验证文件
大豆磷脂微生物限度检测方法验证
起草人
起草日期
审核人
审核日期
批准人
批准日期
文件编号
目录
1适用范围 ....................................................................................................................... - 1 - 2目的 ............................................................................................................................... - 1 - 3概述 ............................................................................................................................... - 1 - 4验证所需要的仪器设备及文件 ................................................................................... - 1 - 5可接受的限度范围标准 ............................................................................................... - 2 - 6测试方法 ....................................................................................................................... - 5 - 7异常情况处理 ............................................................................................................. - 15 - 8测试结果 ..................................................................................................................... - 15 - 9结论 ............................................................................................................................. - 15 - 10再验证周期 ............................................................................................................... - 16 - 11附表 ........................................................................................................................... - 16 -
1适用范围
本验证方案适用于大豆磷脂微生物限度检查法的验证。
2目的
建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的
完整性，保证检验结果的可靠性。
3概述
3.1按《中国药典》2010年版附录Ⅺ J《微生物限度检查法方法》的“供试品的制备”项下制备方法2（固体、半固体或黏稠液供试品，取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀,作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀）制备。按“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法1平皿法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证。按控制菌的检查法进行控制菌检查法验证。验证试验使用一批产品进行三次独立平行试验。
3.2验证时间：年月日到年月日
3.3验证产品批号：
4验证所需要的仪器设备及文件
4.1验证需用仪器设备
4.2验证所需要的文件及存放地方
5可接受的限度范围标准
5.1大豆磷脂微生物限度检查质量标准
5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
5.3控制菌检查方法验证结果判断
若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
5.4大肠埃希菌检查结果判断
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24h。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。
当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验M U G 呈阳性，供试品M U G 阳性、靛基质阳性，报告lg 或l m l 供试品检出大肠埃希菌。M U G 阴性、靛基质阴性，报告lg 或l m l 供试品未检出大肠埃希菌。
M U G 阳性、靛基质阴性、I M V i C 试验为一+ ——、革兰阴性杆菌，报告lg 或l m l 供试品检出大肠埃希菌;M U G 阴性、靛基质阳性、I M V i C 试验为+ + — —、革兰阴性杆菌，报告l g 或l m l 供试品检出大肠埃希菌。
供试品培养物检查不符合二项中的任一项，报告l g 或l m l 供试品未检出大肠埃希菌。
当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌，不能做出检验报告。
5.5沙门菌检查结果判断
供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阳性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阳性反应），报告10g 或10ml 供试品检出沙门菌。
供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应及沙门菌属0 多价1 血清凝集试验为阴性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阴性反应），报告lg 或lml 供试品未检出沙门菌。
供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进一步鉴定后，再作报告。
供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阴性反应。
供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价
1 血清凝集反应呈阳性反应。
对已检出沙门菌的供试品分离菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。根据检出菌的特性,推断可能菌型，增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“0”及“H ”凝集试验进行鉴定。
5.6铜绿假单胞菌检查结果判断
供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告lg或lml供试品检出铜绿假单胞菌。
供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告lg或lml供试品检出铜绿假单胞菌。
凡与以上两种结果不符时，报告lg或lml供试品未检出铜绿假单胞菌。
5.7金黄色葡萄球菌检查结果判断
如果革兰染色镜检结果清晰可靠(必要时加做已知革兰染色镜检结果的细菌进行染色质量控制），凝固酶试验阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：
疑似菌革兰染色镜检呈阳性球菌,血浆凝固酶试验阳性反应者，报告lg或lml 供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种）。
革兰染色镜检镜检不是革兰阳性球菌,或血浆凝固酶试验阴性反应，报告lg 或lml供试品禾检出金黄色葡萄球菌。
阴性对照有菌生长，试验结果无效。
阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌活性。
6测试方法
6.1供试品
大豆磷脂，批号。
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。
6.2.2 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、
大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、
黑曲霉CMCC(F)98003、乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094、
铜绿假单胞菌CMCC(B)10104
6.3菌液制备
6.3.1细菌、霉菌及酵母菌检查的菌液制备
6.3.1.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经30～35℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.1.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，经23～28℃培养24～48h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经23～28℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.2控制菌检查的菌液的制备
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许，接种至10 ml营养肉汤培养基内，置30?35℃培养18?24h，取均匀培养物lml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每lml含菌10?lOOcfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
6.3.3供试品制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。
6.4验证试验方法
细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用上述供试品，进行3次平行试验，分别人工
污染上述5种代表试验菌株。控制菌检验方法验证采用上述批供试品进行实验。6.4.1细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验
6.4.1.1试验分组
6.4.1.1.1供试品对照组：
取上述供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底细菌数；
取上述供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底霉菌和酵母菌数；
6.4.1.1.2菌液组：
分别取上述5种试验菌悬液1ml，按菌落计数方法测定所加试验菌数。
6.4.1.1.3试验组：
取1：10供试液1ml注入无菌平皿，分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液各1ml，按平皿法测定其菌数。
取1：10供试液1ml注入无菌平皿，分别加入白色念珠菌和黑曲霉悬液各1ml，按平皿法测定霉菌数。
6.4.1.1.4稀释剂对照组：
取实验用的稀释液1ml代替供试品，加入实验菌，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。
6.4.1.2验证试验操作
6.4.1.2.1取供试品10g，加pH
7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。取上述供试液1ml，注入无菌平皿中，注入15?20ml不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
6.4.1.2.2阴性对照试验
取实验用的稀释液1ml，注入无菌平皿中，注入15?20ml不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，均不得有菌生长。
6.4.1.2.3培养和计数细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数；
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。然后将营养琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落数为计数结果。 6.4.1.3菌数报告规则
以相当于1g 供试品的菌落数报告菌数；若无菌落生长，以<1报告菌数，或<1乘以稀释倍数的值报告菌落数。 6.4.1.4计算公式
试 验组的菌回 收率 % ＝试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数
菌液组的平均菌落数 ×100%
6.4.2控制菌的检查验证试验 6.4.2.1大肠埃希菌
试验组：取1：10供试液10ml 和大肠埃希菌悬液1ml ，接种至100ml 胆盐乳糖
培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 胆盐乳糖培养基中。 阳性对照试验：取大肠埃希菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出大肠埃希菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴
性对照应无菌生长。
大肠埃希菌的试验：
按上述分组接种至100ml 胆盐乳酸培养基中，30～35℃培养18～24小时，必要时可延长至48h 。取上述培养物0.2ml ，接种至含5mlMUG 培养基的试管中，培养，于5h 、24h 在366nm 紫外线下观察，同时用未接种的MUG 培养基作为本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG 阳性；不呈现荧光，为MUG 阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG 阴性和靛基质阴性。 如呈现M U G 阳性、綻基质阴性或M U G 阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品B L 增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1?2 环培养液划线于E M B 或麦康凯琼脂平板上，培养18?24h 。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1 所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。当阳性对照的平板
呈典型菌落生长时，若E M B 或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和I M V i C试验，确认是否为大肠埃希菌。
如E M B 或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1 所列特征相符或疑似者，
以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2?3 个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面,培养18?24h,作以下检査。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于E M B 琼脂平板，培养18?24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养,作以下检查。
革兰染色镜检、镜检
以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均勻涂片，自然或微温，再通过火焰2?3 次干燥使固定。
滴加结晶紫染液，染色lmin,水洗。
滴加碘液,媒染lmin,水洗，以滤纸吸干余水。
滴加9 5 % 乙醇,脱色20?30s,至流出液无色,水洗。
滴加沙黄染液，复染lmin，待干后，镜检。
染色结果
革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色。
大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。
生化试验
乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24?48h，观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色;指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气(小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。
为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5 % 乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于2 4 h出现阳性。或适当延长培养时间。
靛基质试验(I)取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24?4 8h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98% 的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般2 4 h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1 或2 m l培养液进行检查，如錠基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养2 4h，作靛基质试验。
甲基红试验( M ) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培
养48士2 h，于培养液中加人甲基红指示液2 ?3 滴（约每m l 培养液加指示液1 滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
乙酿甲基甲醇生成试验( V - P )取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于2 m l培养液中加入cr萘酚乙醇试液lml,混匀，再加4 0 %氢氧化钾试液0.4ml,充分振摇，在4h(通常在30min)内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验（C ) 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2 ?4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性,培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。
6.4.2.2沙门菌
试验组：取1：10供试液10ml和沙门菌悬液1ml，接种至200ml营养肉汤培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml，接种至200ml营养肉汤培养基中。
阳性对照试验：取沙门菌悬液1ml，同供试品的控制菌检查法检查。
阳性对照试验应检出沙门菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。
沙门菌的试验：
按上述分组，30?35℃培养18?24 h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别吸取lml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18?24h。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别以接种环沾取1?2 环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝（EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24?48h，必要时延长至40?48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。
初步鉴别试验
从每个供试品的分离平板上挑取2?3 个疑似菌落(菌落形态特征与表3 所列的形态特征相符或疑似)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面(或者克氏双糖铁琼脂斜面)并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养18?24h，观察结果。
疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：①斜面红色（产碱），底层黑色（产H2S)并显示黄色(产酸）；②斜面红色，底层黄色;③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，斜面未见红色底层未见黄色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色镜检,镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。
生化试验
靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检査法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。
脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养2 4 h ,观察结果。斜面变为红色为阳性反应,沙门菌属为阴性反应。
氰化钾试验将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20?24h，用接种环沾取培养液1 环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24?48h，观察结果。对照管内有菌生长（混浊），而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（混浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。
本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml去毒。然后再灭菌、洗涤。
赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱竣酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24?4 8 h观察结果。对照管黄色(产酸），试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱）；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。
动力试验用接种针沾取培养物,穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h,观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象;无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状;无动力表现的培养物，应在室温保留2 ?3 天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力试验阳性。沙门菌生化反应的初步鉴别见下表。
针对三糖铁琼脂上的反应，+ 产酸(黄色），阳性，阳性率,> 9 0 % ; —产碱(红色），阴性，阴性率，> 9 0 % ; + / —多数阳性、少数阴性；+ S 产生少量气体; + 阳性，阳性率,> 9 0 % 广阴性，阴性率，> 9 0 % ; + / - 多数阳性、少数阴性，一/ + 多数阴性、少数阳性（本表依据何晓青卫生防疫细菌检验，参考第八版《美国临床微生物手册》）；反应序号1 除典型反应外，脲酶、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验三项中有一项异常；反应序号2仅靛基质阳性;可结合血清学凝集试验，或加做部分生化试验,判定是否为沙门菌,其他情况可排除沙门菌。
血清学凝集试验
准备1 片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm接种环沾取沙门菌属0 多价1 血清2?3 环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹，长约1.5cm，宽约0.5cm。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。
用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。
将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min 内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，
并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min，再观察结果。如果仍然没有出现凝集，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100°C水浴中保温30min，以除去可能存在的V i抗原，待冷，再做凝集试验，如出现凝集,仍判为阳性反应;如不出现凝集现象，则为阴性反应。
如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验。
6.4.2.3铜绿假单胞菌
试验组：取1：10供试液10ml和铜绿假单胞菌悬液1ml，接种至100ml胆盐乳糖培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml，接种至100ml胆盐乳糖培养基中。
阳性对照试验：取铜绿假单胞菌悬液1ml，同供试品的控制菌检查法检查。
阳性对照试验应检出铜绿假单胞菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。
铜绿假单胞菌的试验：
按上述分组，于30?35℃培养18?24h(必要时可延至48h)。阴性对照菌应无菌生长。轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1?2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于30?35℃培养18?24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象,在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和黏液型等，应注意挑选。
纯培养
供试品分离平板生长典型菌落或呈疑似菌落时，以接种计轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2?3 个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面,培养，作以下检查。
革兰染色镜检
铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。
生化试验
可用铜绿假单胞菌〔C M C C (B) 10104〕做生化试验的阳性对照株。
氧化酶试验
取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1 滴新配制的1 % 二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30S 内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。
本试验应注意：
( 1 )试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠。
( 2 )试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种计（环）（白金材料除外）挑取菌（苔），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。
( 3 )试剂宜新鲜配制，放置过久,二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。( 4 )反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应。
( 5 )麦康凯、S S培养基等含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性。
绿脓菌素试验
取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（P D P )斜面上，30?35°C培、养24h后，观察斜面有无色素，如有色素,在试管内加三氯甲烷3 ?5 m l，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在三氯甲烷内。静置片刻，待三氯甲烷分层，用吸管将三氯甲烷移至另一试管中，加入盐酸试液（lmol/L)约1ml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的P D P 琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应当呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1?2天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。
硝酸盐还原产气试验
以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置30?35°C培养24h，观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐,并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。
42°C生长试验
以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0 . 9 %无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置41°C士1°C的恒
温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24?48h,斜面如有菌苔生长者为阳性反应;无菌苔生长为阴性反应。
明胶液化试验
以接种计沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于30?35°C培养24h。取出放入0?4°C冰箱内10?30min。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应;如明胶呈凝固状，为阴性反应。
本试验应注意：
( 1 )本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。
( 2 )试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。
6.4.2.3金黄色葡萄球菌
试验组：取1：10供试液10ml和金黄色葡萄球菌悬液1ml，接种至100ml营养肉汤培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml，接种至100ml营养肉汤培养基中。
阳性对照试验：取金黄色葡萄球菌悬液1ml，同供试品的控制菌检查法检查。
阳性对照试验应检出金黄色葡萄球菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。
金黄色葡萄球菌的试验：
按上述分组，置30?35℃培养18?24h(必要时可延至48h)。阴性对照应无菌生长。
将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取1?2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30?35℃培养24?72h。当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于金黄色葡萄球菌特征，可报告为lg或lml 供试品未检出金黄色葡萄球菌。
纯培养
当供试品分离平板生长菌落与表1 所列菌落特征相似或疑似时，应选取2 ?3 个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于30?35°C培养18?24h，取营养琼脂斜面培养物作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于30?35°C培养18?2 4 h做血浆凝固酶试验。
革兰染色、镜检
金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌,无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则
的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。
血浆凝固酶试验
试管法:取无菌试管（l O m m X 1 0 0 m m ) 3支，各加人血浆和0. 9 % 无菌氯化钠溶液（1 : 1)0. 5ml, 1 支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液>0. 5 m l，其余2 支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌[ C M C C ( B ) 2 6 0 0 3 ]培养物菌悬液或营养肉汤培养液0. 5 ml作为阳性对照;另一支加入营养肉汤或0. 9 % 无菌氯化钠溶液0. 5 m l作阴性对照。三管同时置37°C水浴或恒温培养箱，3 h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。
检査时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管血浆呈凝固状，试验管呈凝固者为阳性反应;不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。
7异常情况处理
严格按照《微生物限度检查法SOP》操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的大豆磷脂的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。
8测试结果
8.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表1。
8.2控制菌的检查方法验证结果见附表2～5。
8.3按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表6。
9结论
9.1按照《大豆磷脂检验操作规程》，我们设定了该产品的微生物限度检验方法，
对批次大豆磷脂进行了微生物方法学验证，结果各项指标标准规定，证明该标准操作规程检验需要， GMP要求，使用。
9.2通过检验，各项指标的回收率均大于70%，说明大豆磷脂用平皿法检验无抑菌性，故适用于大豆磷脂的微生物检验。确定大豆磷脂微生物限度检查法如下：
质量负责人：审核人：检验人
10再验证周期
10.1大豆磷脂的处方发生变动或其它因素变更导致大豆磷脂的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
11附表
实验日期：报告日期：检验人：复核人：质量部QA: 统计日期：
附表2：大肠埃希菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂批号：
实验日期：报告日期：检验人：复核人：质量部QA: 统计日期：
- 1 -
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告
目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批） 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种
3 试验环境 《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
表：微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表： 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表： （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
化妆品微生物限度记录 化妆品微生物限度测定记录编号 REC-QC-HZP001-00 页码第1页共2页产品名称检验依据 SOP-QC-HZP002-00 批号规格检测日期年月日序号操作指令操作记录 称取样品10g，加入90ml 稀释液名称稀释液，混旋，充分溶解，1. -1-1作为10供试液，取10天平型号样品供试液1ml至灭菌试管准备中，加入9ml灭菌生理盐样品称重 g -2水，作为10，同样递增-3稀释级数稀释至10 计数阴性 -1-2-3取3个稀释级的供试液各10 10 10 结果对照 1ml，注入12个平皿中。 菌落 2. 每个稀释级加4只平皿，总数1 菌落总其中2只注入熔化的营养数、霉琼脂培养基，2只注入熔菌落菌酵母化的虎红培养基，另取2总数2 菌检测只平皿作阴性对照。细菌霉菌1 于36?培养48小时，霉菌在25-28?，培养72 霉菌2 小时(取出计数 细菌选取平均菌落数在 30-300之间的稀释级，霉菌落总数(个/g) 3.结果菌选取平均菌落数在 30-100之间的稀释级报霉菌酵母菌总数(个/g) 告 培养及试验供试品结果 双倍浓度乳糖胆盐培养双倍乳糖胆盐基44?培养24h-48h，如培养基培养后产酸产气，取上述伊红美蓝 4. 培养液划线接种伊红美琼脂平板粪大肠蓝琼脂平板，36?培养
菌群 24h，如有典型菌落，挑革兰氏染色 取典型菌落进行革兰氏 染色镜检，并做靛基质试靛基质试验 验 结论 化妆品微生物限度测定记录编号 REC-QC-HZP001-00 页码第2页共2页产品名称检验依据 SOP-QC-HZP002-00 批号规格检测日期年月日序号操作指令操作记录 培养及试验供试品结果取供试液10ml接种 90ml SCDLP中36?1?SCDLP 增菌培养18-24小时。 十六烷基三取培养液划线接种十六甲基溴化铵烷基三甲基溴化铵琼脂 平板36?1?培养5. 革兰染色 18-24h，如有可疑菌落，铜绿假进行染色镜检。革兰染单胞菌氧化酶试验色为阴性菌时进行氧化 酶试验及下面的生化试生化试验1，2 验:1.绿脓菌素试验， 2.硝酸盐产气试验，生化试验3，4 3.42?生长试验， 4.明胶液化试验结论 血琼脂 取供试液10ml接种 BP平板 90mlSCDLP中 36?增菌 培养18-24小时。取增 革兰氏染色 6.金黄菌液划线接种血琼脂平 色葡萄板或Baird-Parker平板甘露醇发酵球菌 36?培养24h,48h，挑试验取可疑菌落进行革兰氏血浆凝固酶染色甘露醇发酵试验和试验血浆凝固酶试验结论
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
无菌检查和微生物限度检查操作规范 （中国药品生物制品检定所） 一、无菌室的要求： 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备： 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。 2、培养基灵敏度试验： 培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查： （1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。 （2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。应煮沸去氧，只限加热一次。 4、培养基的保存时限： 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏： 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法： 取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
微生物限度检验方法验证记录 1.适用范围 本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。 2.目的 通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，确保该产品微生物限度检查结果的正确 性。 3.职责 项目责任人:负责验证方案的起草及具体实施。 验证管理员:负责验证工作的组织、协调及管理。 QA现场监控员:负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。QC负责人:负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责 组织实施。 QC检验员:负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。质量部经理:负责验证方案及报告的审核和批准。 4. 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件， 按制定的方法进行实验，根据实验结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的 微生物限度检查;若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的
验证标准。 5.检查和确认 5.1微生物限度检验室，洁净级别1万级;超净工作台，局部100级(确认方法: 审阅相关的验证资料)。 微生物限度检验室(洁净级别1万级)验证报告 超净工作台(洁净级别100级)验证报告 检查结论:验证资料完整，符合相应洁净度要求且在有效期内。检查人: 日期: 5.2与验证相关的文件(确认方法:检索)。 微生物限度检查法操作规程和检定菌传代操作规程 净化工作台使用操作规程 微生物限度检验室清洁消毒规程 培养箱标准操作规程 检查结论:验证所需资料齐全、完整，符合验证要求。 检查人: 日期: 5.3检验用仪器设备(确认方法:检查、核对)。 符合3Q(IQ、OQ、PQ)要求。 5.3.1 培养箱 型号: HP400S 生产厂家: 武汉瑞华仪器设备有限公司 校验有效期至: 年月日 设定温度: 32.5? 型号: PYX-280S-A 生产厂家: KELI 科力仪器 校验有效期至: 年月日
附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置
微生物限度检验 1概述：微生物限度检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。饮用水，纯化水，注射用水、及其他完全溶解并能通过滤膜的样品，采用薄膜过滤法进行检查；精制卡介菌多糖核酸等其他不完全溶解或无法通过滤膜的样品，采用直接接种法进行检查。 2设备、仪器及用具 2.1 设备净化工作台、生物安全柜、恒温培养箱(30～35℃)、霉菌培养箱(23～28℃)，恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱(180℃～300℃)、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、365nm紫外灯、显微镜、集菌仪、薄膜过滤装置等。 2.2 用具 2.2.1 玻璃器皿用前应洗涤干净,无残留抗菌物质。于180℃干热灭菌2小时以上或250℃干热灭菌30分钟以上（仅适用于玻璃器皿或不锈钢用具），或高压蒸汽121℃湿热灭菌30min,50～60℃烘干备用。 2.2.3 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套,用牛皮纸包严）、移液管、试管、接种环、孔径0.45UM且直径50的微孔滤膜灭菌,备用。也可用一次性无菌口罩、手套。 2.2.3 酒精灯、乙醇棉球、打火机、实验记录纸等。 2.2.4经灭菌处理的用具存放时间不超过48小时，否则需重新灭菌后方可使用。 3稀释液 PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。 4培养基及试液 4.1 细菌检查用酪蛋白大豆营养琼脂培养基。 4.2 霉菌、酵母菌检查用沙氏培养基、（玫魂红钠琼脂培养基）、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）。 4.3 大肠埃希菌检查用胆盐乳糖(BL)培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基、靛基质试液、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、枸橼酸盐培养基。 4.4 大肠菌群检查用乳糖胆盐发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基。 4.5稀释液 0.9%氯化钠溶液或PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 4.6 培养基制备应注意: 4.6.1 配制的培养基应测定PH值，确保灭菌后培养基的PH值符合相关培养基的要求。并且，不能有沉淀,如有沉淀,应于溶化后趁热过滤,灭菌后使用。灭菌条件为：121℃蒸汽灭菌20分钟。 4.6.2 培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。包装时塞子必须塞紧,免松动或脱落造成染菌。 4.6.3 培养基配制后应在2小时内灭菌,避免细菌繁殖。
文件编号：SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司
1/11
验 证 文 件
目 录
1 2 3 4 5 6 7 8 9
适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表
2/11
验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的 完整性，保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间：************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表2培养基
表3对照用培养基 表4试剂 稀释液： （1）pH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。 （2）0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 （3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。 （4）靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。 三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入 5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证 将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。 经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。 2、适用性检查 2.1细菌、霉菌、酵母菌 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72
word格式文档 微生物限度检查方法适用性试验方案
验证方案组织与实施 微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。 方案起草 方案审核 方案批准
目录 一、概述 二、验证目的和风险评估 三、验证内容 四、方法判定 五、再验证周期 六、参考文献 七、结果评价及结论
1、概述： 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。 依照中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。 2、试验目的和风险评估： 验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。 风险评估： 3、验证内容： 3.1、培养基来源： 确认人：确认日期： 3.2、检查用培养基配制方法：
确认人：确认日期：3.3、使用仪器 确认人: 确认日期：3.4、验证试验用菌种： 确认人：确认日期： 3.5试验方法：
取供试品10 ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。 3.6菌液的制备： 3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 3.6.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养24～48h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 3.6.3取黑曲霉的新鲜培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10～7，取，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 3.7需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验： 3.7.1供试液制备： 取供试品10 ml，加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。 3.7.2实验条件： 需氧菌培养温度：30～35℃ 3～5天培养箱： 霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃ 5～7天培养箱： 3.7.3试验方法： 3.7.3.1试验组： 3.7.3.1.1分别取供试液9.9ml，分别加入0.1ml浓度为1000CFU的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，混匀后取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。 3.7.3.1.2分别取供试液9.9ml，分别加入0.1ml浓度为1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过