第４８卷第４期２００９年４月
Vol. 48, No. 4Apl. 2009
农 药
AGROCHEMICALS
枯草芽孢杆菌对土壤呼吸作用和脲酶活性的影响
魏海燕１，２，蔡磊明１，赵玉艳１，谭头云２，李肇丽３，段亚玲２，魏 敏１
（１．沈阳化工研究院 安评中心，沈阳 １１００２１；
２．新疆农业大学，乌鲁木齐 ８３００５２； ３．辽宁大学， 沈阳 １１００３６）摘要：通过模拟实验研究了微生物农药枯草芽孢杆菌对黑土的呼吸作用和脲酶活性的生态毒理效应。 结果表明：枯草芽孢杆菌各质量分数处理均表现为对土壤呼吸作用的刺激效应，并且土壤中枯草芽孢杆菌质量分数越大，对土壤呼吸强度的刺激作用越大，其中最高质量分数（３２００ ｍｇ／ｋｇ干土）处理在第４２天时达到最大刺激强度，刺激率为６９．１％。 与对照相比，除第１天外，所有处理（３２￣３２００ ｍｇ／ｋｇ干土）对土壤脲酶均表现出刺激效应，其中最高质量分数（３２００ ｍｇ／ｋｇ干土）处理在第２８天脲酶活性上升到最高，刺激率达到１０１．１％。关键词：枯草芽孢杆菌；土壤呼吸；脲酶活性
中图分类号：ＴＱ４５３．５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００６－０４１３（２００９）０４－０２５５－０３
Effect of Bacillus subtilis on Microbial Respiration and
Urease Activity in Phaeozem
WEI H ai-yan 1,2, C AI L ei-ming 1, Z HAO Y u-yan 1, T AN T ou-yun 2, L I Z hao-li 3, D UAN Y a-ling 2, W EI M in 1
(1.Safety Evaluation Center, Shenyang Research Institude of Chemical Industry, Shenyang 110021 China;2.Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 3.Liaoning University, Shenyang 110036, China)
Abstract: The effects of Bacillus subtilis on microbial respiration and urease activity in phaeozem were studied by simulated methods in lab condition. The result showed that soil respiration was stimulated in the whole incubation
process, the higher concentration the greater influence, high dose(3200 mg/kg dried soil) of Bacillus subtilis applied into phaeozem had significant stimulated effect on soil respiration at 42 d, stimulation ratio was 69.1% compared with control The activity of urease in soil treated with Bacillus subtilis (32-3200 mg/kg dried soil) was stimulated except the first day, high dose (3200 mg/kg dried soil) of Bacillus subtilis had significant stimulated effect on the activity of urease at 28 d, stimulation ratio was up to 101.1%.
Key words: Bacillus subtilis ; soil respiration; urease activitiy
土壤微生物是构成生态环境的重要组成部分，它不仅在植物枯枝分解、养分循环、土壤结构、氮的固定和其他土壤性质改变中起重要作用；而且许多环境污染物的降解（包括农药）和脱毒作用也由土壤微生物完成。 因此，在判定生态系统是否受到干扰或污染时，土壤微生物是一种最灵敏和最有用的生物学指标［１］。
枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种微生物杀菌剂，属于芽孢杆菌属细菌性杀真菌剂，已在１９９８年作为农药登记［２］。 作为拮抗微生物，枯草芽孢杆菌通过竞争性生长繁殖而占居生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使植物病原菌得不到生存空间，从而保护了农作物免受病原菌为害。
枯草芽孢杆菌对植物多种真菌性病害具有很好防治作用，对水稻稻瘟病，西瓜、黄瓜、草莓、番茄等多种作物白粉病、灰霉病，马铃薯晚疫病，大豆、油菜菌核病，瓜类、谷物、三七等作物根腐病，棉花黄萎病，西瓜枯萎病等多种真菌性具有优良防效。 国内外学者已对其防治效果进行大量研究［３－６］，但对其使用后给土壤微生物活性产生的影响鲜有报道。 本文探讨枯草芽孢杆菌对土壤微生物的呼吸强度和土壤脲酶活性的影响，旨在了解其土壤微生物生态效应，间接反映该药对土壤肥力和环境的影响，以期为该药的合理施用和环境毒性评价提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试土壤
供试土壤采自东北吉林公主岭黑土（０￣１５ ｃｍ土层），土
壤类型为壤土。
取回的土壤置于室温自然晾干，磨碎过筛（８５０ μm ），
供试土壤的基本理化性质见表１。收稿日期：２００８－１０－２９，修返日期：２００９－０２－２４
作者简介：魏海燕（１９８１—），女，安徽明光人，在读研究生，从事农药安全评价研究。 Ｅ－ｍａｉｌ ：ｗｅｉｈａｉｙａｎ０６２２＠１６３．ｃｏｍ。通讯作者：蔡磊明。 Ｅ－ｍａｉｌ ：ｃａｉｌｅｉｍｉｎｇ＠ｓｉｎｏｃｈｅｍ．ｃｏｍ。
表１ 实验土壤的理化性质
有机质含量／ 机械组成／％
阳离子交换量／ｐＨ值（ｇ?ｋｇ－１
）１￣０．２５ ｍｍ０．２５￣０．０５ ｍｍ０．０５￣０．０１ ｍｍ
０．０１￣０．００５ ｍｍ０．００５￣０．００１ ｍｍ
＜０．００１ ｍｍ［ｃｍｏｌ（＋）?ｋｇ－１
］
（水浸）６０．３１７
２７．７０１
１５．５１２
２２．６７８
５．６５９
８．５０９
１８．８０５
４５．５２０
５．６７
注：土壤为黑土、壤土。
科研与开发－
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农 药 AGROCHEMICALS
１．２ 供试农药
１０００亿活芽孢／克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，由黑龙江强尔生化技术开发有限公司提供。
１．３ 实验方法
１．３．１ 预培养
称取２００ ｇ土样加入２５０ ｍＬ三角瓶中，加入一定量蒸馏水调节土样的含水量至田间持水量的６０％左右。 用保鲜膜封住三角瓶口以减少水分挥发，并用针在保鲜膜上刺３０个左右小孔保持瓶内的通气。 土样放于（２８±１） ℃恒温培养箱中预培养７ ｄ，每３ ｄ依称量记录补加损失水分。１．３．２ 实验设计
实验设５个处理，每个处理３次重复，其中１个处理设为空白对照（ＣＫ），其他４个处理中分别加入不同量的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，使其质量分数分别为３２、３２０、１０１２、３２００ ｍｇ／ｋｇ干土。 搅拌混匀，继续培养，在添加枯草芽孢杆菌后的１、３、７、１４、２１、２８、３５、４２ ｄ取样，测定土壤微生物呼吸强度和脲酶的酶活性。
１．４ 测定方法
土壤中微生物呼吸强度的测定参见文献［７］，脲酶的测定参见文献［８］。 土壤中微生物呼吸强度以每克干土中所释放二氧化碳的毫克数表示；脲酶活性以２４ ｈ后每克干土中ＮＨ
３－
Ｎ的毫克数表示。
１．５ 数据分析
所有数据用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３计算处理，显著性测验采用ＳＰＳＳ １３．０ 处理。
２ 结果与分析
２．１ 多重比较结果
多重比较分析是利用ＳＰＳＳ１３．０软件的Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ过程进行的，该方法是以空白作为对照，以添加枯草芽孢杆菌的处理与空白对照进行比较，分析处理与对照之间的差异是否显著。 结果见表２。
表２ 各处理与空白对照的比较结果
处理／培养天数／ｄ
（ｍｇ／ｋｇ干土）１３７１４２１２８３５４２呼吸作用３２－－－＋－－－－３２０－－－＋－－－－
１０１２＋＋－＋＋＋－－
３２００＋＋＋＋＋＋－＋
脲酶３２－－＋－－＋－－３２０－＋＋＋＋＋＋－
１０１２＋－＋＋＋＋＋＋
３２００＋＋＋＋＋＋＋＋注：“＋”表明处理与对照之间差异显著；
“－”表明处理与对照之间差异不显著。２．２ 枯草芽孢杆菌对土壤微生物呼吸强度的影响土壤呼吸强度作为土壤生物活性指标之一，能够在一定程度上反应土壤营养物的转化和供应能力，其呼吸速率变化及变化方向也反应了生态系统对胁迫的敏感程度和响应模式，是环境安全评价的一项重要指标，当土壤受到外来污染物污染时，微生物为了维持生存可能需要更多的能量，而使土壤微生物的代谢活性发生不同程度的响应［９］。
图１为枯草芽孢杆菌对土壤呼吸作用的影响。 由图１可知：各质量分数处理的枯草芽孢杆菌均表现为对土壤呼吸作用的刺激效应，并且土壤中枯草芽孢杆菌质量分数越大，对土壤呼吸强度的刺激作用越大，即刺激强度和施药质量分数呈正相关。 在整个培养期内，３２、３２０ ｍｇ／ｋｇ干土这２个较低质量分数的枯草芽孢杆菌，除第１４天，其对土壤呼吸的刺激作用都不显著，而较高质量分数的枯草芽孢杆菌（１ ０１２￣３ ２００ ｍｇ／ｋｇ干土）才显示出对土壤微生物呼吸强度的明显刺激作用（见表２），其中３２００ ｍｇ／ｋｇ干土的质量分数处理在第４２天时达到最大刺激强度，刺激率为６９．１％。
图１ 枯草芽孢杆菌对土壤呼吸作用的影响
２．３ 枯草芽孢杆菌对土壤脲酶活性的影响
应用土壤酶作为监测指标，评价农药的生态毒理效应已成为环境科学领域的研究热点之一［１０－１２］。 而脲酶属于土壤中研究得比较深入的一种水解酶类，是惟一对尿素在土壤中转化及尿素利用率有重大影响的酶。 尿素施入土壤后，在脲酶的催化作用下，迅速分解成二氧化碳和氨［１３］，所以土壤脲酶活性的降低，不仅可使尿素水解减缓，令其水解产物更多地被土壤吸附而有效减少尿素水解产物氨的挥发损失，也可能相应减少水解产物ＮＨ
４
＋硝化作用潜势。
图２为枯草芽孢杆菌对土壤脲酶活性的影响，从图２可以看出：在整个培养期内，所有处理的脲酶活性均表现为先缓慢上升，后缓慢下降的趋势，并且与对照相比，除第１天外，所有处理（３２￣３２００ ｍｇ／ｋｇ干土）对土壤脲酶均表现出刺激效应。 ３２、３２０ ｍｇ／ｋｇ干土处理分别在培养的第７天和第２８天达到最大刺激强度，刺激率分别为１４．６６％和４１．２５％，随着培养时间的延长，这２个处理的脲酶活性在实验第４２天恢复至对照水平；而１０１２、３２００ ｍｇ／ｋｇ干土处理的土壤脲酶活性与对照相比，其刺激作用几乎都达到显著水平（见表２），枯草芽孢杆菌质量分数越高，
土壤脲酶活性越高，
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图２ 枯草芽孢杆菌对土壤脲酶活性的影响
３ 结论与讨论
由于对外来物质具有高度的敏感性，土壤微生物和土壤酶常用于评价土壤生态环境，将其作为一项生态毒理学指标，用以判断外来物质对土壤的污染程度及可能对生态环境造成的影响［１４－１５］。 通过研究在设定不同质量分数条件下微生物农药枯草芽孢杆菌对土壤微生物呼吸强度、脲酶活性这２个指标的影响，初步得到以下结论：
１）各质量分数处理的枯草芽孢杆菌均表现为对土壤呼吸作用的刺激效应，并且土壤中枯草芽孢杆菌质量分数越大，对土壤呼吸强度的刺激作用越大。 其中最高质量分数（３ ２００ ｍｇ／ｋｇ干土）的处理在第４２天时达到最大刺激强度，刺激率为６９．１％左右。 造成这种现象的原因可能是因为在土壤中存在着某类微生物，它们可以利用微生物农药枯草芽孢杆菌作为碳源和营养物质，从而促进了微生物的分解，或其本身的降解也能释放二氧化碳。
２）与对照比，除第１天外，所有处理（３２￣３ ２００ ｍｇ／ｋｇ干土）对土壤脲酶均表现出刺激效应。 其中最高质量分数处理（３ ２００ ｍｇ／ｋｇ干土）在第２８天脲酶活性上升到最高，刺激率达到１０１．０７％。 枯草芽孢杆菌对脲酶刺激的机理，可能是由于微生物农药的加入为微生物的生长提供了碳源和营养，从而使产生该种酶的微生物数量增长，活性增强，因而土壤中脲酶的活性也相应增强。
３）微生物农药枯草芽孢杆菌对土壤呼吸作用及脲酶活性总体上呈现的是一种刺激作用，并且低质量分数处理
（３２、３２０ ｍｇ／ｋｇ干土）在短期内是可以恢复到对照水平的。因此，从对土壤微生物的影响而言，枯草芽孢杆菌是一种比较安全的微生物农药。
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责任编辑：赵平
刺激作用越明显。 ３２００ ｍｇ／ｋｇ干土处理在第２８天脲酶活性上升到最高，刺激率达到１０１．１％
。
魏海燕，等： 枯草芽孢杆菌对土壤呼吸作用和脲酶活性的影响