由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。这里的荧光核酸染料主要指能特异结合核酸并改变发光特性的化合物，DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料吧。除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂，它们能以非共价键的方式与DNA/RNA结合从而显示原位杂交中的细胞背景信息。根据它们能否穿透细胞膜进入活细胞体内，还可分为两大类：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。生物通在此简单比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。
分子生物学常用荧光核酸染料
荧光核酸染料在分子生物学最常见的应用无疑是电泳凝胶染色，以及定量PCR。
EB
EB（溴化乙锭）本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。虽说以前的实验室里总会有个别做起实验来“精神可嘉，行为可怕”的家伙，一时找不到手套他们敢徒手拿EB胶，但大多数人对EB还是“敬而远之”的，没事谁都不愿靠近实验室里跑胶、看胶那一块地方。偏偏对于搞分子生物学的人来说，跑胶就像吃饭一样平常，于是大家只能硬着头皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早点出现在实验室。生物通在此简单回顾一下这几年纷纷登场的EB替代品。
SYBR系列染料
说到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下Molecular Probes专利持有的SYBR系列。自1993年SYBR核酸染料推出以来，就因其灵敏度和易用性而迅速大受欢迎，成为明星产品之一。这一系列包括4种染料：SYBR Safe、SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II。
赫赫有名的SYBR Green I荧光染料是最早上市的EB替代品，这种致畸性低而相对安全得多的新染料在标准300 nm的紫外透射光下，能检测低至60 pg的dsDNA，比EB至少高了一个数量级。同时，SYBR Green I染料-DNA复合物的荧光量子产率约为0.8，相当于EB的5倍。SYBR Green I的使用和EB同样简单，而具有比EB更高的灵敏度，致变性也低得多（有个别宣传称之为几乎无毒），使之迅速成为替代EB的好选择----如果不是贵得多的话就更好了。色如其名，结合DNA后会发出美丽的绿色荧光，在拍照时需要配套的滤光片。SYBR Green I亦即是定量PCR荧光染料法中广泛使用的荧光染料。为什么选择它，而不是灵敏度更高的SYBR Gold呢？那是因为SYBR Green I具有双链DNA的专一选择性。
SYBR Green II与SYBR Green I则刚好相反，它是检测RNA或单链DNA的高灵敏染料。尽管它不是RNA特异的，但SYBR Green II与RNA结合的荧光量子产率（~0.54）高于DNA（~0.36）。这个性质很特别，因为大部分染料都是与双链DNA结合时量子产率和荧光强度更高。与SYBR Green I相似，SYBR Green II也是在254 nm透射光下灵敏度最高。如果在300 nm透射光下，RNA检测的金牌恐怕还要颁给SYBR Gold。此外，SYBR Green II染料-RNA复合物的荧光不会被尿素或甲醛淬灭，因此在染色之前不必将变性剂洗脱。SYBR Green II可检测凝胶中低至100pg的ssDNA或者2ng RNA条带，特别适合SSCP分析和RNA分析。
SYBR Gold是这一系列中灵敏度最高的。它一旦结合核酸，荧光会增强1000倍以上，量子产率约为0.6。而EB仅为30倍，量子产量大约在0.15。因此，利用300 nm紫外透射仪和黑白成像，SYBR Gold检测凝胶中DNA和RNA的灵敏度比EB高10倍以上。色如其名，可以观察到金色的条带。SYBR Gold染料可用于检测包括双链DNA，单链DNA和RNA，适用于琼脂糖凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）研究，以及其他常规的分析。
SYBR Safe既然名为safe，自然是安全第一。它的诱变性比EB要低得多，但检测灵敏度与EB 相当。使用方法也相同，既可以在制胶的时候加入，也可以在电泳后进行染色。SYBR Safe的激发峰在280和502 nm，发射峰在530 nm。因此，核酸被染色后，可通过标准的紫外透射仪、
可见光透射仪或激光扫描仪来查看。大家都知道，紫外光对DNA片段是有损伤的，Invitrogen 曾做过实验，让1.25 kb的基因片段在紫外光下暴露2分钟，再切胶回收、连接、转化，结果发现平板上的克隆数几乎为零。如果你用SYBR Safe搭配蓝光透射仪，就不会有这种问题，也无需担心紫外线对眼睛的损伤。
生物通小贴士：SYBR染料虽是EB的替代，但用法和EB不尽相同，染色时也有一些需要特别注意的地方。首先是pH值。Invitrogen的专家发现pH是影响染色效率的重要因素。如果它高于8.3或低于7.5，你会发现灵敏度显著下降。另外一点也很容易忽视，Tris缓冲液的pH值在4°C 会比室温下明显升高。如果在室温时你的缓冲液配制成pH 8.0，那么在4°C pH将会升高到8.5。因此如果你要冷藏染色液，那么它在室温下的pH值应是7.5。
其次，很多研究人员习惯于制备含有溴化乙锭染料的凝胶。SYBR Green染料也能如此使用，不过核酸的迁移率会受到影响，灵敏度也会稍有下降，因为背景荧光增加。在预制胶时，染料应该在临灌胶之前，液体足够冷却时加入熔化的凝胶中。沸腾和接近沸腾的温度会破坏SYBR Green染料染核酸的能力。注意：不要在微波炉中加热SYBR Green染料。
Lonza公司也有一种久负盛名的类似SYBR Gold的GelStar核酸荧光染料，可高灵敏的检测凝胶中低至20pg的dsDNA或者3ng的RNA，使用起来和EB一样可以前染或者后染且无需脱色，可让你更清晰地观察实验结果。
UltraPower核酸染料
百泰克公司最近也推出了一种取代EB的无毒花菁染料- UltraPower核酸染料。利用紫外凝胶透射仪来观测，它的灵敏度比EB染色法高5-10倍，如果配合百泰克UltraPower?可见光透射仪，则比EB染色法高8-20倍。样品荧光信号强，无背景信号。操作也很简单，可以采用胶染法（同EB）、点染法、泡染法等染色方法，无须脱色或冲洗。琼脂糖凝胶电泳和PAGE电泳均可使用，价钱当然比进口试剂要便宜很多。目前，百泰克还提供试用装，欢迎大家申请。
GelRed & GelGreen
由中国留学生创立的美国Biotium公司提供的GelRed和GelGreen也是EB替代品。根据独立的测试服务公司的标准艾姆斯氏测试结果，在18.5 μg /mL （该浓度远高于推荐用于电泳后染色的约 4 μg/mL 的3X 染色液）浓度下，GelGreen 没有诱变性，而GelRed 也仅在S9 代谢活化时有微弱的诱变性。GelRed 和GelGreen 的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。如果您使用的是紫外成像仪，可选择GelRed；如果您使用激光成像仪或希望在可见光下观测，可选择GelGreen。
插曲：争议
网络上关于EB替代品安全性的问题一直争论不休，虽然各品牌都有五花八门的证据，但EB替代品究竟安不安全？虽然EB为活细胞排斥，但还有具有一定的细胞膜通透性，EB的致变性通常被认为来自于能稳定地插入到核酸中而导致核酸复制过程出错。每种荧光核酸染料都因其能稳定插入核酸内部从而改变荧光特性才得以成为可用的荧光染料，从理论上都是不安全的，新出的EB替代物的安全性恐怕还需要更长时间来验证。其实长期在实验室里工作真可谓“冒着生命危险”的，常常需要与EB啊，同位素啊，细菌病毒啊等各种致癌致畸的试剂打交道。2007年生物通曾经联手赛默飞世尔公司发起过实验室安全调查，正是有感于短期内多次听到同领域多位人士患可怕重症的消息，调查结果也确实触目惊心。因此，无论用什么，请大家还是牢记----珍爱生命，请带手套。一时半会儿看不出问题，可年轻的你们，来日方长呢……实验室安全的问题，我们一直不够重视，但有关自己的健康，你还能忽视吗？还有各种染料染色后继的废弃试剂，请尽可能的规范处理，请做个负责任的实验人----通常的处理是活性炭吸附后焚化，就算没有条件也尽可能处理一下（比如强碱处理，多数荧光染料会变性）再废弃，我们的环境污染实在不需要我们雪上加霜了。
言归正传，荧光染料在分子生物学中另一个广泛应用就是定量PCR。关于荧光探针和荧光引物的选择及优缺点比较，那又是一门大学问，详情请看《定量PCR选择之：荧光探针和荧光引物》。细胞生物学常用荧光染料
固定细胞的染色
PI
PI（碘化丙锭）与EB结构相似，PI在水中的溶解度更高，而膜通透性比EB低，不过两种染料都会被活细胞排斥。PI则常用于检测死亡或即将死亡的细胞数量，或了解细胞内染色体局部状况、DNA结构和膜完整性。PI作为红色荧光复染剂的首选，可与绿色荧光探针或二抗共同使用。DAPI荧光染料
DAPI大家应该也不陌生。它的学名为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，与DNA结合后发出蓝色荧光，与其他结构的绿色、黄色和红色荧光形成鲜明的对比。与Hoechst相似，DAPI也是与双链DNA 的小沟结合，特别是AT簇。当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合无荧光的增强。它的荧光强度比Hoechst低，但光稳定性高于Hoechst。不过，DAPI在结合去污剂、磷酸盐及其他多聚阴离子之后，荧光并不会显著增强。DAPI是一种极佳的核酸复染剂，能显示出染色体的清晰带型。DAPI易溶于水，在PBS中溶解度有限。
SYTOX系列染料
Invitrogen的SYTOX系列染料也很受欢迎，它们是非通透性的花菁染料，尤其适合于死细胞的染色。使用起来也比较简单，只需要加到细胞，然后观察即可，不需要额外的洗涤，因为它们在水溶液中没有荧光。SYTOX染料适用于多个平台，包括荧光显微镜、流式细胞仪和酶标仪。整个系列目前有红、橙、黄、绿四种颜色。
SYTO X绿色染料与核酸的亲和力是整个系列中最高的。一旦与核酸结合，荧光会增强500倍以上。哇，立马把PI比了下去。且它的碱基选择性最小，不像DAPI和PI那么挑剔，只认AT。SYTO X绿色染料可由常用的488 nm激光或其他的450-490 nm光源激发。它能轻松地透过质膜受损的细胞，但不能穿过活细胞膜。它还特别适合于革兰氏阳性菌、阴性菌及某些病毒粒子的染色，因为它很亮。SYTOX绿色染料能与红色、蓝色染料一起，进行多色分析。它还能与SYTO 17红色染料进行死细胞和活细胞的共同染色。
SYTO X蓝色染料也是一种高亲和力的核酸染料，只能渗透质膜受损的细胞。它与核酸结合后的最大吸收峰约为445 nm，能被汞弧灯的436 nm谱线所激发。与许多蓝色荧光染料不同，SYTOX 蓝色染料还能被卤钨灯有效激发。在定量膜受损的细菌细胞上，SYTO X蓝色染料与绿色染料效果相当，同样也不会干扰细菌细胞的生长。不过蓝色和绿色的发射光谱有些重叠，因此SYTOX 蓝色染料还是与橙色或红色探针一起使用，效果更佳。
SYTO X橙色染料能清晰分辨死的细菌、酵母或哺乳动物细胞。它与PI相比，发射波长更短，它的光谱则更接近罗丹明的滤光片。此外，SYTOX橙色染料的消光系数比PI要高得多，在结合DNA时荧光显著增强，表明它作为死细胞染料或核酸复染剂，有着更高的灵敏度。SYTOX 橙色染料还是利用流式细胞仪进行DNA片段筛选时的最佳染料。
活细胞的染色
Hoechst荧光染料
大家耳熟能详的Hoechst系列染料是一种双苯甲亚胺（bisbenzimide）染料，主要有Hoechst 33258和Hoechst 33342等。它们是细胞膜通透性的小沟结合DNA染料，结合后发出明亮的荧光。Hoechst 33342的膜通透性比Hoechst 33258略好，相当易溶于水，细胞毒性小。它们可被大多数常用的荧光光源所激发，表现出相对较大的斯托克斯位移（激发/发射波长约为350/460 nm），因此适合于多色标记实验。在未结合DNA时，它们有着复杂的pH依赖光谱，在pH5时的荧光产量比pH8时要高得多。SDS等表面活性剂还能使荧光增强。
Hoechst染料普遍用于多个细胞分析，包括细胞周期和凋亡研究，而且它们还是常用的核酸复染剂。此外，Hoechst 33258还有一个特殊的应用。由于它对疟原虫有毒性，因此可用于血液样本的流式筛选，并评估患者的药物敏感性。
SYTO核酸染料
Invitrogen的SYTO是活体核酸透性染料。这种染料对核酸的亲和力较低，可通过被动运输扩散透过大多数细胞的细胞膜。对活细胞和死细胞的DNA和RNA都可以进行染色。同时，也可用
于革兰氏阳性和阴性细菌的染色。染料通过紫外光或可见光激发而发出荧光。目前有蓝、绿、橙和红等几种颜色。各种SYTO染料间的特性都不相同，包括细胞通透性、与核酸结合后荧光的增强度、激发和发射光谱、对DNA/RNA的亲和力等。与专门用于DNA染色的DAPI和Hoechst 染料不同，SYTO还可以对RNA进行染色，因此，经过SYTO染色的细胞在细胞核和细胞质中都可以观察到染色。
由于有些SYTO染料在中性pH条件下带正电荷，因此也可以对线粒体染色。死亡的酵母细胞经过染色后出现明亮的荧光，活的酵母细胞在线粒体和细胞核都可以观察到荧光。一些SYTO的染色还可以用于观察细胞凋亡。红色的SYTO染料可以用来作为绿色荧光蛋白、凝集素或者非通透性绿色SYTO X染料的复染剂。一些绿色的SYTO染料则是很好的细胞核复染剂。
由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。这里的荧光核酸染料主要指能特异结合核酸并改变发光特性的化合物，DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料吧。除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂，它们能以非共价键的方式与DNA/RNA结合从而显示原位杂交中的细胞背景信息。根据它们能否穿透细胞膜进入活细胞体内，还可分为两大类：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。生物通在此简单比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。 分子生物学常用荧光核酸染料 荧光核酸染料在分子生物学最常见的应用无疑是电泳凝胶染色，以及定量PCR。 EB EB（溴化乙锭）本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。虽说以前的实验室里总会有个别做起实验来“精神可嘉，行为可怕”的家伙，一时找不到手套他们敢徒手拿EB胶，但大多数人对EB还是“敬而远之”的，没事谁都不愿靠近实验室里跑胶、看胶那一块地方。偏偏对于搞分子生物学的人来说，跑胶就像吃饭一样平常，于是大家只能硬着头皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早点出现在实验室。生物通在此简单回顾一下这几年纷纷登场的EB替代品。 SYBR系列染料 说到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下Molecular Probes专利持有的SYBR系列。自1993年SYBR核酸染料推出以来，就因其灵敏度和易用性而迅速大受欢迎，成为明星产品之一。这一系列包括4种染料：SYBR Safe、SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II。
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；
3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；
利用荧光染料法检测单核苷酸多态性（SNP） 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，并且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP是继RFLP 和STR后的第三代分子标记，具有数量多、分布广和遗传稳定等特点。它与许多疾病直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此，SNP分析对于群体遗传学、疾病相关基因的研究、新药研究、临床检验和分子诊断等领域有着重要作用。 荧光定量PCR中的SNP分析平台主要是基于等位基因特异性杂交原理，通过检测PCR过程中产生的荧光信号来区分等位基因，每检测一个SNP位点需要一对TaqMan探针(或分子信标)和一对位于检测位点的上下游引物。下面介绍一种新的基于荧光定量PCR 检测SNP位点的方法，它不需要设计特异性的TaqMan探针，只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。 该方法使用了两种不同的等位基因特异性正向引物，每个正向引物3′端的最后一个碱基对应于SNP位点的二等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料（SYBRGreenI）来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物。 为了区分这两种扩增产物，我们在其中一个等位基因特异性引物的5′加一个20bp左右含GC重复序列。由于DNA的溶解温度主要与其片段长度和GC含量有关，经过修饰后的引物的长度和GC含量明显高于另一个等位基因特异引物，因此，使用这两种引物后的PCR扩增产物有着不同的Tm值。在PCR扩增结束后，运行一个溶解曲线程序，即让产物慢慢从60度升温到90度，从溶解曲线图上就可以分析出哪种等位基因参与了PCR扩增，由此也得到了相应的基因组的基因型。 补充一点： 1. 在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA 双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染料与双链产物结合，经检
GoldViewⅠ型核酸染色剂使用说明 货号：G8140 规格：1.0ml（10000×） 保存：常温保存，有效期至少一年。 产品介绍： GoldViewⅠ是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。通过小鼠皮下注射实验，尚未发现GoldViewⅠ有致癌作用；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用GoldViewⅠ代替EB不失为一种明智的选择。 使用方法： 将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）放入微波炉中融化，冷却至60℃左右（不烫手时）后加入10ul GoldViewⅠ核酸染料，轻轻摇匀后倒胶（避免产生气泡），待胶完全凝固后上样电泳，电泳完毕在紫外灯下观察。 注意事项： 1、胶厚度宜不要超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。 2、加入GoldViewⅠ的琼脂糖凝胶反复融化可能对DNA检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。 3、GoldViewⅠ在pH3.6-7.0之间能更好地与核酸结合，因此电泳时最好使用新鲜的电泳缓冲液。 4、由于GoldViewⅠ产生绿色荧光，因此不适于用一般单色胶卷拍照，可以使用凝胶成像系统保存图像。 5、含有GoldViewⅠ的凝胶不适于进行凝胶回收实验。要进行回收实验，请使用EB或
GoldViewⅡ型。 6、GoldViewⅠ特别适合于大片段DNA的检测(大于1kb的片段,检测灵敏度与EB相当);当DNA片段小于1kb时,检测灵敏度低于EB,特别是低于500bp的片段,GoldViewⅠ型可能亮度很弱或检测不到。如果检测小片段的DNA,请选用GoldViewⅡ型核酸染色剂,该染色剂适合于检测所有片段大小的DNA片段。 7、虽然尚未发现GoldViewⅠ有致癌作用，但由于GoldViewⅠ溶液酸性较强，因此对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴手套。 应用特点： 高效：GoldViewⅠ可以检测50ng级的DNA或RNA片段。其激发波长有多处，其中两处最强：230nm和490nm。安全：尚未发现GoldViewⅠ有致癌作用，使用该试剂不用接触EB（溴化乙锭）等有害物质。 相关试剂： D1200琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 G8142GoldView‖型核酸染色剂(5000×) D10106×DNA Lodding Buffer T106050×TAE缓冲液 E1027EB清除剂
常用荧光染料的激发和发射波长 Fluorescent Dye （荧光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green 500 503 522 Oregon Green 488 496 524 RlboGreen 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531 Calcium Green 506 533 TO-PRO -1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPYR 542 568 BODIPY558/568 558 568 BODIPY564/570 564 570 Cy3 550 570 Alexa 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582 Rhodamine Red 570 590 581 596
核酸染色剂 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂： 1.（ethidium?bromide,?EB）最常用的核酸，这种扁平分子可嵌入核 酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L?MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。 在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解，应于4℃避光保存。 2.（acridine?orange,AO）：吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在 254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L（pH7.0）中避光浸
关于荧光染料（资料集合） ●人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ●理想的荧光染料一般具有以下几个特点： 1.具有高的光子产量，信号强度高； 2.对激发光有较强的吸收，降低背景信号； 3.激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰； 4.易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物的特异性； 5.稳定性好，不易受光、温度、PH、标本抗凝剂和固定剂的影响。 ●染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色，然后进行观察。随着生物技术、计算机技术以及荧光光谱测定技术的不断发展，许多染料尤其是荧光染料在细胞检测、肿瘤基因蛋白分析、毒物分析、临床医疗诊断等方面得到了广泛的应用。 荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一大于吸收光波长的光波的物质。利用荧光染料进行抗体标记分析在现代生物免疫学领域中应用广泛，并逐步显示出明显的优越性。 下面简要介绍应用于标记抗体的荧光染料及其种类： 1.荧光素类染料，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等及其类似物。这是一类具有较多苯环的化合物。应用最广泛的是FITC(如图为FITC标记的组织荧光图)，在488nm 处由氩离子激光激发，发射525nm的蓝绿色荧光。FITC能够与各种抗体蛋白结合，并在碱性溶液中稳定呈现蓝绿色荧光。 2.罗丹明类染料，包括红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm处被激发可发射出570nm的黄色荧光。 3.Cy系列菁染料，菁染料通常有两个杂环体系组成，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物。 4.Alexa系列染料，它是由MolecularProbes开发的系列荧光染料。其激发光和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域，应用广泛。以高亮度、稳定性、仪器兼容性、多种颜色、pH值不敏
荧光染料简介 荧光定义 荧光染料会发出荧光，所谓荧光是指物质分子吸收紫外光后发出的可见光荧光以及吸收波长较短的可见光后发出的波长较长的可见光荧光。 荧光发生机理 每个分子具有一系列严格的分立能级，室温下物质分子大部分处于"基态"，当这些物质在光的照射下吸收光能后，进入新的状态，称为"激发态"。处于"激发态"的分子是不稳定的，它可以通过以10-9-10-7秒的极短时间内发射光量子回到基态。这一过程称为荧光发射， 也就是发光。 激发光谱和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有两个特征光谱--激发光谱和荧光发射光谱。 在测定时，用以激发荧光的吸收光谱，一般称为荧光物质的激发光谱，它是指相对于不同激发波长的辐射所引起物质发射某一波长荧光的光谱。 荧光发射光谱简称为发射光谱，是指某一波长激发光引起物质发射不同波长荧光的光谱。 荧光效率和荧光强度 分子能产生荧光必须具备两个重要的条件，一是物质的分子必须具有吸收一定频率光能的基团--生色团，二是必须具有能产生一定光量子的荧光团。 而物质发射荧光的能力用荧光效率表示。荧光效率为荧光团发射荧光的光量子数与生色团吸收的光量子数的比值称。 荧光效率往往小于1。如罗丹明B的乙醇溶液的荧光效率为0.97；荧光素的水溶液的荧光强度为0.65，荧光效率与物质结构有关，还与所处的环境紧密相关。而对于某种荧光 物质在特定的环境下它的荧光效率是固定的。 在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。即荧光强度（发射荧光的光量子数）等于吸收光强度乘以荧光效率。 提高荧光强度的根本方法 选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，和选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片作为激发滤光片，是提高荧光强度的根本方法。许多染料的最大吸收峰并不是 紫外光，而是在400nm-500nm的蓝绿光，所以紫外光不是这些染料的最佳激发光源，可 见光才是这些染料的最佳光源。 常用荧光色素波长
、流式细胞术常用试剂 1、10％NaN 3：将 10gNaN3 溶解于 100ml 蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化 酶反应中可不使用 NaN 3。 2、 3％ BSA/PBS ： 100ml PBS 中加入 3g BSA ，使之溶解，再加入 0.2ml 10％的 NaN 3。 3、500mmol/L EDTA ：将 186g EDTA?Na 2?2H 2O 溶解于 400ml 蒸馏水中，用 NaOH 将 PH 调 至 8.0 ，补充蒸馏水至 500ml ，分装，高压灭菌，室温保存。 4g 多聚甲醛溶于100ml PBS ，加入数滴 NaOH ，在通 PH 至 7.4，使用前新鲜配制。 5、消化液： 0.25％胰蛋白酶（用培养液或 PBS 配制）或 0.25％胰蛋白酶与 0.02％ EDTA 的 混合液。 6、红细胞裂解液： NH 4CI 4.16g , KHCO 3 0.5g , EDTA?2Na 0.02g ，溶于 100ml 水中，调 PH 至 7.2，补充蒸馏水至 500ml ， 4 度储存，使用时需恢复至室温。 7、流式细胞抗体稀释剂： 0.1mmol/L PBS 液（PH 7.4）+ 1 % BSA + 0.1% Na 2N 3。 8、常用细胞破膜 剂： PBS 液（PH 7.4） + 1% FBS （或 BSA ） + 0.1% NaN 3+ 0.1% saponin （Sigma 的效果不错） 。 9、流式细胞染色洗涤液：含 2%的 BSA 、 0.1%NaN3 的 PBS （PH 7.4）。 10、PI 染液（保存液，10务用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI 溶于10ml PBS ,加入2mg 无DNA 酶的RNA 酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加 0.3ml ?0.5ml PI 染液。 11、Hanks 液的配制（BSS ，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、 组织培养液） 原液 A NaCl 160g MgSO 4?7H 2O 2g KCl 8g MgCl?6H 2O 2g CaCl 2 2.8g 溶于 1000ml 双蒸水 原液 B 1） N a 2HPO 4?12H 2O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20.0g 溶于 800ml 双蒸水 2） 0.4%酚红溶液：取酚红 0.4g 置玻璃研钵中，逐滴加入 0.1N NaOH 并研磨，直至完全溶 解，约加入 0.1N NaOH 10ml 。将溶解的酚红吸入 100ml 量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留 的酚红4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将 风柜中于 60 度加热，使其溶解，调整
常用染料的激发与发射 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
常用荧光染料的激发和发射波长
荧光染料的使用 吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA 荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用时取贮存液加入L甘露醇中.使用时,使最终浓度为%。荧光染料Ho33342和若丹明123:活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才
能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。 荧光组化实验中应注意的几个问题：1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2．一放荧光染色在20℃以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降， 这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
红色荧光核酸染料使用说明 货号：E1020 规格：5ml（10mg/ml） 保存：室温避光储存，有效期至少1年。 产品说明： 红色荧光核酸染料是一种高度灵敏的荧光染色剂，常用于琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳后核酸染色。该染料与DNA结合后在紫外光透射仪激发下放射出橙红色荧光，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。结合DNA染料的复合物荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的红色荧光核酸染料（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。 使用方法： 1、胶染：将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）放入微波炉中融化，冷却至60℃左右（不烫手时）后加入5-10ul染料，轻轻摇匀后倒胶（避免产生气泡），待胶完全凝固后上样电泳，电泳完毕在紫光灯下观察拍照（注：由于在该染料存在的情况下，线状DNA 的电泳迁移率约降低15%）。 2、泡染：琼脂糖凝胶电泳后，将胶浸没在含有染料（0.5ug/ml）的电泳缓冲液或去离子水中，室温下染色15-45min（取决于凝胶厚度）。脱色时用去离子水或者1mM的MgSO4溶液室温浸泡约10-30min可降低背景荧光（可选）。 注意事项： 1，本品为强烈的诱变剂，使用时请注意安全。 2，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 相关试剂：
T10505×TBE缓冲液 T106050×TAE缓冲液 D10106×DNA Lodding Buffe M1060D2000DNA Ladder G8140GoldView I型核酸染色剂(10000×) G8142GoldView‖型核酸染色剂(5000×) SY1020SYBR Green I(10000×) SY1040SYBR Green‖(10000×)
GoldView II核酸染料说明书 货号：G8142 规格：0.5ml(5000×) 保存：-20℃，短期4℃保存。 注意：本产品属于微量核酸检测试剂，使用时请严格按照说明书操作。第一次使用前请融化后离心再开封。产品简介： GoldView II是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型花青类核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView II与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度比EB强5-10倍，使用方法与之完全相同。GoldView II 与核酸结合后，最大吸收峰为497nm，另外，其在254nm处也有一强吸收峰，发射波长为520nm，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。 通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview II代替EB不失为一种明智的选择。 本产品为DMSO溶解,低温时为固体状态,温度到达20℃以上即可融化。 使用方法: 胶染： 由于GoldView II敏感度比EB高数倍，使用时，请将商品化的Marker用1×DNA Loading Buffer作5-10倍的稀释，上样1-10μl,以得到较好的结果(通常稀释10倍后上样5ul)。对于待检测样品，通常仅需1-2μl即可。如果浓度较高，也须作一定倍数稀释，否则会造成条带不整，影响迁移速率。凝胶回收请选择点染方法。 1.将50ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。 2.冷却至不烫手时加入10-15μl GoldView II(不能少于10ul)，轻轻摇匀，避免产生气泡。 第1页，共2页
常见核酸染料选择浅析 （李路军河南农业职业学院植物科学系河南郑州450000） 摘要：由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料。除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂。下面比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。 关键词：核酸染料、EB、GeneFinder、Goldview、SYBER greenI、GelRed、GelGreen 引言： 作为生物体内的重要的大分子，核酸是研究生命现象与本质的物质基础，通过对它们的理化性质、复制与转录、表达与调控等的研究，可以了解生命有关的本质规律。因此，对核酸的研究具有及其重要的意义。但核酸肉眼不可见，对其的研究主要是借助一定的仪器来观察它的形态、大小、表达量，其中最常见的也是最简单的是琼脂糖凝胶电泳。EB(溴化乙锭)是实验室最常用的核酸染料，有着简单、快速、灵敏度高的特点，但是由于其有着强烈的致突变能力和中度致癌性，对实验者和周围环境都有着较大的危害。溴化乙锭(EB)是分子生物学实验室常用的一种核酸荧光染料。但是，由于EB是一种强烈的致癌物，因此，如何消除EB对实验室的污染，是分子生物学实验室安全所必须面对的一个难题。 A bstract：Because only needs the simple temperate physical method(illumination)to stimulate and the examination,the fluorescent dye studies the biology microcosm is when specially the nucleic acid one of most commonly used tracing tools.After DNA electrophoresis,examines the gelatin E B is the fluorescence nucleic acid dye which probably the most person knew very well. Except dyes the rubber,the fluorescence nucleic acid dye may also use in the fluorescence home position hybrid taking the common counterstain.Following compares in the molecular biology experiment and the cytology experiment the commonly used fluorescent dye. Key word:Nucleic acid dye,EB,GeneFinder,Goldview,SYBER greenI,GelRed,GelGreen Introduction：In the achievement organism's important macro-molecule,the nucleic acid is studies the biological phenomena and the essential material base,through to their physics and chemistry nature,the duplication and the duplication,the expression and the regulation and so on research,may understand the life related essence rule.Therefore,has and the vital significance to the nucleic acid research.But the nucleic acid naked eye is not obvious,is mainly draws support from certain instrument to its research to observe its shape,the size,the expression quantity,what most common is also the simple is the agarose gel electrophoresis.EB(bromination second grade spindle)is the laboratory most commonly used nucleic acid dye,has simply,fast,the sensitivity high characteristic,but because it has intense sends the sudden change ability and the moderate
细胞核常用荧光染料有： 吖丫啶橙(Acridine Orange , AO )、溴化乙锭(Ethidium Bromide , EB )和碘化丙啶(Propidium Iodide , PI ) , DAPI 、Hoechst 染料、EthD III 、7-AAD 、RedDotl 、 2等等。 透膜的染料如下： AO :具有膜通透性，能透过细胞膜，将核 DNA 和RNA 分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。 EB : —种高度灵敏的荧光染色剂，在标准 302nm 处激发出橙红色信号。 DNA 的染色灵敏度要高于EB 和PI ，荧光强度比Hoechst 低，但光稳定性高于Hoechst Hoechst 染料：蓝色一类在显微观察中标记 DNA 的荧光染料，最常见的两种是 Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm 处被激发，在 461nm 处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI 相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更 小。 RedDot 1染料：红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于 Draq?5和Draq?7。RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。 RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。 不透膜的染料，如下: PI 作为红色荧光复染剂首选，PI 经常与Calcein-AM 或者FDA 等荧光探针合用，区分死/活细 EthD III 、7-AAD 、RedDot 2 :不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测; 细胞核荧光染料(PI DAPI Hoechst33342 ) 细胞核荧光染料PI 碘化丙啶(简称PI )是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但 PI 能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜 而将细胞核 染红，PI 在绿色光(540nm 波长)的激发下，会在600nm (红色光)处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA 结合的PI 发出的荧光，与未结合的PI 相比，强 度会增强 20-30 倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in waterlOmL 碘化丙啶英文名： Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39外观：红棕SF 末应用：DNA 染色染色原理： 碘化 丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在 嵌入双链DNA 后释放红色荧光。尽管PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。 PI 经常被用来与 Calcein-AM 或者FDA 等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 光谱性质：PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm 。染色 过程：1.用PBS 或适当的缓冲液制备10?50小 的PI 溶液。a) 2.将1/10培养基体积的PI 溶液加入到细胞培养基中。b) 3 .在37 C 培养细胞10-20分 钟。4.用PBS 或合适的缓冲液洗涤细胞两次。 5.用535nm 激发波长，615nm 发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。 a)由于PI 可能具有致癌性， 请小心操作。b)也可以用1/10浓度的PI 缓冲液代替培养基。 保存条件：4C 避光保存 对人体有刺激性，请注意适当防护 DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA 中大部分A , T 碱基相互结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为 DAPI :蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与 DNA 结合后可以产生比 DAPI 自身强20多倍的荧光，而与单链DNA 结合无荧光的增强。 DAPI 对双链 PI :不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
EB 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。单链DNA、RNA分子常存在自身配对的双链区，也可以嵌入EB分子，但嵌入量少，因而，荧光较低，其最低检测量为0.1μg SYBR Green I SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。 1.在"SYBR GreenⅠ预染色方法"中，电泳时间不要超过2小时，否则SYBR GreenⅠ会从DNA上分离出来，会产生弥散状条带。 2.在紫外照射透视下，与双链DNA 接合的SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链DNA 则颜色为橘黄而不是绿色。 3.SYBR Green对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲合力。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器。 SYBR Green I I SYBR Green I I可以对RNA或单链的DNA进行染色。SYBR Green I IRNA染料并不是特异性的结合RNA或DNA单链，但是其对单链的结合效率是双链的约2倍，。 GoldView GoldView?是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA 时，GoldView?与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。 GoldViewⅠ特别适合于大片段DNA的检测(大于1kb的片段,检测灵敏度与EB相当);当DNA片段小于1kb时,检测灵敏度低于EB,特别是低于500bp的片段, GoldViewⅠ型可能亮度很弱或检测不到。如果检测小片段的DNA,请选用GoldView Ⅱ型核酸染色剂,该染色剂适合于检测所有片段大小的DNA片段。
EB（溴化乙锭）： 溴化乙锭是一种高度灵敏的嵌入性荧光染色剂，为强致癌诱变剂，但价格便宜。它与DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个 溴化乙锭分子。EB的这种特性使其成为一种核酸染料，常用于琼脂糖凝胶电泳中的核酸染色。溴化乙锭在紫外区302nm和366nm处有吸收峰，在紫外光的照射下，溴化乙锭可被激发出橙红色的荧光（590nm）。结合有DNA的溴化乙锭复合物的荧光强度要比没有结合DNA的染 料高出20-30倍，因此溴化乙锭可检测到少至10ng的DNA条带，非常灵敏。 Gel Green和Gel Red： GelRed 和 GelGreen 是两种集高灵敏、低毒性和超稳定性于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色 试剂。 其特点有： 高灵敏度：GelRed 和 GelGreen 是目前市场中最灵敏的凝胶核酸染料之一； 稳定性极好：可以使用微波炉加热，可以在室温下保存； 更安全：艾姆斯氏试验结果表明，该染料的诱变性远小于溴化乙锭（EB）； 广泛的适应性：适用于预制凝胶和凝胶电泳后染色； 染色过程简单：与EB一样，在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解；而电泳后染色过程 也只需30分钟且无需脱色或冲洗； 对 DNA 和 RNA 的迁移影响小：对核酸迁移的影响小于 SYBR Green 。 与标准凝胶成像系统以及可见光激发的凝胶观察装置完美兼容：使用 312nm 激发的 UV 凝胶 成像系统时，GelRed 可以完美的替代EB；使用 254nm 激发的 UV 凝胶成像系统或可见光激 发的凝胶观察装置时，GelGreen 足以替代任意一种 SYB染料。但该染料会使小片段DNA迁 移慢一些（与EB相比). Gold View I型/II型： Goldview对于大片段DNA的染色效果良好，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好， 还有一个很致命的弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。另外Goldview不适用于胶回收。Goldview其实就是AO（丫啶橙，一种剧毒产品）且荧 光效果远不如EB，灵敏度差，本底色严重，不利用于回收，不稳定，在紫外灯下其诱导突 变能力极高 SYBR Green 和SYBR Gold： 稳定性差，也有毒性。它属于花箐素类核酸染料，花箐类染料不是无毒的，而只是低毒的， 电泳级别的是经过修饰的， 修饰有三种： 1.加入卤素或氰基。 2.2.插入环羟基。 3.3.加入稳定剂。SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背 景信号低。SYBR Green和SYBR Gold相对于EB的稳定性要差很多。SYBR系列的染料也能进入细胞染色线粒体以及核内的DNA，从而产生危害。SYBR Green I已被证实在紫外光下 将会产生强诱变能力，使DNA或其他物质发生突变。
电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂： 1. 溴化乙锭(ethidium bromide, EB)最常用的核酸荧光染料，这种扁平分子可嵌入 核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。激发荧光的能量来源于 两个方面，一是核酸吸收波长为 260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为 300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这 两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。EB-DNA 复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需 洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO仲 1h或10mmol/L MgCI2中5min,使非结合的 EB褪色，这样可检查到 10ng的DNA羊品， EB也可用于检测单链 DNA或 RNA但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5卩g/ml的EB,染色可在电泳过程中进 行，能随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大 小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5卩g/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易 分解，应于4 C避光保存。 2. 吖丫啶橙(acridine orange,AO ):吖丫啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外 线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1卩g 和0.05卩g。但吖丫啶橙的染色操作要求严格，应在22 C, 0.01mol/L 磷酸钠缓冲液 (pH7.0 )中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂 4 C脱色过夜或22 C脱色1~2 小时。 3.银(Ag+)试剂：Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNC ) 3 等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏 度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中， 能检测出0.5ng的RNA,其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色， 而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA片 段回收的制备。 4. 亚甲蓝(methylene blue ): 可将RNA染成蓝色，但灵敏度不咼，而且操作时间长。 染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac ( pH8.3 ), 4C放置1~2h , 用净水洗5-8h (反复换水)，带型肉眼可见，最低检测量为250ng。 5. Gold View I型核酸染色剂与溴化乙锭：Gold View是一种可代替溴化乙锭(EB的新 型DNA燃料，其灵敏度与 EB相当，使用方法与之完全相冋。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链 DNA成红色荧光。通过小鼠皮下注射实验，尚未发现Gold View有致癌作用，而溴化乙锭(EB)是一种强致癌剂。因此用Gold View代替EB不失为一种明 智的选择。 实验操作步骤：100mL溶胶液在微波炉中融化，冷却至60C左右(不烫手)后加入10vL Gold View，轻轻摇匀后倒胶，待胶完全凝固后上样电泳，电泳完毕在紫外灯下观察。 注意事项： 1) 胶厚度不要超过0.5cm,胶太厚会影响检测灵敏度 2) 加入Gold View的琼脂样凝胶反复融化可能会对DNA检测的灵敏度产生一定影响，但不 明显。］ 3) Gold View在pH 3.6-7.0 之间能更好的与核酸结合，因此电泳时最好使用新鲜的电泳缓冲液。 4) 由于Gold View产生绿色荧光，因此不适合于用一般单色胶卷拍照，可以使用凝胶成像