ISSN 0582 9879
生物化学与生物物理学报
ACTA BIOCH IM ICA et BIOPHYSICA SINICA 1999,31(3):337-340
CN 31 1300/Q
收稿日期:1999 03 10 接受日期:1999 03 25
*上海生物化学与分子生物学学会1999年年会上交流并推荐
发表;国家自然科学基金(No.39870161)及国家重点基础研究发展规划资助项目
**联系人:T el,021 ******** 4508;Fax,021 ********;e
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研究简报
紫细菌光合反应中心中细菌脱镁叶绿素
被置换后的光化学活性*
曾小华 徐春和** 吴永强 刘先年1
沈允钢
(中国科学院上海植物生理研究所,上海200032;1复旦大学激光化学研究所,上海200433)
摘要 采用新型表面活性剂L DA O,结合DEAE 纤维素层析法,我们提纯了紫细菌R hodobacter sp haeroides 601的光合反应中心。在一定温度和丙酮的协同作用下,外加的植物脱镁叶绿素a 可取代反应中心细菌脱镁叶绿素,形成含有脱镁叶绿素a 的紫细菌光合反应中心(Phe a RC)。当协同作用15min 和60min 时,反应中心中的细菌脱镁叶绿素分别被替代了50%和71%。在Phe a RC 中,细菌脱镁叶绿素的Q X (537nm)和Q Y (758nm)特征峰显著下降,而出现高等植物脱镁叶绿素的Q X (509/542nm)和Q Y (674nm)特征峰。排除温度和丙酮的影响,替代时间为15min 或60min 的Phe a RC 的光化学活性分别为对照的78%或71%。关键词 紫细菌;光合反应中心;脱镁叶绿素;取代;光化学活性
紫细菌R b.sp haeroides 光合作用反应中心(膜结合的色素蛋白复合体)通过一系列快速电子传递步骤将光能转化成化学能[1,2]
。它包含3条多肽(L,M,H 亚基),4个细菌叶绿素a 分子,2个细菌脱镁叶绿素a 分子,2个泛醌分子和1个非血红素铁。所有色素都和LM 亚基结合,并左右对称排列成A 、B 两分支,但只有A 分支具有光化学活性。细菌叶绿素双分子P870经光激发后,产生电荷分离,在3ps 内将电子传递给A 分支的Bphe a (H A ),形成P 870+H -A 。为了进一步了解细菌色素在原初电子传递中的具体功能,采用具有不同氧化还原特性的色素替代反应中心中的细菌叶绿素或细菌脱镁叶绿素是近来新出现的研究途径[3]。本文成功地完成用植物脱镁叶绿素(以下简称脱镁叶绿素)置换光合反应中心中的细菌脱镁叶绿素。1 材料与方法
DEAE 52为Whatman 公司产品。LDAO 为Calbiochem Novabiochem 公司产品。紫细菌RS601细胞的培养见前文[4]。Rhodobacter sphaeroides 601
(以下简称RS601)反应中心吸收光谱的测定用岛津UV 3000双光路双波长分光光度计。蛋白质浓度的
测定采用Folin 酚法[5]。SDS PAGE 参照文献[6]的方法。紫细菌RS601光合反应中心光化学活性在岛津UV 3000上测定,测定波长为870nm 。用700nm 以上的锐截止滤光片透过测量光,用450nm 以下的锐截止滤光片透过作用光。2 色素的制备与测定
以菠菜作为材料,按文献[7]的方法获得植物叶绿素(以下简称叶绿素)粗提液,在4 条件下,进行DEAE Sephaerose CL 6B 柱(柱径1cm,柱高5cm)层析。先用约100ml 石油醚清洗,然后用含0.5%正丙醇的石油醚将植物色素依次洗脱下来,弃去先洗脱的类胡萝卜素,收集接着洗脱下来的叶绿素a ,在N 2中干燥后,溶于吡啶溶液(1g/L)暗中4 保存。脱镁叶绿素的制备及测定按文献[8]。反应中心中细菌叶绿素浓度(C P870和C B800)的测定参照文献[5]的方法。细菌脱镁叶绿素的测定如下:取一定体积反应中心溶液,适当稀释后加入3倍体积的丙酮/甲醇(7 2)溶液,室温放置15min,经4000g 离心5min 后,取上清液,测定细菌脱镁叶绿素特征吸收峰752nm 的光吸收值A 752。细菌叶绿素的特征吸收峰在768nm,计算细菌脱镁叶绿素的浓度时必须扣除细菌叶绿素在752nm 的光吸收值,因此反应中心细菌脱镁叶绿素的浓度可由公
式(1)计算:
C Bphe a =[4A 752 a (C P870+C P800) 768]/ 752
(1)
其中a 为丙酮/甲醇(7 2)溶液中细菌脱镁叶绿素在752nm 和768nm 光吸收之比,等于0.55; 768、 752分别为细菌叶绿素和细菌脱镁叶绿素的摩尔消光系数,为0.76 105
(mol/L)-1
cm -1
和1.54 105(mol/L)-1 cm -1;4是加入丙酮/甲醇溶液后的调整因子。
3 RS601光合反应中心的分离纯化
RS601反应中心的分离纯化按文献[9]修改而成。收集培养的细菌细胞,按1 3(g/ml)的比例溶解于10mmol/L Tris HCl(pH 8.0)缓冲液中。用CSF 1A 超声发生器破碎细胞,12000g 离心30min 。收集上清液,加入LADO 和NaCl,使其最终浓度分别为1%和0.1mol/L 。4 下保温1h 后,260000g 离心1h,收集上清液,加入(NH 4)2SO 4,最终浓度为0.3g/L 。搅拌后10000r/min 离心10min,收集附在管壁上的浮质,溶解并平衡于TL 缓冲液(pH 8.0,含0.1%LADO 的10mmol/L Tris HCl 缓冲液)后,继续徐徐加入(NH 4)2SO 4,收集浓度为0.13~0.25g/L 间的浮质,溶于相同体积T L 缓冲液,平衡6h 后,加样于DEAE 纤维素层析柱上,用0.06mol/L NaCl 的TL 溶液清洗,后用0.12mol/L NaCl 的T L 溶液将反应中心洗脱下来,如A
280/
A 800>1.24,则重新层析一次。SDS PAGE 分
析含有3个亚基,其分子量分别为26.6kD 、30.7kD 、33.1kD,说明获得了纯化的反应中心(数据从略)。
图1(A)为RS601光合反应中心400~800nm 的吸收光谱。870nm 为光合反应中心细菌叶绿素a 双分子P870的特征吸收峰。595nm 、800nm 分别为辅助细菌叶绿素a 不同电子跃迁矩的Q X 、Q Y 峰;537nm 、758nm 分别为细菌脱镁叶绿素a 不同电子跃迁矩的的Q X 、Q Y 峰。870nm 的吸收在光诱导下完全消失(数据从略),代表P870由还原态转向氧化态。所以,RS601光合反应中心的光化学活性可由光诱导下的 A 870表示。
4 脱镁叶绿素替换RS601光合反应中心中的细菌脱镁叶绿素
我们按文献[4]作适当的变更置换RS601光合反应中心内源细菌脱镁叶绿素。取一定体积光合反应中心溶液,加入10%体积含脱镁叶绿素的丙酮溶
液,使脱镁叶绿素/反应中心之比大于20,搅拌后,
Fig.1 Absorption spectra of native reaction centers and modified centers in w hich bacter iopheophy tins were replaced by pheophyt ins at sites H A and H B in T L buffer
(A)Native reaction center from RS601;(B)M odifi ed reaction cen ter w i th incubating ti m e of fifteen mi nutes at 43.5 ;(C)M odified reaction center w ith incubating time of sixty minutes at 43.5 .
在43.5 下共保温一段时间后,在DEAE 纤维素层析柱(DE 52)上用含0.09mol/L NaCl 的TL 缓冲液约600ml 洗去游离的叶绿素后,用含0.15
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Vol.31,No.3
mol/L NaCl的TL缓冲液将修饰的光合反应中心洗脱下来,再将待纯化反应中心溶液铺在10%~40%的蔗糖梯度上,4 下260000g离心16h,从上至下取第二层淡黄色上清液,即得到纯化的替代光合反应中心Phe a RC。其吸收光谱如图1(B)、(C)所示。共保温15min后[图1(B)],反应中心中细菌脱镁叶绿素的Q X、Q Y峰(537nm、758nm)的吸收峰明显下降,674nm和509/542nm处出现3个新的吸收峰,分别为脱镁叶绿素的Q X、Q Y峰;共保温60min后[图1(C)],细菌脱镁叶绿素的Q X、Q Y 峰(537nm、758nm)的吸收峰值均大幅下降,脱镁叶绿素的Q X、Q Y峰(674nm和509/542nm)处的吸收峰明显增加,表明脱镁叶绿素在共保温过程中能够进入细菌脱镁叶绿素位置并取代之。
进一步通过公式(1)计算紫细菌RS601光合反应中心脱镁叶绿素替代前后色素含量的变化。表1
T able1 Pig ment contents in different reaction centers in w hich bacter iopheophytins w er e replaced by pheophytins at sites H A and H B in T L buffer(mol pigments/mol reaction centers)
S amples Pigment contents Incubating for
15mi nutes
Incubati ng for
60minutes
Control BChl a 3.95 0.38 3.93 0.28 Bphe a 2.00 0.15 1.98 0.17 Phe a RC BChl a 3.97 0.26 3.94 0.24 Bphe a 1.00 0.100.58 0.13
Phe a 1.10 0.15 1.52 0.15显示含有脱镁叶绿素的紫细菌光合反应中心中的细菌脱镁叶绿素的含量分别下降为1.00或0.58mol Bphe a/mol RC,脱镁叶绿素分别上升到1.10或1.52mol Phe a/mol RC,而对照反应中心的色素组成没有变化。
以上结果表明,在43.5 温度和有机溶剂丙酮存在的条件下,游离的脱镁叶绿素能够进入反应中心细菌脱镁叶绿素的位置,并取代细菌脱镁叶绿素。
5 细菌脱镁叶绿素被脱镁叶绿素替代后的反应中心光化学活性
实验测定了细菌脱镁叶绿素被脱镁叶绿素替代后的反应中心光化学活性的变化。表2分别为每摩尔对照和替代后光合反应中心的光化学活性。R15和R60为对照反应中心,即反应中心和10%丙酮在43.5 下分别共保温15m in和60min后纯化的反应中心。P15和P60则为相同温度和相同体积的含脱镁叶绿素的丙酮溶液处理后除去剩余色素的反应中心(Phe a RC),两反应中心中部分细菌脱镁叶绿素被脱镁叶绿素所取代。P15为共保温时间为15m in后的Phe a RC,P60为共保温时间为60m in 后的Phe a RC。P15(细菌脱镁叶绿素只剩50%)和P60(细菌脱镁叶绿素只剩29%)的光化学活性分别为对照活性的78%和71%。
以上结果表明,RS601反应中心细菌脱镁叶绿素被脱镁叶绿素替换后,其光化学活性明显下降,但依然保持相当的活性。
T able2 L ight induced bleaching at870nm in modified r eaction centers in w hich bacter iopheophy tins were replaced by pheophy tins at sites H A and H B in T L buffer
Photochem ical activity
Reaction center in control
R15R60
M odified reaction center
P15P60
Bleaching at870nm(mol P870/mol RC)0.125 0.0110.105 0.0090.098 0.0100.075 0.008
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The Photochemical Change in Photosynthetic Reaction Center of
Purple Bacterium with Pheophytin Substitution
ZENG Xiao Hua,XU Chun H e*,WU Yong Qiang,LIU Xian Nian1and SHEN Yun Gang
(S hanghai I nstitu te of Plant Physiology,the Chinese Acade my of S c ience,Shanghai200032,China;
1I nstitu te of L aser c he mistry,Fudan Univ ersity,S hanghai200433,China)
Abstract The reaction centers are isolated from chromatophores of Rhodobacter sp haeroides601by detergent LDAO,and purified by chromatography on a DEAE 52cellulose column.In the presence of acetone and an ac cess of free pheophytins(Phes),bacteriopheophytins(Bphes)in reaction centers are replaced by pheophytins at sites H A and H B w hen incubated under hig h temperature.The substituting amounts are about50%and71% Bphes in reaction centers w ith incubation of fifteen and six ty m inutes respectively.In the absorption spectra of reaction centers containing Phes(Phe RC),the Q X(537nm)and Q Y(758nm)bands of Bphe disappeared,three distinct bands assigned to the Q X(509/542nm)and Q Y(674nm)bands of phe https://www.doczj.com/doc/0a10462445.html,pared to reaction centers in control,the photochemical activities of Phe RCs,with incubating time of fifteen and six ty minutes, drop to78%and71%of that in control respectively。
Key Words Photosynthetic reaction center;purple bacteria;pheophytin replacement;photochemical activity
Recei ved:M arch10,1999 Accepted:M arch25,1999
*Correspondi ng author:Tel,86 21 64042090 4508;Fax,86 21 64042385;e mai l,xch@https://www.doczj.com/doc/0a10462445.html,
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(袁士龙)
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