题目：质粒DNA的提取及检测
一．实验目的:
1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；
2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理
1. 质粒 (Plasmid)：
一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
3.分离质粒DNA：
（1）培养细菌使质粒扩增；
（2）收集和碱裂解细菌；
（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法
（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl
作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解
（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制
作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性
（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水
作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳
带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线
性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒
在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、
闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉
开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料
含量有关。
三．实验材料及设备
1.实验材料：
（1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）；
（2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：
2.实验仪器：
（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；
（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。
3.实验试剂：
（1）质粒的提取
培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调;
b.溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；
c.氨苄青霉素(50mg/mL)；
d.抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）
作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。
e.无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。
%乙醇作用：纯化质粒DNA。
缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA
（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测
a. Gold view（DNA染料）
×TAE缓冲液
c.上样缓冲液（6×）
四．实验方法及步骤
1.质粒DNA的提取
a)将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉
素50μg/mL），370C培养过夜；
b)取培养菌液置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液；
c)加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min；
d)加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰
上放置5 min；
e)加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，
产生白色絮状物，冰上放置15 min；
f)10000rpm× 5 min，取上清液于另一干净的离心管中；
g)向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，
v/v），振荡混匀，10000rpm × 10 min，将上清液转移至新的离
心管中；
h)加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm
× 2min ,取上清液于新离心管中；
i)向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -200C放置1h；
j)12000rpm × 5 min，倒去上清液，吸干液体；
k)加800μL70%乙醇，离心12000rpm × 1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味；l)加20μL ddH2O ，混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-200C保存备用。
2.DNA琼脂糖凝胶电泳检测
a)琼脂糖凝胶板的制备
b)称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加
热直至琼脂糖溶解;
c)待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，
搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内,静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子;
3.加样
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（ 6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。
4.电泳
将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V 左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm 处，停止电泳。
5. 观察和拍照
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm 的紫外灯下，观察凝胶中DNA 存在处显示出荧光条带。
五． 实验结果
图 1碱裂解法提取pEGFP-N3与pET-28A-c 质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果 Marker pET-28a-c pEGFP-N3
A 带：15000bp
D 带5000bp B 带10000bp
C 带7500bp
F 带1000bp
G 带250bp
E 带3000bp
说明：从左到右依次为：pEGFP-N3、pET-28A-c、DL15000Maker
所提取的质粒DNA可通过琼脂凝胶电泳进行检测。一般情况下，提取的质粒为3条带。在细胞内，质粒DNA是共价闭合环状DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA；若两条链在同一处或相近的部位断裂，则变成线性DNA分子。
在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其速度从大到小的次序为：cccDNA>线性>ocDNA，共价闭环DNA的泳动速度最快，电泳速度最快的条带显色最深。但在优化条件下，如在冰浴中或使用试剂盒提取时，可以只出现一条带或主要出现一条带，即超螺旋带。
由图可知，本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带。实验结果较好。
六．结果讨论与结论：
1.实验结论：
通过碱裂解方法，我们将细菌的质粒变性提出，又通过多个洗涤、纯化步骤，得到了提纯的质粒，在最后的本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带,
实验结果较好。
2.讨论一：溶液II为什么现配现用而且需放置在常温下答：
溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应变质，导致溶液ⅡpH下降，无法达到很好的裂解效果；溶液中SDS成分在温度较低环境下由于溶解度下降导致析出，溶液失去效果。
3.讨论二：抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇）的作用。氯仿：
异戊醇为什么加两次
作用：使样品中杂质蛋白变性析出，被抽提出样品；第二次加入异戊醇目的为洗净上一步抽提中样品残留的饱和酚。
4.讨论三：实验中无水乙醇与70%乙醇的作用。
用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂. DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合；70％乙醇的作用不是沉淀DNA，而是通过漂洗上一步得到的沉淀，使沉淀中的盐溶解，从而进一步纯化DNA。
5.讨论四：电泳检测中忘加指示剂会出现什么情况拔梳子和
点样步骤的注意事项。
如果没有指示剂，则无法准确追踪电泳的进度。容易导致电泳不足或者过度。
拔梳子时，应当动作轻缓，轻微左右摇晃使梳子缓慢脱出。注意不要前后摇晃，导致跑胶起点不一或者胶板变形。
点样时，枪口要深入凹槽底部，但又不能使枪口触碰挤压胶板。
叶绿体色素的提取分离、理化性质实验报告 第一部分提取与分离 一实验目的 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法 二实验原理 叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿体a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H72O6N4Mg)、胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离与鉴别。 薄层色谱分析法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层做固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上的逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。 三实验材料与试剂 1 新鲜的菠菜叶片 2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂(石油醚:丙酮:苯=7:5:1，体积比) 3 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸 四实验步骤 (一)色素提取液的制备 1 取新鲜叶片4至5片(2g左右)，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。 2 研钵中加入少量碳酸钙粉末，加2至3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10至15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存。 (二)叶绿体色素的分离 1 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘约1cm处用毛细管划线，风干后再划第二次，重复操作3至4次。 2 在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放下，使其浸入展开剂中(但不要使待测样品浸入展开剂中)。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可以看到各种色素的色带。 3 当各种色素的得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液（400g/L） 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L］或盐酸标准溶液［c（HCl） 0.0500mol/L］ 3.5硼酸溶液（20g/L） 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋（2.47g） 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。 放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
叶绿体中色素的提取和分离 一、实验目标 1、知识方面 （1）探究叶绿体中含有几种种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系 （2）了解纸层析法的原理。 2、能力方面 掌握提取和分离叶绿体中色素的方法。 3、情感态度与价值观方面 认识生物科学的价值，乐于学习生物科学，养成质疑、求实、创新及勇于实践的科学精神和科学态度 二、实验原理 1、色素提取的原理：叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中，故可用丙酮和无水乙醇提取色素。 2、色素分离的原理：叶绿体中的各种色素在层析液中的溶解度不同。溶解度大的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度快；溶解度小的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度慢。三、实验准备 实验材料：新鲜的绿叶（如新鲜菠菜叶片）。 实验仪器及用具：定性滤纸，研钵，玻璃滤斗，脱脂棉，尼龙布，毛细吸管，剪刀，药勺，量筒（10mL），天平，试管，试管架，滴管，培养皿，三角瓶，烧杯 试验试剂：无水乙醇（或丙酮），层析液（CCl4），石英砂（SiO2）和碳酸钙（CaCO3） 四、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取菠菜新鲜叶片5g，洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。 （2）向研钵中加入少许碳酸钙和二氧化硅，再加10mL无水乙醇，进行迅速、充分研磨（二氧化硅有助于研磨得充分，碳酸钙可防止研磨中色素被破坏）。 （3）将研磨液迅速倒入漏斗（漏斗基部放一块单层尼龙布）中进行过滤。将滤液收集到试管中，及时用棉塞将试管口塞严。 2、制备滤纸条 用预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长10 cm、宽1cm的滤纸条，在滤纸条的一端剪去两角（防止层析液在滤纸条的边缘扩散过快），并在距离这一端1cm处用铅笔画一条细的横线。 3、画滤液细线 用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。待滤液干后，再画二三次。 4、分离叶绿体中的色素
蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,
基因工程实验报告
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期： 2
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程： 片段胶 小麦幼苗小麦总RNA RT-PCR扩增小麦pGEX-4T-1 表达载体 表达菌株 目的蛋白 目的蛋白 Western
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心
叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。 2. 叶绿体色素的分离 (1)将11cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条。 (2)用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。 (3)在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中，而色点略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。 0.5-1小时后，观察色素带分布：最上端橙黄色(胡萝卜素)，其次黄色(叶黄素)，再崐次 蓝绿素(叶绿素a)，最后是黄绿色(叶绿素b)。（4）当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实 验，此时可看到不同色素的同心圆环，各色素由内往外的顺序为：叶绿素b（黄绿色）、叶 绿素a（蓝绿色）、叶黄素（鲜黄色）、胡萝卜素（橙黄色），再用铅笔标出各种色素的位置 和名称。
基因工程综合实验报告 A型产气荚膜梭菌α毒素基因克隆及表达 班级生物工程081班 姓名盖雪 学号08771029 指导教师高凤山 实验时间2011.10.10-10.14 成绩
一、实验原理 二、主要试剂 DNA Ligation Kit Ver.2.0; Eco RI、Bam HI限制性内切酶；含15%甘油的 0.1mol/L CaCl2，20-30mL。无菌;0.1mol/L CaCl2 , 20-30mL ；50%甘油（无菌，保存菌种用，50mL）4×25mL LB液体培养基(现配现用)，卡那霉素（Kan）100mg/mL配2mL（过滤），X-gal 二甲基甲酰胺配成20mg/mL 配2mL; IPTG 24mg/mL, 配2mL（需过滤）;蛋白Marker; 0.5M EDTA,pH8.0; 溴化乙锭溶液(EB) （贮存浓度：10mg/mL，使用浓度0.5μg／mL）
三、仪器设备 紫外成像系统，高速冷冻离心机，恒温震荡培养箱，高压灭菌锅，冰箱，水浴锅，微波炉，电炉子，试管架，tube 架，试管，瓶塞，锥形瓶，胶板，电泳槽（包括琼脂糖凝胶和SDS-PAGE），电泳仪，培养皿，移液枪，枪头（各种规格），玻璃涂棒，记号笔，标签纸，卫生纸，水漂（水浴用），试纸，称量纸，一次性手套，酒精灯，火柴，药勺，搅拌子，量筒，烧杯，镊子，tip, tube(1.5mL, 2mL) 五、实验步骤 (一)准备工作 LB培养基配制；LB固体培养基配置；接菌（制备感受态用） 1）LB固体配制 配制固体培养基100mL 加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4，121℃灭菌20min。 灭菌结束后，待温度降至80℃以下时，方能取出，在超净台上，当培养基凉至50-60℃时，迅速加入Kan 30μL（若氨苄，加100ul），摇匀，倒板(4个)。凝固后放入4℃冰箱。 2）LB液体配制 配制100mL液体LB培养基 加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4。 然后分装，每管5mL，每人分装2管，一共12管；另外分装30mL LB与三角瓶中，余下的LB在原三角瓶中与试管等一起高压，121℃，20min。高压后，将剩余三角瓶中的LB分装至1.5mL tube中，每管800μL LB (共10个)。在时间允许的情况下，将高压后的LB试管加入卡那，每管1.5μL。 总结：需要灭菌的东西-液体培养基（试管、30mL三角瓶及剩余液体LB的三角瓶）-固体培养基、离心管（至少30个）、各种规格的枪头。 3）接菌 下午，接种BL21感受态于1管5mL培养基中，37℃震荡培养。 （二）感受态细胞制备、转化、重组菌接种 1）感受态细胞的制备 1.从大肠杆菌DE3平板上挑取一个单菌落接种于5mL LB液体培养基的试管
OH OCH CH2－CH=CH ONa OCH CH2－CH=CH 简易水蒸汽蒸馏装置 、 管 路 敷 设 技 术 习 题 到 位 。 在 管 路 敷 设 过 程 中 ， 要 加 强 看 护 关 于 管 路 高 中 资 料 试 卷 连 接 管 口 处 理 高 中 资 料 试 卷 弯 扁 度 固 定 盒 位 置 保 护 层 防 腐 跨 接 地 线 弯 曲 半 径 标 高 等 ， 要 求 技 术 交 底 。 管 线 敷 设 技 术 中 包 含 线 槽 、 管 架 等 、 电 气 课 件 中 调 试 对 全 部 高 中 资 料 试 卷 电 气 设 备 ， 在 安 装 过 程 中 以 及 安 装 结 束 后 进 行 高 中 资 料 试 卷 调 整 试 验 ； 通 电 检 查 所 有 设 备 高 中 资 料 试 卷 相 互 作 用 与 相 互 关 设 备 进 行 调 整 使 其 在 正 常 工 况 下 与 过 度 工 作 下 都 可 以 正 常 工 作 ； 对 于 继 电 保 护 进 行 整 核 对 定 值 ， 审 核 与 校 对 图 纸 ， 编 写 复 杂 设 备 与 装 置 高 中 资 料 试 卷 调 试 方 案 ， 编 写 重 要 设 备 高 中 资 料 试 卷 试 验 方 案 以 及 系 、 电 气 设 备 调 试 高 中 资 料 试 卷 技 术 电 力 保 护 装 置 调 试 技 术 ， 度 内 来 确 保 机 组 高 中 资 料 试 卷 安 全 ， 并 且 尽 可 能 地 缩 小 故 障 高 中 资 料 试 卷 破 坏 范 围 ， 或 者 对 某 些 异 常 高 中 资 料 试 卷 工 况 进 行 自 动 处 理 ， 尤 其 要 避 免 错 误 高 中 资 料 试 卷 保 护 装 置 动 作 ， 并 且 拒 绝 动 作 ， 来 避
一、实验名称： 重组DNA技术 二、实验目的： 1.了解掌握DNA重组技术理论基础； 2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法； 3.掌握连接产物的转化方法及操作； 4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法； 三、实验原理: 1.重组DNA技术 重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤： ①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。 ②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。 ④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 ⑤重组体的筛选：可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。 ⑥无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞) ⑦目的基因的表达 2、质粒酶切及鉴定原理 限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是Bam HI 和Hind III。 对于DNA回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有：柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等，其中柱纯化回收法、电
叶绿素的提取和分离实 验报告 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
陕西师范大学远程教育学院 生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心 叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
《叶绿体色素的提取和分离》实验报告 实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 实验原理 叶绿体色素包括绿色的叶绿素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色的类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类,它们均以色素蛋白复合体形式存在于类囊体膜上。两类色素均不溶于水而溶于有机溶剂,故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。由于提取液中不同色素在固定相和流动相中的分配系数不同,所以可借助分配层析方法将其分离。 实验仪器与药品 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸(直径11cm)。 3. 95%乙醇、石英砂、碳酸钙、展层剂。展层剂按石油醚:丙酮:苯10:2:1的比例配制(V/V)。 实验步骤 1. 叶绿体色素的提取
(1)取菠菜或其它新鲜植物叶片4~5片(4g左右),将其洗净、擦干并去掉中脉,剪碎后置入研钵中。 (2)研钵中加入95%乙醇2~3 ml及少许石英砂、碳酸钙研磨至匀浆,再加95% 乙醇5ml,然后以漏斗过滤之,即为色素提取液。 2. 叶绿体色素的分离 (1)取圆形定性滤纸一张(直径应小于康维皿直径)于其中心扎一圆形小孔(直 径约3mm),另取长方形滤纸条一张(5cm×1.5cm),用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取 液沿滤纸条的长度方向涂抹,注意涂抹色素扩散宽度应限制在0.5cm以内,风干后再重复操作数次。然后沿长度方向将滤纸条卷成纸捻,使涂抹过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。 (2)将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中,使与滤纸刚刚平齐(勿突出)。 (3)在康维皿中央小室中加入适量的展层剂,把带有纸捻的圆形滤纸平放在康 维皿中央小室上,使纸捻下端浸入展层剂中,迅速盖好培养皿。展层剂将借助毛细管作用顺纸捻扩散至圆形滤纸上,使叶绿体色素在固定相(滤纸中吸附有水分的纤维素)和流动相(展层剂)间反复分配,从而使不同色素得到分离,分离结果为滤纸上可见到各种色素的同心圆环。无康维皿时亦可用底、盖直径相同的培养皿进行实验,实验时可在培养皿底中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖以替代康维皿中央小室盛装展层剂,其余相同。 (4)当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实验,此时可看到不同色素的同心 圆环,各色素由内往外的顺序为:叶绿素b(黄绿色)、叶绿素a(蓝绿色)、叶黄素(鲜黄色)、胡萝卜素(橙黄色),再用铅 笔标出各种色素的位置和名称。
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：
1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量
实验报告 实验项目名称：基因工程综合实验所属课程名称：基因工程原理 班级：12生物工程3班学号：201230620312 姓名：李杰锋 指导老师：徐学锋
目录 0.摘要 (1) 1.前言 (1) 2.实验材料和仪器 (2) 2.1 实验材料 (2) 2.2 实验仪器 (2) 3.实验试剂 (2) 3.1DNA提取所需试剂 (2) 3.2 PCR实验所需试剂 (2) 3.3 双酶切实验所需试剂 (2) 4.实验步骤 (3) 4.1 质粒DNA提取 (3) 4.2 聚合酶链式反应（PCR） (3) 4.3 质粒DNA的双酶切分析 (4) 4.4 琼脂糖凝胶制备 (4) 5.实验结果与分析 (5) 5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果 (5) 5.2 PCR扩增实验结果 (5) 5.3质粒DNA的双酶切分析结果 (6)
摘要：本实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。通过本综合实验，进一步理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，也掌握了DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA或RNA的地方。 关键词：凝胶电泳限制线内切酶DNA质粒 1 前言 本次实验对象为含有重组了1kb DNA片段的PET32.a表达质粒。该表达质粒中长度约6kb。首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA，最后得到纯化后的DNA质粒作为之后实验的材料。在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。 PCR是根据DNA双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。本次实验我们将以纯化后的质粒DNA作实验材料，在预先设计好引物后
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 实验报告集 班级生工1411 学号 组别7 姓名
实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）
实验报告 溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 一、目的 对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定 二、原理 鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。 1、溶菌酶分离纯化原理： （1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白 （2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白 2、溶菌酶鉴定分析 （1）考马斯亮蓝法测蛋白含量 （2）分光光度法测定酶活性 （3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度 三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂 鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等 2、实验仪器 低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。 3、实验方法 1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离 2. 树脂柱层析分离纯化 （1）D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱 3.透析与浓缩 (1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩 4.蛋白质含量的测定 5.溶菌酶纯度的测定（SDS凝胶电泳）