中国药科大学
本科毕业论文
论文题目人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究
英文题目 Research on Preparation of Human Parathyroid Hormone Fragment Analogue 专业生物技术
院部生命科学与技术学院
学号 0342223
姓名罗娜
指导教师李泰明
课题
完成场所中国药科大学酶工程实验室
论文工作时间：年月至年月
目录
摘要 (1)
前言 (2)
第一章实验原理 (3)
1.1 (3)
1.2 (3)
第二章试剂与仪器 (4)
2.1试剂 (4)
2.2仪器 (4)
第三章实验方法 (5)
3.1 XXXXXXXX (5)
3.2 XXXXXX (5)
第四章实验结果 (6)
4.1 XXXXX (6)
4.2 XXXXXXX (6)
4.3 XXXXXXXXX (6)
第五章讨论.....................................................................参考文献 (7)
致谢 (9)
0342223 罗娜
摘要：目的提高人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro的分离纯化效率。方法①通过均匀设计法寻求目的融合蛋白的酸水解条件（温度、时间、蛋白含量，盐酸浓度）；进行二次酸水解。②使用核酸蛋白检测仪及紫外可见分光光度计检测210nm，280nm处吸收峰，收集样品峰，对比含量及纯度差异，确定最佳检测波长。结果①酸水解最佳条件没有得到改进；②检测波长设在210nm比设在280nm更灵敏、更可靠。结论①二次酸水解可提高水解效率；②检测波长设在210nm处可提高分离纯化效率。
关键词：人甲状旁腺素，活性片段前体物；骨质疏松；纯化；酸水解；柱层析
Research on preparation of human parathyroid
Hormone fragment analogue
Abstract：Objective To improve the separation and purification rate of human parathyroid hormone fragment analogue Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro. Methods ①To seek the conditions for acid hydrolysis of target fusion protein through uniform design；to carry out acid hydrolysis for a second time. ②To detect the assimilation peak and the sample collecting peak at 210nm and 280nm with the nucleic acid protein surveymeter and the ultraviolet visible light photometer，and to contrast the differences in contents and purity to make sure the best wavelength. Results ①No progress was made in seeking the best conditions of acid hydrolysis; ②Set up the detecting wavelength at 210nm was more sensitive and credible then at 280nm. Conclusions ①Carrying out acid hydrolysis for a second time can improve the efficiency of hydrolysis; ②Setting up the detecting wavelength at 210nm can improve the
separation and purification rate.
Keywords：human parathyroid hormone; active fragment analogue; osteoporosis;
purification; hydrochloric acid; column chromatography
前言
一、骨质疏松症以及研究开发甲状旁腺激素相关肽的重大意义
骨质疏松是一个涉及多学科的公众健康问题。它是指每个单位内骨组织数量减少。分为继发性骨质疏松和原发性骨质疏松，前者最常见有类固醇性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松等，后者主要包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。
原发性骨质疏松是以骨质减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。判断骨质疏松症的依据为：骨量减少；骨微结构蜕变；骨的脆性增高、骨力学强度下降、骨折危险性增加，对载荷承受力降低而易于发生微细骨折或完全骨折。造成骨质疏松的原因有：绝经后和老年性骨质疏松；遗传性骨质疏松；内分泌疾患所致骨质疏松；与饮食有关的骨质疏松；药物所致骨质疏松；废用性骨质疏松；其它疾病所致骨质疏松；特发性骨质疏松[1]。
现今骨质疏松症已成为严重威胁老年人身心健康的常见疾病，根据中国老年学学会骨质疏松学会统计，目前骨质疏松症患者人数在我国已达到8千万，已经构成一个严重的公众健康问题。随着人均寿命的延长，老年性骨质疏松症发病率逐年增加。
同时骨质疏松症也特别“垂青”女性，在胎儿期，孩子从母体不断地吸收大量钙质，以保障骨骼的正常发育。授乳期，孩子通过母亲的乳汁得到赖以生长的钙。这时期的孕妇或授乳期母亲必须有意识地多摄取一些钙质，才能满足孩子和自身的需求。否则，不足部分便会有母亲的骨组织中溶出。在绝经期，妇女也受到骨质疏松的困扰。对于正常人，性
激素对骨组织合成的促进作用和肾上腺皮质激素对骨形成的拮抗作用处于动态平衡。当性激素水平下降，而肾上腺功能并无相应程度降低，结果造成糖皮质激素相对增多，产生类似柯兴氏综合症的表现，使骨吸收大于骨形成。雌激素具有刺激成骨细胞活性促进骨基质合成的作用。雌激素缺乏不仅影响妇女的生活，更可能引发两种由于雌激素缺乏造成的疾患：心血管疾病和骨质疏松。骨质疏松造成妇女在一生中发生髋骨骨折的危险性高于其患乳腺癌、宫颈癌、子宫癌和卵巢癌危险的总和。据调查显示，60岁以上的女性骨质疏松率高达40%，而且随年龄段增加，比例也在上升。
因此，抗骨质疏松药物的研制是世界制药工业的一个热点。在目前应用的经典抗骨质疏松药物中，绝大部分为抑制破骨细胞活性的药物，如雌激素、降钙素、双膦酸盐等，但缺乏刺激成骨细胞活性或既刺激成骨又抑制破骨的作用，因而不能使骨组织恢复到正常的强度和密度[2]。
甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是生物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素，由84个氨基酸组成。他是哺乳动物体内重要的钙、磷调节因子[3]，而PTH 的分泌也受到血钙水平的反馈调节。实验表明：PTH（1-27）仍保持有一定体外活性，而PTH（1-26）则完全丧失体内外活性。hPTH(1-34)在体内外保持有完整PTH的几乎全部生物活性[4]。而合成的牛甲状旁腺素片段（bovine parathyroid hormone fragment(1-34)，bPTH-(1-34)）比天然激素bPTH（1-34）的活性更高。大量的临床研究表明，PTH及其片段的小剂量多次给药具有明显的成骨作用。由于PTH及其相关肽不但能防止骨裂解，而且能促进骨生长，对疏松骨具有恢复作用，因此被认为是治疗骨质疏松症的第二代首选药物。
二、PTH的生物合成过程及作用机制
人甲状旁腺激素是由甲状旁腺分泌的84个氨基酸组成的多肽，最初的转译产物是前甲状旁腺激素原（ProhPTH），由115个氨基酸残基构成，在分泌过程中首先在粗面内质网膜周质腔被信号肽切除Ｎ端25个氨基酸的信号肽部分成为甲状旁腺激素原（prohPTH），然后在高尔基体中切掉6个氨基酸的前体部分成为84肽成熟激素。而84肽在体内可降解成Ｎ端（1-34）肽等活性片段[1]。
在哺乳动物中，PTH主要生理作用是维持血钙平衡，PTH的合成和分泌很大程度上受
到甲状旁腺敏感受体介导的胞外钙浓度的调节：低血钙时，PTH分泌到血循环系统，结合于肾和骨靶细胞上的Ⅰ型PTH受体（PTH1R，此受体被PTH及PTHrP共同分享），通过对靶细胞直接或间接的作用帮助血钙维持在一定范围。而血钙升高又抑制其分泌，但无论血钙浓度多高，均不能完全抑制其分泌。在肾脏中，PTH直接刺激肾近区小管对钙的重吸收以及刺激1α-羟化酶的活性，增加肠内1，25－二羟基维生素D3介导的钙吸收；在骨骼中，PTH能诱导钙从基质中快速释放，增加破骨细胞的数目及活力，促进骨吸收，同时增加成骨细胞的数目，促进成骨细胞释放骨生长因子加速骨形成。另外，PTH还可能通过抑制肾近区小管和远区小管对磷的重吸收十血磷浓度维持在正常范围。
三、PTH结构与生理功能的关系
1978年Keutmann等报道了人PTH的一级结构。认为hPTH是由84个氨基酸残基组成的一条多肽链分子，分子中不含半胱氨酸，故分子中不含二硫键[6]。Tregear等用实验证明PTH发挥钙磷调节作用仅需氨基端1-34个氨基酸残基[7]。园二色谱研究结果表明在水溶液中PTH分子是伸展的无固定的高级结构。而且不论是整个分子还是氨基片段都显示了一些pH依赖性，即随pH的变化观察到的结构也有所不同，肽链中增加了少量的二级结构。荧光研究也显示了相似的结果[8]。利用1H-NMR人们发现在第20-24氨基酸残基的地方有少量的规则结构，但在水溶液中仍难以观察到PTH的二级或三级结构。进一步用NMR研究表明，hPTH1-34在Ser3到Gly12及Ser17到Lys26两处有一α螺旋结构。着两个结构紧密的区域由一段无规卷曲或螺旋结构相连[19]。由于PTH缺乏二硫键，因此在水溶液中无典型的结构。只有在非记性类膜环境中才能形成二级或三级结构，大部分多肽均形成两性螺旋结构，这样的螺旋结构在与受体结合时发挥重要作用。
研究发现，人甲状旁腺素N端α-螺旋和C端α-螺旋被结构随环境而改变的连接区相连。N端α-螺旋的N末端及C端α-螺旋的C末端为柔性区。N端是负责生理活性的片段，C端是负责受体结合的片段。将N末端的NH3+置于受体的信号传导部位是hPTH（1-34）发挥生理活性所绝对必要的，N末端三肽一定的柔性以及连接区的柔性也许可协助将N末端的NH3+引入受体中正确的部位这一相配过程。此外，hPTH（1-34）的Ser1，Gly12，Lys13，Arg20等氨基酸在hPTH（1-34）发挥生理活性时起着更特殊的作用[4]。
四、上市情况：
重组人甲状旁腺激素作为主要应用于低血钙导致的骨质疏松症治疗药物[10，11]，目前成为国内外研究开发热点之一。在国外，2002年美国食品与药物管理局批准使用重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症。这类药物被称为骨合成药。美国Allelix公司的重组hPTH （1-84）已进入Ⅲ期临床，美国Lilly公司的重组hPTH（1-34）（商品名Forteo?）已完成临床试验并已于2002年11月获FDA批准上市；美国NPS医药公司的rhPTH（1-34），商品名PREOS（原加拿大Allelix公司的Alix-11）于2003年9月完成Ⅲ期临床研究；加拿大ZelosOstabolin-C(TM)，鼻腔喷雾制剂已完成Ⅰ期临床研究。目前，国内已有多个厂家及科研机构从事重组rh-PTH（1-34）产品的研究和开发工作，由于大1量化学合成PTH有困难，PTH及其类似物的基因工程生产成为研究主要方向。
第一章实验原理
1.1 表达菌体来源
本实验室已成功构建表达菌体。此菌体以大肠杆菌BL-21为宿主菌，pET-28a为表达载体，天门冬酰酶Ⅱ切除信号肽的C末端片段为融合伙伴，在融合伙伴和目的肽结合处引入-Asp-Pro-酸敏感位点及二肽酶IV识别的C端和N端Pro-Pro-位点，并突变11位的亮氨酸为精氨酸。后经乳糖诱导T7启动子高效表达。
表达的核苷酸酸序列为：(共38个)
Cca ccg tcc gtt tcc gaa atc caa ctg atg cat aat cgt ggt aaa cat ctg aac tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aag aaa ctg cag gat gta cat aac ttc ccg ccg 可编码具有下术序列所示的蛋白质：
Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met 10
His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met 20
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 30
Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro 38
1.2 均匀设计法的选择
在酸水解过程中，温度，水解时间，所用盐酸浓度以及蛋白质含量多少对酸水解得率都有着不同程度的影响。王春晓在《两种新型人甲状旁腺素活性片段类似物研究》中使用均匀设计法对重组人甲状旁腺素类似物Pro-Pro-hPTH(1-34)进行了影响因素的研究。断定48℃、30h，50mmol/L，5%状态下为最佳酸水解条件。均匀设计法区别于正交实验设计法的主要特点是：实验次数少，每个因素每个水平只做一次试验；试验结果数据利用电子计算机处理，方便、快速、准确，可以定量地确定各因素对实验结果的影响，定量地预报优化条件及优化结果的区间估计。在本实验中，使用此法对目的小肽Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro的最佳酸水解条件进行确定。
1.3 检测波长的选择
在倪国华的《凝胶过滤分离鸡肉蛋白酶解物时紫外检测波长的选择》[12]一文中，叙述了在小肽的分子结构中能产生紫外吸收的实际上只有肽键和氨基酸的侧链基团。当肽键在200-300nm波长范围内的吸收峰已经确定的条件下，分析不同氨基酸的侧链结构在200-300nm范围内的吸收情况，分析结果表明：在小肽的分子结构中，200-220nm处的吸收峰主要是由肽键产生的，270-290nm范围内的吸收主要是由芳香氨基酸侧链的大π键产生的.当洗脱液在200-220nm无吸收时，检测波长设在200nm-220nm比设在250nm-300nm更灵敏、更可靠。
第二章试剂与仪器
2.1 试剂
2.1.1 试剂来源
抗生素
硫酸卡那霉素（Kan） AMRESCo分装
小肽电泳用试剂
丙烯酰胺 Sigma公司甲叉双丙烯酰胺 Sigma公司Tricine AMRESCo公司甘油（Glycerol）南京化学试剂有限公司拷马斯亮蓝R-250 Fluka公司过硫酸铵上海前进试剂厂四甲基乙二胺上海前进试剂厂三（羟甲基）胺基甲烷（Tris） Genebase Gene-Tech Co.Ltd 十二烷基硫酸钠（SDS） Genebase Gene-Tech Co.Ltd β-巯基乙醇 SERVA公司
发酵用试剂
乳糖北京益理精细化学有限公司泡敌上海华联制药
酸水解及分离纯化用试剂
浓盐酸南京化学试剂有限公司氢氧化钠南京化学试剂有限公司
氨水南京化学试剂有限公司CM52离子纤维素树脂 Whatman 公司（No.4037050）Sephadex G-25 Pharmacia公司醋酸铵南京化学试剂有限公司冰醋酸南京化学试剂有限公司
2.1.2 培养基
LB培养基
Trypton 上海生工生物工程有限公司Yeast extract OXOID NaCl 南京化学试剂有限公司Agar Genebase Gene-Tech Co.Ltd
玉米浆培养基
牛肉浸膏上海化学试剂厂玉米浆常州生化厂味精（谷氨酸钠含量≥99%）河南莲花味精股份有限公司
2.1.3 培养基配方
LB培养基
Yeast extract 0.5%(OXOID)，Tryptone 1.0%(OXOID)和NaCl 1%，加蒸馏水配制，高压灭菌，加卡那霉素（50μg/ml）备用。
玉米浆培养基
玉米浆 25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L，高压灭菌后，加卡那霉素使用。
2.1.4 缓冲液&溶液
小肽电泳：
阳极缓冲液：Tris 0.2M，pH8.9
阴极缓冲液：Tris 0.1M，Tricine 0.1M，SDS 0.1%
染色液：R-250(w/v) 0.25%，乙醇:乙酸:水（45:10:45）
脱色液：乙醇:乙酸:水（40:4:56）
SDS-PAGE凝胶电泳
1*Tris-Gly电极缓冲液：Tris 25mM，Glycine 250 mM，SDS 0.1%
考马斯亮蓝染色液：甲醇:水:冰乙酸（45:45:10），溶液中含0.25%（w/v）考马斯亮
蓝R-250
考马斯亮蓝脱色液：甲醇:水:冰乙酸（45:45:10）
2*SDS-PAGE加样缓冲液：
Tris-HCl(pH6.8) 100mmol/L
β-巯基乙醇 10%
SDS 4%
菌体裂解缓冲液：
Lysozyme(溶菌酶) 0.02%
Triton X-100 0.5%(v/v)
Tris-HCl pH8.07 50mmol/L
包涵体洗涤液：
Triton X-100 0.2%
Tris-HCl pH8.07 50mmol/L
包涵体裂解缓冲液：
尿素 4mol/L
Tris-HCl(pH8.0) 100mmol/L
2.2 仪器
1.GL20A全自动高速冷冻离心机湘西仪器仪表总厂机械仪器厂
2.TGL-16G型台式离心机上海安亭科学仪器厂制造
3.立式万用电炉上海圣欣科学仪器有限公司
4.马头牌架盘药物天平上海医疗器械八厂
5.HL-1B数显恒流泵上海沪西分析仪器厂
6.磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司
7.TH-500梯度混合器上海沪西分析仪器厂
8.HDJ-2B核酸蛋白检测仪南京大学
9.HD-A电脑采集器南京大学
10.D-1型自动蒸汽灭菌锅北京发恩科贸有限公司
11.GKC R112可控硅控温水浴锅上海跃进医疗器械厂
12.Galanz WP750中型机械微波炉
13.SW-CJ-1B 标准净化工作台苏州净化设备厂
14.电子天平上海精密科学仪器有限公司
15.TY-80S脱色摇床南京大学
16.DY602V稳流稳压电泳仪南京大学生物化学系
17.752紫外光栅分光光度仪上海第三分析仪器厂
18.BS-100A自动部分收集器上海市沪西仪器厂
19.BIOSTAT C20-3型自动发酵罐 B.Braun Biotech International，Germany
第三章实验方法
3.1 发酵与表达
3.1.1 培养基的选择
及将菌体置于LB培养基中培养，在0h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h检测OD
600
pH变化。
将同批次菌体置于玉米浆培养基中培养，在0h，1h，2h，3h，4h，5h，6.5h，7h，
及pH变化。
8h，9h，10h检测其OD
600
3.1.2 玉米浆中乳糖诱导表达量的确定
按4.1.1中流程处理发酵，加入乳糖后，分别在 0h，1h，2h，3h，4h， 4.5h，5h，6h， 6.5h，7h取样，SDS-PAGE电泳后扫描胶体，分析，确定表达量。
3.1.3 菌体发酵诱导前生长时间的确定
在发酵罐中培养菌体，在0h，1h，2h，2.75h，3h，3.33h，3.5h取样，测定OD
600值，描绘曲线，确定最佳生长时间。
4.1.4 菌体诱导最佳时间的确定
在发酵罐中，加入乳糖后，分别诱导0h，1h，2h，3h，4h， 4.5h，5h，6h，
值，描绘曲线，确定最佳诱导时间。
6.5h后取样，测定OD
600
3.2 分离纯化
3.2.1 细菌的裂解
发酵后，8000rpm离心5min收集菌体。将离心收集得到的菌体按4ml/g加入菌体裂解缓冲液中混匀，37℃摇床中过夜直至溶液不粘，12000rpm离心20min去上清。加等体积包涵体洗涤缓冲液混匀，室温下搅拌洗涤2-3小时，12000rpm离心20min去上清。
3.2.2 包涵体的分离和溶解
用等体积蒸馏水室温下搅拌洗涤上面的沉淀一次，溶液混匀后，12000rpm离心20min去上清。再用等体积2M尿素同样洗涤一次，得包涵体。每克包涵体按照8ml/g 加入包涵体裂解缓冲液混匀，室温下连续震荡20h至包涵体溶解，12000rpm离心20min，收集上清。
3.2.3 乙醇分级沉淀粗提物
用0.68V预冷乙醇边搅拌边缓慢加入包涵体裂解液中沉淀杂蛋白，-20℃静置20min后，12000rpm离心20min收集上清，同样再用终体积为3.5V乙醇沉淀其中的融合蛋白。
3.2.4 融合蛋白的酸水解
3.2.
4.1 考察是否可以进行二次酸水解
用50mMHCl溶解融合蛋白（含量为5%）后，48℃下水浴下水解30h。将水解产物调至融合伙伴的等电点pH=4.86处，离心，去沉淀。对沉淀进行电泳分析，考察沉淀的总量及其中存在的目的小肽的含量，进行分析，决定是否有进行二次酸水解的必要。
3.2.
4.2 酸水解条件的摸索方法
按均匀设计对酸水解条件进行考察。
按下述因素安排表设置条件进行酸水解，不同时间采样，采用均匀设计软件进行分析。同时，比较水解时间，水解温度，盐酸浓度以及蛋白浓度的不同组合所产生的水解效果。
`
5 40 48 25 2.5
6 45 58 70 0.5
7 50 68 115 12.5
制胶方法：
a.制分离胶
Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.) 1.5mL
Tris-Cl(8.45) 1.5mL
ddH2O 0.9mL
Glycerol 0.6mL
10%AP 10μL
TEMED 7μL
b.制间隙胶
Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.) 0.3mL
Tris-Cl(8.45) 0.5mL
ddH2O 0.7mL
10%AP 10μL
TEMED 4μL
c.制浓缩胶
Acr.+Bis.(49.5%Acr.+3%Bis.) 0.2mL
Tris-Cl(8.45) 0.62mL
ddH2O 1.68mL
10%AP 10μL
TEMED 4μL
d.上样
将各组条件下的样品溶于上样缓冲液中，根据浓度不同在各个样孔加入不同的量。
e.电泳
阳极液为0.2M Tris.HCl(8.9)，阴极液为0.1M Tricine(pH8.25)，0.1%SDS.110V 恒压电泳。
3.2.5 CM52层析柱
将水解产物调节至等电点离心除沉淀后，将上清再调节至与洗脱液基本一致的pH值，透析或稀释至原水解液体积的十倍左右，流动上样于用0.09M乙酸铵平衡好的CM52离子交换柱，将0.09M乙酸铵（500mL）对0.28M乙酸铵（500mL）进行梯度洗脱，收集样品峰。之前，实验室一般采用核酸蛋白检测仪在280nm检测波长处检测并收集样品峰。现探索是否能使用210nm处作为检测波长。
检测波长先选在280nm处，将处理好的上清液进行离子交换，用核酸蛋白检测仪检测，并收集样品峰。再将检测波长选在210nm处，将收集的样品进行离子交换处理，用BS-100A自动部分收集器收集，再用紫外可见分光光度仪对每管进行吸光度检测，绘制出210nm吸光度图谱。对两波长下收集的样品峰的总量和纯度进行比较。确定最佳检测波长。
3.2.6 透析
用蒸馏水进行，约3-4次，历时两天左右。
3.2.7 浓缩、除菌、过滤。
3.2.8 制半成品
原液浓缩到小肽含量为1mg/ml后，加入稳定剂，除菌过滤后得半成品。
3.2.9 冻干，纯度检测
成品-20℃保存。
第四章实验结果
4.1 表达与发酵
4.1.1 培养基的选择结果
Fig 1
Fig 2
Fig 3
时间，h pH
0 pH6.4-6.7
1 pH6.4-6.7
2 pH6.4-6.7
3 pH6.4-6.7
4 pH6.4-6.7
5 pH6.4-6.7
6.5 pH6.4-6.7
7 pH6.4-6.7
8 pH6.4-6.7
9 pH6.4-6.7
10 pH6.4-6.7
table 2 pH-time under using corn liquid
从诱导时间上看，在Fig 1中可以看出，菌体在LB中生长很好，OD600值迅速冲上0.5-0.6这个最佳诱导范围。在Fig 3中可以看出，菌体在玉米浆中生长，3小时就可处
0.5-0.6诱导范围；从价格上看，LB培养基价格较贵，玉米浆较便宜；从pH值方在OD
600
面考虑，比较Fig 2 和table 1可以看出，菌体在LB中pH主要在6.9-7.7之间变化，菌体在玉米浆中pH主要在6.4-6.7之间变化，菌体在玉米浆中pH环境更稳定，更适合发
酵过程中pH的控制。综合考虑，可采用如下流程处理发酵过程：
配制LB培养基→加入1?卡那和1.5?菌液→37℃培养过夜
净化台操作↓倒入
配制玉米浆培养基-----------------------------------→加入0.5?卡那→与其他未加入菌液的玉米浆培养基共同加入到自动发酵罐中→发酵预处理→发酵→收菌。
4.1.2玉米浆中乳糖诱导表达量的确定
0 1 2 3 4 4.5 5 6 6.5 7 （h）
Fig4. SDS-PAGE analysis of the AnsB-C-hPTH（1-34）fusion protein stained with Coomassie Blue under reducing condition.
Samples of total cell protein were prepared by dissloving cells in Laemimli sample buffer and boiling in the presence of β-mercaptoethanol for 5 min，and analyzed on a 15% https://www.doczj.com/doc/0912487078.html,ne 1，total cell protein of BL21，control;Lane 2-9，cells sample with pET28ansB-C-hPTH（1-34）after induced with lactose 1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，6.5h，7h respectivlely.
Rows (amount) (amount) (amount) (amount) (amount) (amount) (amount) (amount) (amount) (amount) r1 2.16 2.2572 1.6047 1.911 1.6453 1.6783 1.9844 1.876 2.0786 1.5387 r2 3.6966 2.9762 1.9272 2.5501 2.1086 2.407 2.3231 2.5352 3.1702 2.1716 r3 4.5612 3.6411 2.472 2.9967 2.4525 2.9782 3.2155 2.8689 4.1357 3.1386 r4 0.37081 0.32834 0.47662 0.61479 0.55387 1.3377 0.57914 r5 2.5675 1.244 0.75981 0.93589 0.6917 0.80199 0.97398 0.85279 3.5443 0.98268 r6 2.1616 1.8637 1.3199 0.67283 0.83071 1.2613 0.90181 1.3293 0.91208 r7 18.474 18.178 15.097 12.725 7.9551 7.5161 6.3601 7.1111 6.84 7.3581 r8 1.6384 1.6341 1.6199 1.7591 1.4585 1.6626 r9 20.491 33.215 27.477 24.642 25.254 26.079 26.734 26.495 22.503 26.92 r10 6.7651 6.9831 7.2605 6.1608 9.8778 6.8713 6.2973 6.0603 6.1447 7.7588 r11 4.5519 2.9343 1.5408 1.7311 2.5831 2.9478 1.9246 1.5126 2.3202 1.9274 r12 0.88891 0.49025 0.55338 0.49677 0.57466 0.76867 r13 0.64007 0.47704 0.48543 0.20376 0.39158 0.46592 0.32141
r14 3.55 4.3646 37.163 r15 1.7726 1.4991 29.213 34.531 35.135 35.989 35.696 35.62 28.939
r16 8.4916 5.8967 2.7284 3.1298 2.6726 2.9083 3.5999 3.0712 5.7152 2.7961 r17 15.301 5.2293 2.9792 2.6573 2.9487 2.9477 2.897 3.0444 4.1493 2.3291 r18 7.6168 7.891 3.739 3.6701 3.8328 3.5423 3.5356 4.8415 6.3343 1.9931 Sum 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 In
Lane 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Table 3 Expression level of Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro----densitometric analysis
由表2的r15一行数据可以看出，一定范围内，随着诱导时间的延长，融合蛋白的表达的菌体总蛋白的分比在增加。诱导后0h，1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，6.5h，融
合蛋白的表达分别为1.7726%，1.4991%，29.213%，34.531%，35.135%，35.989%，35.696%，
35.62%，28.939%。7h时的样品因为中途染菌，所测数据不准确，予以舍弃。从数据变化
中，可以看出乳糖诱导在4小时后就超过35%，5h时最大值，接近36%。表达量较高。在
此后的发酵中，都采用诱导5h终止发酵并收菌。
4.1.3菌体发酵诱导前生长时间的确定