮性问题一直是困扰饮料生产的技术难题。在果汁饮料中，既有果肉微粒形成的悬浮物，又有果胶、蛋白质等形成的真溶液，甚至还有脂类物质形成的乳浊液、悬浮物。 乳浊液的微粒与饮料汁液之间存在较大的密度差，这是不稳定的主要原因。理想的果汁悬浮饮料其外观应该是： 汁液澄清，果粒悬浮均匀或果肉混合均匀，无明显分层现象。果汁饮料易出现的不稳定现象主要包括： 分层（creaming）、沉淀（sediment）和絮凝（flocculation0。 目前许多厂家的果汁悬浮饮料的稳定性较差，原因有多方面。从原料上应该注意生产上每批原料来源应进料保持一致，原料榨汁工艺如果处理不好，会造成粗纤维含量较高，易引起沉淀。带果粒和果肉的果汁保持均一的质地很重要，要使悬浮物稳定，就要使其沉降速度尽可能降至零。悬浮物的下沉速度遵循斯托克斯公式： V＝2gr2（ρ1－ρ2）/9η V——沉降速度； g——重力加速度； r——悬浮物颗粒半径； ρ1——悬浮颗粒密度； ρ2——分散介质的密度； η——分散介质粘度 从斯托克斯公式可以看出，饮料配方中的糖度很关键，因为在整个分散介质体系中，天然的果汁与悬浮物的密度（ρ1）很大，只有人为地添加糖分（一
般为蔗糖）才能增加分散体系的密度（ρ2），从而减少分散体系与悬浮物之间的密度差。在实际生产中，果汁的糖度一般控制在10～12°Brix之间，对于含有果肉和果粒的悬浮饮料来说，在此糖度下还不足以悬浮住密度较大的悬浮物，因此需添加适量的稳定剂起到增稠和悬浮稳定效果。在大多数情况下，由于稳定剂的使用量和复配比例不当很容易造成产品在货架期内出现分层和沉淀，因此选择和使用好的稳定剂并掌握合适的复配比例是影响果肉悬浮效果的关键。 悬浮稳定剂选择的关键点以及方案 以上提到了影响悬浮稳定性的几方面因素，在开发产品的过程中，除了考虑产品的稳定性之外，还必须兼顾口感。在添加稳定剂的同时不能使体系过于稠厚而牺牲口感。一个稳定体系的果汁饮料还应该做到口感饱满而清爽，不粘口，风味自然。目前果汁产品的pH值大多为 3.6～ 3.8之间，糖度在10～12°Brix之间，总酸为2～3g／L（以一水柠檬酸计）之间。因此在选择稳定剂时应充分考虑果汁PH体系范围，并结合果汁和悬浮果粒和果肉的添加量，果肉粒度大小来选择合适的胶体，尽量做到既能体系稳定而又口感清爽。 果汁饮料中最常用的悬浮稳定剂有： 羧甲基纤维素钠（CMC）、藻酸丙二醇酯（PGA）、黄原胶、果胶、瓜尔豆胶、琼脂，以及近年来崭露头角的结冷胶。在胶体的使用方面，一般采用复配胶比用单一胶的效果好能够充分发挥不同胶体的协同增效作用。 笔者在长期的研究和应用过程中发现，由于价格因素，在实际生产中，悬浮体系中应用最为广泛的应该是CM C、xx胶、瓜尔豆胶及xx，而PG A、果胶以及结冷胶虽然悬浮效果明显但价格较高，因此较少单独使用，一般都与其他胶体复配使用。黄原胶具有较高的粘度，较大的热稳定性和耐酸性，与多种稳定剂有良好的兼容性，黄原胶的假塑性使其运用于果汁饮料中不会产生粘质基胶质感，是广泛采用的悬浮和增稠的胶体。瓜尔豆胶本身不具有
河北世翔生物有限公司 乳酸菌检验方法 前言 1.本检验方法针对公司各种形式（固态、液态）的乳酸菌菌微生物添加剂； 2.本标准的制定依据GBT 23181-2008 、SNT 1941.1-2007、GB 478935-2010等 国家标准制定； 3.本标准由研发部起草，经公司总经理批准，公布之日起实施。 一、检验前的准备 1.培养基及其试剂 1.1盛有若干玻璃珠的无菌水225ml， 1.2MRS琼脂培养基： 牛肉膏10g 蛋白胨10g 酵母膏5g 121℃，灭菌15-20min 1.3培养皿12个，试管12个，涂布棒1个，用报纸包扎后灭菌 1.4打开超净工作台，用消毒水或者酒精喷洒，工作台台面，打开紫外灯杀菌30分钟，打开风机，5分钟后，打开照明 二、取样 按照GB/T14699.1进行取样：用灭菌的铲子，选取有代表性的样品适量放入取样袋中，标注好取样日期，批次备用；液体取样使用灭菌的试管，在火焰保护下进行，完成后放入低温冰箱储藏。
三、检测步骤 1. 以无菌操作称取试样25g（ml），加入225ml有玻璃珠的无菌水中，放在摇床上，200r/min，摇动30min，制成1：10的初始菌悬浮液。取1：10的初始菌悬浮液0.5ml，加入4.5ml无菌水，经充分混匀后，制成1：100的稀释液。依次方法依次稀释到1：108 2.选择107 、108 二个稀释度，用移液枪分别吸取0.1ml，接种到3个营养琼脂平板上，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘，涂布好的平皿改好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置于36±1℃培养箱中培养48±2h。从样品稀释到涂布完成要求在15分钟内完成。 3.培养后，选取菌落数在30到300个之间的平板计数，低于30 CFU 平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜计数；若片状菌落步不到平板的一半，而其余一半分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 四、计数 1.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。 2.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算
成都市佳味添成饮料科技研究所是中国饮料产品设计整体方案，提供以饮料配方研发为核心的整体方案服务，服务内容包括食品饮料技术研究，食品饮料产品开发，食品饮料技术咨询、指导、转让等一站式饮料项目服务。作为专业的饮料配方研发公司，提供饮料配方研发,饮料配方调味,饮料配方技术,饮料配方专家咨询，饮料配方生产技术指导等饮料行业所需的各类技术和资源； 蓝莓果实呈蓝色，近圆形，单果重0.5-2.5g，最大可达3.5-5.0g，果肉细腻，种子极小，甜酸适度，且具有香爽宜人的香气，可鲜食，也可加工成果汁饮料、果酒饮品、蓝莓果实营养丰富，据我国对从美国引进的十四个品种的蓝莓果实分析测定，每百克蓝莓鲜果中含蛋白质400-700mg、脂肪500-600mg、碳水化合物12.3-153mg、维生素A高达81-100国际单位、维生素E2.7-9.5ug，维生素都高于其它水果。微生元素也很高，每克鲜果中220-920ug，磷98-274ug，镁114-249ug，锌2.1-4.3ug，铁7.6-30.0ug，锗0.8-1.2ug，铜2.0-3.2ug。据最近研究，蓝莓果具有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等独特功效。因此，国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之-。而且医学上已经证明蓝莓所含有的花青试类物质对眼睛的作用很显著，有恢复视力，减少疲劳的功用，并在欧洲被制成保健药品，其效果得到了普遍承认。现在随着生活水平的提高，人们也越来越重视饮食的营养和保健，而乳酸菌饮料是目前国内市场上一种十分畅销的健康饮料，深受广大消费者的喜爱。本研究开发的蓝毒乳酸菌饮料就是为了满足消费者的要求，从生产实践出发而开发设计出来的。 工艺要求 1.对蓝莓乳酸菌饮料采用二次杀菌的工艺，目的是为了能彻底杀死牛奶和果汁中的芽孢杆菌，防止变质， 2.稳定剂研磨温度最好控制在60-70℃，要充分溶解化开，不存在凝块.， 3.为保证产品的风味，酸奶要采用一次性菌种发酵之酸牛奶，无凝块，酸度85-95 4.蓝莓果汁应经过胶体磨研磨，使之状态均匀，并过滤除去果汁中所含的粗纤维 5.配料，定容完成后，可溶性固形物含量用折光计测出为13-14%，PH值为4.0-4.2。 6.将物料预热至60-70℃均质，均质压力180-200BAR，然后用板式杀菌机杀菌，温度70-95℃，并迅速冷却到2-8℃暂存，等候灌装。 7.用荷兰生产的STORK超高温灭菌设备灭菌.温度为“135±1℃，冷却至20-30℃后，用德国制造的康美无菌灌装机无菌灌装。 总结 通过分析和实验得出蓝莓果汁奶的最佳配方是:发酵酸牛奶35%，白砂糖7%，蓝莓汁6%，稳定剂0.5%，柠檬酸0.05%，蓝莓香精0.08%。 产品经过检验.营养成分符合国家标准的规定，微生物指标达到商业无菌的标准.成品在常温下可保存9个月而不变质。 本文只采取了饮料配方及工艺研究中的某部分研究内容，如需得到完整的配方及工艺流程可联系成都市佳味添成饮料科技研究所
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
有机肥料的国家标准及各个指标的检测方法 简介：本文介绍了生物有机肥肥料的国家标准，以及各个指标的检测方法。具体包括：有效活菌数，有机质，水分，PH，粪类大肠菌群数，蛔虫卵死亡率，N，P5O2，K2O,重金属等指标的测定方法和流程。可供同行人士参考，可大大缩减您查阅资料的时间，本文采用word文字编辑，下载后可以直接复制粘贴。一．各个指标的标准 1.各个技术指标 项目指标要求 有效活菌数≧0.2亿/g 有机质（以干计）≧45% 水分≦30% PH 5.5-8.5 粪大肠菌群数≦100个/g 蛔虫卵死亡率≧95% ≧5% 总养分质量分数（N+P5O2+K2O，以烘干 计） 2.重金属指标 项目指标要求 总AS ≦15mg/kg 总Cd ≦3mg/kg 总Pb ≦50mg/kg 总Cr ≦150mg/kg 总Hg ≦2mg/kg 二．各个指标检测方法 1.有效活菌数的测定 （1）稀释 称取固体样品10g，加入带玻璃珠的100ml的无菌水中，静置20分钟，在旋转式摇床上200r/min充分震荡30分钟，即成母液菌悬液。 用5ml无菌转液管分别吸取5ml上述母液菌悬液加入45ml无菌水中，按1
比10进行系列稀释，分别得到10-1,10-2,10-3、、、稀释倍数的菌悬液。 （2）加样及培养 每个样品取3个连续适宜稀释度，用0.5ml无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1ml，加至预先制备好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂布于琼脂表面。 每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于适宜的条件下培养。 （3）菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应该重做。 （4）菌落计数 以出现20-30个菌落数的稀释度的平板为计数标准，（丝状真菌为10-150个菌落数），分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度，其有效菌平均菌落数在20-300个之间时，则以该菌落数计算。若有两个稀释度，其有效菌落数在20-300个之间时，应该两者菌落总数之比值决定，若其比值小于等于2应该计算两者的平均数；若大于2，则以稀释度小的菌落数平均数计算。有效活菌数按下列公式计算，同事计算杂菌数。 N1=(x*k*v1/m0*v2)*108 N2=(x`*k*v1/v0*v2)*108 式中： N1——————质量有效活菌数，单位为亿每克； N2——————体积有效活菌数，单位为亿每毫升； x·——————有效菌落平均数； K———————稀释倍数； V1———————基础液体积，单位为毫升； V2———————菌悬液加入量，单位为毫升； V0———————样品量，单位为毫升； M0———————样品量，单位为克。 2.有机质的测定 (1)方法原理 用定量的重铬酸钾-硫酸溶液，在加热条件下，使有机肥料中的有机碳氧化，
饮料工艺学课程论文果蔬汁饮料的研究现状及发展趋势 姓名： 学号： 班级： 成绩：
果蔬汁饮料的研究现状和发展趋势 摘要：我国是水果和蔬菜生产大国，产量均居世界第一位。发展果蔬汁产业可以提高果蔬的附加值，具有明显的经济和社会效益。近年来，我国果蔬汁的加工技术取得了一定的进步。介绍了近年果蔬汁饮料加工领域的新技术，以及果蔬加工的发展方向。 关键词：果蔬汁；加工技术；发展方向 引言： 果蔬GB10789—1996 指出，用新鲜或冷藏水果为原料，经加工制成的制品称为果汁（浆）及果汁饮料（品）类产品，主要分为果汁、果浆、浓缩果汁、浓缩果浆、果肉饮料、果汁饮料、果粒果汁饮料、水果饮料浓浆及水果饮料；蔬菜汁及蔬菜汁饮料的定义则是以新鲜或冷藏蔬菜（包括可食的根、茎、叶、花、果实，食用菌，食用藻类及蕨类）等原料，用机械方法将蔬菜加工，在制得的汁液中加入食盐或白砂糖等调制而成的制品，可分为蔬菜汁饮料、复合果蔬汁和发酵果蔬汁饮料3 类 1据美国全球行业分析公司（Global Industry Ana-lysts，Inc）. 的报道，由于消费者的健康和营养意识增强，全球果蔬汁消费持续增长，预计到2010 年全球果蔬汁消费量将达到530×108L。北美和欧盟将是果蔬汁主要消费市场，占全球消费总量的60%，但增幅最大的消费市场将在亚太地区。在众多饮料品种中果蔬汁成为最有竞争力的种类之一 2 20 世纪80 年代初、中期，水果饮料浓浆是果汁类饮料的唯一产品。80 年代末90 年代初，以山楂为原料的“果茶”果肉饮料在我国的河北省、天津市辽宁省和河南省等地迅猛发展，全国有几十家企业在生产“果茶”。90 年代中期，以芒果汁为主，菠萝汁为辅的果肉饮料、混合果汁饮料成为饮料的热点 3我国蔬菜汁的发展是与果汁同时起步的，20 世纪80年代对番茄汁、胡萝卜汁及白菜汁等蔬菜汁的加工工艺进行了探索性的研究工作。到了90 年代，开始用酶法澄清、酶法液化和超滤等加工技术，对胡萝卜、冬瓜、萝卜、南瓜、芹菜、大蒜等清汁、混汁和复合汁进行工艺研究。现已形成果蔬、根茎菜、绿叶菜为主要原料的蔬菜汁、蔬菜浓缩浆、特种蔬菜饮料等 3 个系列产品的雏形体系 4由于果蔬汁产业具有明显的经济效益和社会效益，国家在“十五”，“十一五”科技攻关重大专项和国家863 项目中，专门设置了果蔬汁加工的课题。例如：苹果深加工关键技术与设备的研究开发；蔬菜汁产业化关键工艺技术研究与产品开发；优质鲜榨苹果汁和浑浊型苹果汁加工关键技术与产业化开发；浓缩果汁质量控制1果蔬饮料研制、生产及市场销售现状 1果蔬饮料的分类、代表性产品种类 1.1含碳酸气果汁饮料 主要品种有柑橘、柠檬、杨梅、樱桃、香蕉、沙棘、猕猴桃、刺梨、醋栗等作原
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
乳酸菌饮料的生产工艺及关键控制点 1．生产工艺流程? 2．A．发酵乳生产? 3．鲜牛乳→验收→净化→标准化→杀菌→高压均质→冷却→接种发酵→纯酸奶? 4．Ｂ．乳酵菌乳饮料生产? 5．糖和稳定剂干粉混合→搅拌溶解→杀菌→加入山梨酸钾和甜味剂→加入酸奶→加入酸味剂→加入香精→高压均质→灌装→（杀菌）→成品? 6．2．关键控制点? 7．关键点①：发酵乳的制作：A．原料奶收购。刚收购鲜奶一般要求在5℃下低温保存，抑制微生物的繁殖，牛奶酸度控制在16-18，细菌总数≤200000个/ mL，芽孢总数≤100个 /mL，耐热芽孢总数≤50个/ mL，嗜冷菌≤10 个/mL，体细胞数≤500000个/mL,密度(20℃/4℃)1. 028～1.032 ，脂肪≥3.0g/100g；蛋白质≥3.0g/100g；乳糖≈4.5g～ 5.0g/100g，抗生素残留≤0.007IU/ml(0.004μg/ml)。B.原料奶热处 理。对原料乳的热处理（90℃保持10分钟或95℃保持5分钟）主要有两个目的：杀死原料乳的致病菌和有害微生物；使原料乳中的蛋白质适度变性，增加蛋白质的持水能力，增加发酵乳的网状结构，同时还有利于发酵菌的利用。C．菌种选择．对乳酸菌饮料的发酵剂一般选择嗜热链球菌和保加利亚杆菌，通常它的比例为1：1或2：1，杆菌
不能占优势，否则酸度太强．Ｄ．发酵控制．目前常用菌种最适当生长温度为42-43℃，因此在接种前后奶的温度应控制在42±1℃（在活性乳加入发酵乳的温度应低于20℃）接种温度过低会使菌种的活化时间延长，发酵缓慢而且污染杂菌的机会增加，对发酵不利，接种温度过高不但会抑制菌种的活力而且可能杀死发酵菌影响甚至终止发酵。 菌种的接种量应该严格控制，接种量太大则发酵过快，不利发酵乳的风味完全形成和良好组织结构的构建，接种量太小，则发酵周期太长，污染杂菌的几率增加。一般直投式的接种量为10-20U/T，继代式菌种的接种量为2-3%。发酵过程温度和时间控制也是重要因素，在整个发酵过程中，发酵罐（发酵室）的温度都应恒定（42-43℃），温度波动太大会严重影响发酵的进程，使发酵乳的品质变差；发酵的时间也应该严格控制，时间太短，发酵风味不好，结构差；时间太长则酸度太高，口感不好。一般要求直投式菌种发酵时间在3.5-6小时，继代式菌种的发酵时间稍短，一般在2.5-4小时，严格控制确保每次发酵乳品质一致性。 关键点②：稳定剂选择及溶解。A．稳定剂的选择。稳定剂是影响乳制品品质的重要因素，由于在酸性环境下，乳制品本身处于不稳定的状态，乳酸菌饮料易出现水析及沉淀，甚至水乳分层现象，因此对稳定剂的稳定效果有更大的依赖性，要求稳定剂有很好的稳定作用。单体胶（果胶、PGA、CMC）单独使用时对乳酸菌饮料稳定作用不是很理想，一般复配使用。Ｂ．稳定剂的溶解。由于乳酸菌饮料的稳定剂是以胶体为主，而且一般添加量较大，因此若直接加到水中容易吸水形成胶团，难以溶