第34卷 第1期 湖 北 畜 牧 兽 医 Vol.34 No.01
2013年 01月 Hubei Journal of Animal and Veterinary Sciences January 2013
收稿日期：2012-11-15
作者简介：陈燕凌（1984－），女，四川宜宾人，兽医师，硕士，主要从事重大动物疫病防控、监测及诊断工作，（电话）153********
（电子信箱）38208956@https://www.doczj.com/doc/0312692542.html,。
猪圆环病毒２型ORF2基因及其编码蛋白的研究概况
陈燕凌1 ，王颖旺2 ，黄 恒3 ，金仕强1，赵 玲4 ，徐 凯5
（1.四川省宜宾市畜牧兽医局，四川 宜宾 644000；2.四川省宜宾市翠屏区农牧局，四川 宜宾 644000
3.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 404100；
4.四川省洪雅县畜牧兽医局，四川 洪雅
620340；5.四川省内江市畜牧局，四川 内江 641000）
摘 要：结合国内外对猪圆环病毒２型（p ｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ２，ＰＣＶ２）的研究，重点对猪圆环病毒２型ＯＲＦ２基因及其编码蛋白的抗原表位和功能应用研究进行简要综述，为猪圆环病毒２型新型疫苗研究和建立诊断检测方法研究方面提供参考。
关键词：猪圆环病毒；ＯＲＦ２ 基因；抗原表位
中图分类号：Ｓ858.28 文献标识码：B 文章编号：1007-273X （2013）01-0078-04
猪圆环病毒２型(Porcine circovirus 2，PCV2) ，是引起猪断奶后衰竭综合征(Postweaning multisystemic Wasting Syndrome，PMWS )的主要病原之一。该病毒基因组为单股环状负链ＤＮＡ 分子，有１１个开放阅读框（ORF） ，ORF2 编码病毒的结构蛋白－衣壳蛋白，具有较好的免疫基因原性，可以刺激机体产生抗体。现将PCV2 ORF 2基因及其编码蛋白的研究概况做一综述，以供参考。
1 结构蛋白及抗原表位研究
在PCV2 中，ORF2起始密码子起始于第１ ０３３ 或１ ０３４ 位核苷酸，共有７０２ 个碱基，编码２３４ 个氨基酸（基因序列反义链上ORF2终止子由TAA 变为AAG，而造成ORF2阅读框加长，全长705bp，其终止子为TGA），编码的衣壳蛋白为病毒主要结构蛋白（Cap 蛋白），相对分子质量为30 000，具有较好的免疫原性，ORF2蛋白可以自我装配成病毒衣壳颗粒，且两种病毒之间的同源性达到67%。PCV 两种基因型的Cap 蛋白上存在共同的抗原表位，但两者无抗原交叉性，推测原因是整个Cap 蛋白遮盖了它们共同的抗原表位。在PCV1-Cap 蛋白上的102~104位氨基酸(NYS)上和PCV2的143~145位氨基酸(NYS)上都有单一的糖基
化表位存在[3]。Liu 等[4]
将ORF2基因连接到MBP-His(8)-tag 基因的3'端，在细菌中表达ORF2融合蛋白，该融合蛋白可被抗PCV2多克隆抗体和PCV2感染猪的血清识别，表明ORF2蛋白与PCV2的免疫反应
性有关。融合蛋白纯化后，经电镜负染观察可见病毒粒子样的颗粒，颗粒密度比PCV2病毒粒子的密度要低，但形态与病毒粒子相似，直径约为17nm。
研究表明，ORF2基因编码的N 端41个氨基酸为核定位信号，不包含主要的抗原区域，而且N 端具有大肠杆菌稀有密码子（约占30），以AGGAGG，AGAAGG
等串联形式存在影响外源蛋白的表达[5]
。Lekcharoensuk 等[5]
使用PCV2全病毒研制了7种不同的抗PCV2衣壳蛋白的单克隆抗体，通过对PCV2 ORF2的基因序列分析，克隆PCV1相同位点基因片段进行置换，构建了不同的PCV1/PCV2-ORF2嵌合体。通过ELISA 试验，用各种单克隆抗体对不同的嵌合体进行识别，在ORF2的第47~63、165~200以及C 端最后4个氨基酸具有至
少5个重叠的B 淋巴细胞抗原表位。刘光清等[6]
以PCV2基因组序列为材料，采用Garnier-Robson 方法、Chou-Farplus 方法和Karplus-Schulz 方法预测了其结构蛋白的二级结构；采用Kyte-Doolittle 方法对结构蛋白的亲水性进行了分析，采用Emini 方法预测了结构蛋白的表面可能性，采用Jameson-Wolf 方法预测了蛋白的抗原指数，综合评价了PCV-2型结构蛋白的B 淋巴细胞抗原表位。结果表明，PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力弱，但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构，即具有丰富的二级结构。结构蛋白中具有多处抗原指数较高的区段，其中羧基端含有潜在的Ｂ淋巴细胞优势抗原表位，为猪圆环病毒的反向疫苗学的
第1期 陈燕凌等：猪圆环病毒２型ＯＲＦ２基因及其编码蛋白的研究概况 79
Ju等[9]将PCV2 ORF1-ORF2融合蛋白构建到伪狂
犬病毒TK-/gE-/LacZ+致弱株，构建了新的重组病毒PRV-PCV。结果表明，新构建的重组病毒PRV-PCV 能够诱导强烈的体液免疫，产生抗PRV抗体和抗PCV2抗体，并且能够诱导产生强烈的细胞免疫。Wang等[10]克隆了PCV2 Cap蛋白基因，并将Cap蛋白基因插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，将其与腺病毒骨架载体（pAdeasy-1）共转化至大肠杆菌BJ5183，进行同源重组后转染293T细胞，在293T细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Westernblot检测证明PCV2 Cap蛋白基因在293T细胞内获得表达。Gillespie[11]用非致病的PCV1衣壳蛋白替换了PCV2的衣壳蛋白，研制了抗PCV2的疫苗，将其命名为PCV1-2嵌合体。将其衣壳蛋白的第79位氨基酸突变作为示踪标记，通过体外细胞传代和动物体内传代试验对新构建的PCV1-2嵌合体病毒的遗传稳定性进行研究，结果表明，PCV1-2嵌合体病毒具有很好的遗传稳定性。PCV1-2嵌合病毒有望发展成为一种基因工程弱毒活疫苗而用于PCV2感染的防制。徐志文等[12]将包含有完整阅读框架，长分别为1 740、705bp的PPV VP2基因、PCV2 ORF2基因分别插入真核表达载体pPI‐2‐EGFP，构建了重组质粒pPI‐2‐EGFP‐VP2‐ORF2将重组质粒转染入Vero细胞，在转染后20 h左右出现荧光，36 h达到高峰；对转染细胞进行电镜检测，观察到病毒样颗粒存在。将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪，检测其血液中T淋巴细胞的动态变化和血清抗体水平。结果免疫仔猪的CD3+、CD4+ T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高；CD8+T淋巴细胞在免疫后7~14 d有所下降，之后再升高。抗体检测结果表明，免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体。结果表明，重组质粒pPI‐2‐EGFP‐VP2‐ORF2成功表达并形成重组病毒样颗粒，且该颗粒具有良好的免疫原性。笔者将PCV2结构蛋白的B淋巴细胞表位区（47~85aa）连入PPV VP2的N端，克隆到真核表达载体pCI-neo中，构建了重组质粒pCI-ORF2-VP2，并将重组质粒转染至Vero细胞，利用间接免疫荧光试验证明了该质粒能够在体外表达。在无免疫佐剂的情况下将重组质粒pCI-ORF2-VP2免疫小鼠，发现其能够诱导机体产生高效价的PPV/PCV2 IgG抗体，产生的抗体效价显著高于灭活疫苗免疫组；并且重组质粒免疫组能够产生高于对照组的细胞免疫和体液免疫反应[13]。这些结果都为PCV2基因工程亚单位疫苗的研究提供了依据。
研究提供了一定的理论依据。Stevenson等[7]对PCV2 ORF1、ORF2、ORF3进行了T淋巴细胞抗原表位分析，分别构建了20个线性的重叠交错抗原表位表达系统，通过免疫猪后对抗原表位免疫显性的初筛以及进一步的选择，证明了在ORF1的氨基酸残基第81~100位和201~220位，以及ORF3氨基酸残基31~50位存在重叠的T淋巴细胞抗原表位。而在ORF2上没有线性的Ｔ淋巴细胞抗原表位，这可能是因为Ｔ淋巴细胞反应和核衣壳蛋白的构象有关。
2 ORF2蛋白的功能研究
2.1 疫苗研究
有研究表明，PCV2 ORF2某些基因与病毒的毒力和复制有关。Fenaux等[8]将圆环病毒2型在PK-15上连续传代120次，同时收集不同代次的病毒1，对其进行生物学，遗传学以及试验特性分析。VP120（120代病毒）位于衣壳蛋白基因的两处核苷酸发生突变。以PCV2 VP1、VP120的半数感染量分别用滴鼻和肌肉注射方式感染试验猪，并设生理盐水对照。结果表明，VP120更大的感染量和更强的病理损害。此结果反应
了猪圆环病毒2型的衣壳蛋白第P110A位和R191S位突变，不仅会增强病毒在体外的生长力，且会减弱病毒的致病力，这为PCV2疫苗的研制提供了重要依据。
王新等[14]将构建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗，按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠,同时设pcDNA-3.1(+)，PCV2全毒和PBS为对照，共免疫2次，间隔2周。分别于首免后第14天和56天采血，用ELISA法检测抗体；第56天采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）和流式细胞仪（FACS）对小鼠的细胞免疫进行检测；第56天取小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑等实质器官，采用PCR方法检测pcDNA-ORF2核酸疫苗的安全性。结果表明，pcDNA-ORF2核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫应答。PCV2 ORF2基因未整合到小鼠染色体上，证明了pcDNA-ORF2可诱导小鼠产生免疫反应，其对小鼠是安全的，并且为ORF2核酸疫苗的研究奠定了基础。
另外有学者对PCV2新型口服疫苗进行了研究。Wang等[15]将PCV2去除信号肽的Cap基因载体构建到大肠杆菌和乳酸乳球菌 E. coli/L. lactis穿梭载体pSEC-LEISS中，通过Westernblot分析证明了能够在胞内和胞外正确表达，将构建好表达PCV2的菌株培养后，口服灌胃小鼠，发现在小鼠血清中能够检测出高水平的PCV2的IgG。
2.2 诊断方法研究
有关研究证实PCV2 ORF2基因可以用以区别鉴定PCV1和PCV2。因此，PCV2 ORF2基因广泛应用于临床诊断。PCR作为一种高特异性、高敏感性的检测方法被广泛的应用于PCV病原的检测。PCR方法最初由Larochelle等[16]和Ouardani等[17]根据PCV1和PCV2的ORF2的DNA序列分别设计两对PCR引物，建立了多
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重PCR的方法，可以同时检测PCVl和PCV2。Kim等[18]建立了检测和区分PCV1和PCV2的多重巢式PCR方法。Huang等[19]利用多重ＰＣＲ鉴别诊断猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒１型、猪圆环病毒２型、猪细小病毒。
PCV2 ORF2编码的衣壳蛋白与病毒的抗原性有关，可作为诊断的工具，在此基础上建立的间接ELISA 方法可用于检测PCV2抗体，国内外学者对此进行了深入研究。Blanchard等[20]以GST-ORF2融合蛋白作为抗原，采用ELISA方法从322个感染PCV1、PCV2以及其他猪病毒的血清样品中成功检测出PCV2，且敏感性和特异性分别高达98.2%和94.5%。Walker等[21]以分离的PCV2细胞培养物作为抗原，PCV2特异性单抗作为竞争性反应物，建立竞争ELISA，其敏感性和特异性达到99.58%和97.14%，这种方法可用于大规模的快速诊断PCV2。Nawagignl等[22]用细胞培养增殖的PCV2病毒作为抗原建立PCV2-ELISA和重组的衣壳蛋白为抗原建立ORF2-ELISA分别用于检测PCV2和衣壳蛋白的抗体。高超[24]将猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达质粒pET-ORF2s的BL21菌进行诱导表达并纯化重组蛋白包涵体，Western-blot检测纯化蛋白，将其作为抗原包被酶标板，优化间接ELISA条件，建立了检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。这些研究为建立PCV2检测检测方法提供了重要依据。
3 小结
猪圆环病毒病是一种免疫抑制疾病，病毒感染可导致动物的免疫系统损伤，进而使其遭受其他病原的并发感染，给养猪业带来巨大经济损失。PCV2 ORF2基因编码病毒主要结构Cap蛋白，并且可以自主组装成病毒原颗粒，具有免疫原性，可刺激机体产生抗体。近年来，国内外对ORF2基因及其编码蛋白进行了大量的研究，研究者利用原核、真核表达系统成功表达出ORF2基因，将ORF2的免疫原性应用到了PCV2的疫苗和ELISA的包被抗原研制上。而对ORF2基因抗原表位研究将会成为PCV2基因疫苗的又一研究方向。参考文献:
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○市场信息○
阿根廷转基因奶牛能产人乳
科学家表示，世界上第一头加入两个人类基因的奶牛—罗西塔ISA产出的牛奶将非常类似于人乳，其中含有抗菌抗病毒成分，能够大大提高婴儿的免疫力。
参与该研究项目的阿根廷科学家阿德里安·穆托说，罗西塔ISA产的牛奶将类似于人乳，这是奶制品营养领域的重大进步。罗西塔ISA是阿根廷圣马丁国立大学和农牧业技术部门共同培育的产品。穆托说，“转基因动物在世界其他地方也有，但两个基因是分开植入的，我们的技术优势在于实现了一次植入就能产生两个基因”。穆托表示，培育罗西塔ISA的目的是通过加入人类基因提高牛奶的营养价值。10个月后罗西塔ISA 开始产奶时，其牛奶中将含有人乳铁蛋白和溶菌酶成分，这是经转基因加入的一种蛋白和酶，能大大提高婴儿的免疫力。
溶菌酶是一种在牛奶中并不存在但在人乳中含量很高的酶，而乳铁蛋白在所有哺乳纲动物中都存在，其作用是吸收铁元素并把它加入到血液中，但是每种动物的乳铁蛋白都不一样，因此牛乳铁蛋白在人体中不易被吸收。乳铁蛋白还有促进牙齿生长、肠细胞成熟以及抗菌、抗病毒等作用。阿根廷科学家成功地将两个人类基因转移到牛基因组的一个位置，从而使这两种蛋白都能在牛哺乳期的乳腺中得到表达。
克隆牛罗西塔ISA属于优质种牛，2012年4月6日经剖腹产出生，体重45kg，是普通小牛犊体重的两倍。研究人员认为，它的出生为未来培育更好的奶牛开辟了美好的前景。
人类基因被植入到罗西塔ISA的DNA中，因此它的卵巢中也会带有这些基因。以后罗西塔ISA受孕后产仔，其幼仔带有相同转基因的可能性至少为50%。
（来源：中国畜牧业信息网）