脂肪酶活检测原理及实际方法：一、
原理以及标准曲线做法
1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是
脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：
CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-
5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁
酸酯
1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯
1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯
1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯
14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂
全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司
3. 标准曲线绘制：
a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：
b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：
分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和
(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。公式y=+中x 是p-NP 的浓度(单位：mmol/l) ，y 是吸光值，、是反应系数，R2 是相关系数。则，酶活计算公式为：
酶活=1000*n*V* / 其中n 为稀释倍数，t 为反应时间（单位：min ），V 为反应体系的总体积（单位：L）、1000 是mmol 到μmol 的比例。
二、底物耐碱性测定及试验液配制
1.底物耐碱性测定种底物分别加至pH7，pH8 的37℃的PBS 缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min 检测一次颜色变化，拍照；种底物分别加至pH8，pH9 的Tris-HCl 缓冲液中（37℃），每隔5min 检测一次颜色变化，拍照；
c.分别加至pH9，pH10 的Gly-NaOH 缓
冲。
2.测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法方法一：（96 孔板法，粗略，速度快）
a. 溶液的配制
溶液A：溶液A:对硝基苯棕桐酸脂（p-NPP，Sigma，或者其他底物，mol，即*10 -5mol）溶于异丙醇（浓度为*10 -3M，或），4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml 离心管）保存，每10ml 可用于单个酶500 次测定；
溶液B:缓冲液（pH 缓冲液，可更改）加入 1 滴TritonX-100 ，混匀，4℃保存。
96 孔板（220μ L）：
A 液（底物液）：18μ L
↗ 体系液180（μL）
+ 酶液（40μ L）
B 液（pH 缓冲液）：
162μL
此步骤中，底物再次被稀释，浓度为。
方法二：（吸光度法，精准，速度慢）
a.溶液的配制
溶液A:对硝基苯棕桐酸脂（p-NPP，Sigma，或者其他底物）溶于异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml 离心管）保存，每10ml 可用于单个酶8-10 次测定，或用于8-10 个酶一
次测定，或用于一个酶 4 次密精测定；
溶液B:缓冲液（pH 缓冲液，可更改）加入 1 滴TritonX-100 ，混匀，4℃保存。
b. 脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个/ 两个对照为例）
①准备试管30个，10个15ml 离心管；
②取1ml / 溶液 A 加入到9ml / 溶液B于离心管中，充分混匀，37℃水浴保温5min ，分装至
3 /
4 个试管中，每个，即体系液；
③向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300 μL），对照组中加入灭活酶液（沸水煮沸
5min），加入酶液后即为反应液；
④37 ℃反应10-15min ，加入95%乙醇终止反应，在410nm 下测定吸光值，每个样品重复 2 /
3 次，取平均值。
三、96 孔板装样方式：
步骤一：温度不变，定为40℃，以pH 和底物为变量，先在EP 管内反应，后加入至96 孔板中。其中每个孔是220μL体系。pH缓冲液分别采取PBS缓冲液（7、8）、Tris-HCl缓冲液（8、9）。
a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*80= ，其中需要灭活的是800μL。以方
便计算以及加样，取4ml 酶液，1ml 用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*16=288 μL，以方便计算和加样，取300μ L。
c. 以三个酶为例仅做pH 和底物交叉实验为例，需要每个酶液4ml ，每个底物900μL。
表为96 孔加样模式：C2 等代表底物，后面的数字代表pH，红色字体表示一个空白对照和三个平行。蓝色字体中，pH8 分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl 缓冲液，以便比较不同缓冲液对酶活的影响。
步骤二：pH 不变，以温度和底物为变量，先在EP 管内反应，后加至96 孔板中。其中每个
孔是220μ L 体系。
a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*60= ，其中需要灭活的是600μL。以方
便计算以及加样，取3ml 酶液，750ml 用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*12=216 μL，以方便计算和加
样，取250μ L。
c. 以三个酶为例仅做pH 和底物交叉实验为例，需要每个酶液3ml ，每个底物750μ L。
表为96 孔加样模式其中C2 等代表底物，后面的数字代表温度，红色字体表示一个空白对照和三个平行。40 ℃因已经在上个步骤中做过，不再重复。