复合酶法提取金针菇多糖及光谱分析
摘要：研究了复合酶法提取金针菇（ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）多糖的最佳工艺条件，并对金针菇多糖进行了光谱分析。采用木瓜蛋白酶、纤维素酶复合处理，对加酶质量比、酶解温度、ｐｈ、酶解时间4个因素对多糖提取率的影响进行了正交试验。确定了复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为酶解温度６０℃，复合酶添加量０．５％，加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）２∶１，ｐｈ６．０，酶解时间２ｈ，此条件下多糖提取率可达９．１％。
关键词：金针菇（ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）多糖；复合酶法提取；正交试验；光谱分析
combined-enzyme extraction and spectral analysis of flammulina velutipes polysaccharides
liang mina,zou dong-huib,guo hong-wenb, li angb
（ａ．ｃｏｌｌｅｇｅｏｆｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｂ．ｓｃｈｏｏｌｏｆｆｏｏｄａｎｄｂｉｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｑｉｑｉｈａｒ uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｑｉｑｉｈａｒ１６１００６，ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ）
ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｆｌａｍｍｕｌｉｎａ
ｖｅｌｕｔｉｐｅｓｂｙｃｏｍｂｉｎｅｄ－ｅｎｚｙｍｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｓｐｅｃｔｒａｌａｎａｌｙｓｉｓ．ｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｄｏｓｅｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅａｎｄｐａｐａｉｎ，ｐｈ，ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｔｉｍｅｗere ａｎａｌｙｚｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌtest．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｎｚｙｍａｔｉｃｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，６０℃； m ａｓｓｒａｔｉｏｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄｅｎｚｙｍｅ，０.５％； aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｐａｐａｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ，２∶１；ｐｈ，６．０； rｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，２ｈ．ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄｗａｓｕｐｔｏ９．１％ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｃｏｍｂｉｎｅｄ－ｅｎｚｙｍｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ；ｓｐｅｃｔｒａｌａｎａｌｙｓｉｓ
金针菇（ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）又名冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，隶属担子菌亚门（ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）层菌纲（ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）伞菌目（ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）口蘑科（ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ）金钱菌属（ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）。金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆嫩、形美、味鲜，是世界上著名的食药两用菌和观赏菌［１］，具有较高的营养价值和药用价值，有广阔的开发前景。
金针菇子实体中除含有蛋白质、氨基酸、矿物质、维生素和对人体有益的微量元素外还含有一种重要的生物活性高分子多糖，金针菇多糖由于具有抑制肿瘤、抗癌、增强肌体免疫力［２－４］等作用而受到广泛重视。如何提高金针菇多糖的提取率、降低成本已成为拓展金针菇使用范围、提高其应用价值的关键。
传统的浸提法虽然是提取多糖的经典方法，但时间长、效率低、能耗大；金针菇多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白质多糖的形式存在。研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖提取率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度［５］。复合酶法处理可以提高多糖提取率、减少能源消耗、缩短提取时间。因此，探索更为高效、经济、可靠的提取方法对金针菇多糖的研究开发具有重要的现实意义。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１原料取市售新鲜金针菇，除去根部，清洗切块，粉碎，干燥，过４０、６０、８０、１００目筛，过筛之后把各级金针菇干粉分别装到清洁干燥的烧杯中，置于真空干燥箱中待用。
1.1.2 试剂苯酚，天津市科密欧化学试剂开发中心；葡萄糖，天津市凯通化学试剂有限公司；ｓｅｐｈａｄｅｘｇ－７５色谱柱，ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；纤维素酶，国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶，北京世纪时尚科贸有限公司。所用试剂均为分析纯。
１．１．3 仪器与设备电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；７２２型紫外分光光度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；离心机：上海跃进医疗器械厂；九阳料理机：山东九阳小家电有限公司；ｔｈｚ－８２ａ型台式恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；ｌａｍｂｄａ－３５紫外可见分光光度计：美国ｐｅ公司；ｓｐｅｃｔｕｍｏｎｅ傅里叶变换红外光谱仪：美国ｐｅ公司。
１．２方法
１．２．1 葡萄糖标准曲线的制定以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图。得葡萄糖标准曲线的回归方程为■＝０．００７３ｘ＋０．０１４６，ｒ＝０．９９６６，在０～５０μ
ｇ／ｍｌ范围内呈良好的线性关系。
１．２．2 多糖清液的提取方法称取８０～１００目的金针菇干粉５ｇ，放入２５０ｍｌ的三角瓶中，加入一定量去离子水，混合均匀后置于５０℃水浴锅中水浴３０ｍｉｎ，调节ｐｈ，称取木瓜蛋白酶和纤维素酶按一定比例混合，加入５ｍｌ去离子水溶解，金针菇溶液放在水浴中预热至酶解温度，将酶液加入到金针菇溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，将三角瓶放到沸水锅中，沸水浴１０ｍｉｎ灭酶，灭酶结束冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，５０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上清液，即得到复合酶法提取的多糖清液。
１．２．3 蛋白质的去除方法采用ｓｅｖａｇ法去除多糖清液中的蛋白质［6］。在多糖清液中加入其１／４体积的氯仿－正丁醇（氯仿与正丁醇体积比４∶１），将其置于具塞试管中，充分摇匀３０ｍｉｎ后用离心机离心１０ｍｉｎ，剔去下面的白色浑浊液，取上清液，这样的操作重复进行３～４次即可除去蛋白质。１．２．4 多糖的获得方法金针菇多糖在水中的溶解度较大，所以先用去离子水初步提取，之后取上清液，用２0 g/l的活性炭脱色１ｈ，加入体积分数为９５％的乙醇，使溶液中乙醇的体积分数达到７５％进行醇沉，醇沉过程中要将其保存在４℃冰箱中，保持２４ｈ后５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取沉淀，置于真空干燥箱中干燥，即可得到金针菇多糖［7］。
１．２．5 多糖含量的测定方法采用苯酚－硫酸比色法［8］，苯酚－硫酸法是以硫酸、苯酚作为显色剂，它们与金针菇多糖发生显色反应后在４９０ｎｍ波长处测定其吸光度，再通过已经获得的葡萄糖标准曲线计算求得金针菇中的多糖含量。
１．２．６单因素试验
１）物料粒度对金针菇多糖提取率的影响。将金针菇粉通过４０、６０、８０、１００目筛，分别得到小于４０目、４０～６０目、６０～８０目、８０～１００目和１００目以上的金针菇粉，取一定量的以上５种样品，选择料水质量比１∶１５，５０℃水浴中提取１ｈ，计算各样品的多糖提取率，研究物料粒度对金针菇多糖提取率的影响。
２）料水质量比对金针菇多糖提取率的影响。等量称取８０～１００目的金针菇粉５份，选择料水质量比１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０，分别于５０℃水浴中提出１ｈ，计算各样品的多糖提取率，研究料水质量比对金针菇多糖提取率的影响。
３）复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响。等量称取８０～１００目的金针菇粉４份，选择料水质量比１∶２０，加入适量复合酶［加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）＝１∶１），控制复合酶质量分别为金针菇粉质量的０．３％、０．４％、０．５％、
０．６％，在５０℃水浴中提取１ｈ，计算各样品的多糖提取率，研究复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响。
1.2.7 正交试验影响金针菇多糖的提取因素很多，通过预试验选择其中的4个因素作为研究的对象：加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）、酶解温度、ph、酶解时间。采用四因素三水平正交试验确定提取金针菇多糖的最佳条件，因素与水平见表1。
１．２．8 多糖的色谱分离纯化方法金针菇多糖粗品水溶解后，取１０ｍｌ上ｓｅｐｈａｄｅｘｇ－７５色谱柱。用恒流泵控制流速（２０ｍｌ／ｈ），自动部分收集器收集，每管收集２．０ｍｌ，用苯酚－硫酸法测定各洗脱液于４９０ｎｍ处的吸光度，收集其流出液，冷冻干燥得到纯化后的样品。
1.2.9 多糖成分分析方法
1）红外吸收光谱分析。采用美国ｐｅ公司的ｓｐｅｃｔｕｍｏｎｅ傅里叶变换红外光谱仪，在４００~４０００ cｍ-1范围内对提取的金针菇多糖进行红外吸收光谱扫描。
2）紫外吸收光谱分析。采用美国ｐｅ公司的ｌａｍｂｄａ－３５紫外可见光分光光度计，在１９０～800 ｎｍ范围内对提取的金针菇多糖进行紫外吸收光谱扫描。
２结果与分析
２．１单因素试验结果
２．１．１物料粒度对金针菇多糖提取率的影响从图1可知，小于４０目、４０～６０目、６０～８０目、８０～１００目和１００目以上的金针菇粉的多糖提取率分别为２．７%、２．９%、３．１%、３．４%和３．３%，由此可知８０～１００目的金针菇粉多糖提取率最高（图１）。因此试验选定物料粒度为８０～１００目。
２．１．２料水质量比对金针菇多糖提取率的影响从图2可知，料水质量比为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０的条件下金针菇的多糖提取率分别为２．３%、３．１%、３．４%、３．５%和３．５%，当料水质量比在１∶１５和1∶10之间，随着料水质量比的减小，多糖提取率较快地增长，继续减小料水质量比多糖提取率仍有升高，但升高速率减小。在提取中加水太少、太多皆不利于以后的分离，而且加重了生产中的负担。因此试验确定料水质量比为１∶２０。
２．１．３复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响从图３可以看出，随着复合酶添加量的增加，多糖提取率也逐渐增加，复合酶添加量大于０．５％后多糖提取率增加趋于平缓，考虑到酶的成本及效果，复合酶添加量宜为０．５％。
２．２金针菇多糖提取的正交试验结果分析
由表2中４个因素的极差值可知，影响金针菇多糖提取率的4个
因素的主次顺序是ａ＞ｄ＞ｃ＞ｂ。通过正交试验可知复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为ａ３ｂ２ｃ２ｄ２，即加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）为２∶１，酶解温度为６０℃，ｐｈ６．０，酶解时间为２ｈ，此时金针菇的多糖提取率为９．１％。
２．3 金针菇的多糖成分分析结果
２．3．１金针菇多糖结构红外吸收光谱分析结果红外吸收光谱是有机化合物结构表征的重要方法，在实验室得到了普遍的应用。有机化合物的化学键或官能团都有各自的特征振动频率，因此可以测定化合物的红外吸收光谱，根据吸收带的位置，推断出分子中可能存在的化学键或官能团，再结合其他信息便可确定化合物的结构［９，１０］。由图4可知，３４７５和３４１６ｃｍ－１处峰值是由多糖中ｏ－ｈ的伸缩振动引起的，羟基在分子间发生缔合，并不是游离的；在２９０７ｃｍ－１处是由多糖中ｃ－ｈ的伸缩振动引起的；在１６３７～１６１８ｃｍ－１处吸收峰是－ｃｈｏ的ｃ＝ｏ的伸缩振动引起的，为肽链上酰胺碳基的吸收峰；在１５６４ｃｍ－１处是由多糖中ｃ－ｈ的变角振动引起的；在１４７２ｃｍ－１处是由多糖中ｃ－ｏ－ｃ和ｃ－ｏ－ｈ的伸缩振动引起的；在８４９ｃｍ－１处是由β－吡喃环中ｃ－ｈ的变角振动引起的；在８２０ｃｍ－１处为α－吡喃环中ｃ１－ｈ的变角振动吸收峰；在８０５ｃｍ－１处是由吡喃环中ｃ１
－ｈ的变角振动引起的。金针菇多糖具有典型的多糖物质的吸收峰，而且多糖中存在吡喃环和呋喃环，具有α、β构型。
２．3．２金针菇多糖结构紫外吸收光谱分析结果紫外吸收光谱应用广泛，可用于有机化合物的结构表征以及有机化合物的定量分析。由于此法灵敏度较高，能检测出１０－５～１０－４ｍｏｌ／ｌ浓度的化合物，因此在试验中可采用此法测定其中的微量杂质如核酸和蛋白质［１１，１２］。由图5可知，得到的紫外吸收光谱较为光滑，在核酸（吸收峰２６０ｎｍ）和蛋白质（吸收峰２８０ nｍ）吸收波长处未出现峰值，所以核酸和蛋白质的含量较小。
３结论与讨论
采用正交试验确定了金针菇多糖复合酶法提取的最佳工艺条件，即木瓜蛋白酶与纤维素酶质量比为２∶１，复合酶添加量为0.5%，酶解温度为６０℃，ｐｈ为６．０，酶解时间为２ｈ，此时多糖提取率为９．１％。
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长春碱是从夹竹桃科植物长春花中提取的一种具有显著抗癌活性的二聚吲哚类生物碱，同时它也是合成其它长春碱类抗肿瘤药物的主要原料。长春碱主要是从长春花中提取，目前国内外多采用溶剂提取和超临界萃取2种方法。其中后者对设备有较高要求，生产成本太高。因此，提高溶剂提取法的提取率是更加可行的方法。我们将长春碱的常规提取方法与复合酶解提取法相结合，可显著提高长春碱的提取率。在工艺条件优选中，将单因素法与正交实验法相结合，以长春碱含量和提取物得率为指标，用较少的实验次数对影响提取的因素进行筛选，优选出最佳的工艺条件。 1仪器和试剂 高效液相色谱仪（日本岛津，HITACHIL - 7000），雷磁pH 计（上海楚柏实验室设备有限公司，PHS-3C 型），电子天平（AR135型），电热恒温培养箱（HPX －9052MBE ）。长春花药材由海南好阳光农业开发有限公司提供；长春碱对照品由sig -mar 公司提供，纯度99%；纤维素酶，活性单位20000U ／g ，由福州福达生物工程有限公司提供；果胶酶，活性单位20000U ／g ，由福州福达生物工 程有限公司提供。二氯甲烷、硫酸、氨水、磷酸、二乙胺为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水。 2方法与结果 2.1色谱条件参照罗猛等［1］的方法。色谱柱：C18ODS （Hypersil ，250mm ×4.6mm ，5μm ）；流动相：水∶二乙胺为986∶14，用磷酸调节pH 为7.2（溶液A ）；甲醇∶乙腈为4∶1（溶液B ），380ml 溶液A 和620ml 溶液B 混合作为流动相；流速为1ml ／min ；进样量10μl ；柱温28℃；检测波长220nm 。2.2标准曲线的制备精密称取长春碱对照品约25mg 于25ml 量瓶中，加甲醇至刻度，从中精 密吸取1、2、3、4、5ml 分别于10ml 量瓶中，甲醇定溶，制成浓度为0.1～0.5mg ／ml 的长春碱标准品溶液。用微量进样器分别吸取上述标准品溶液 10μl 进样，测定峰面积，以长春碱浓度（C ）为横坐标，以峰面积（Y ）为纵坐标进行回归分析，得到回归方程为：Y=28.4＋1.96×107C r =0.9999。长春碱标准品色谱图见图1。 2.3样品溶液的含量测定长春花全草粉碎，过40目筛，准确称取药材粉末100g ，依据正交表的安排，加入水、纤维素酶、果胶酶，调节pH ，充分搅拌，在选定的温度下酶解一定时间，取出于60℃烘 干。烘干后的粉末按长春碱常规提取工艺提取 ［2，3］ ，即用0.7%硫酸水液500ml 浸泡24h ，过滤， 用水500ml 浸泡12h ，过滤，重复浸泡3次，合并滤液，用氨水调pH 为10，中和液每500ml 分别用二氯甲烷100、80、80ml 萃取3次，萃取液减压回收，甲醇定溶于100ml 量瓶中，制成样品溶液。用微量进样器吸取样品溶液10μl 进样，测定长春碱峰面积，用回归方程计算浓度。样品溶液色谱图见图2。 复合酶解法提取长春碱的新工艺 王 瑾，王 宫，杨义雄，林 海 （福建省中医药研究院，福建福州350003） 关键词：复合酶解法；长春花；长春碱；提取工艺中图分类法：R284.2 文献标识码：B 文章编号：1004-5627（2009）01-0032－04 收稿日期：2008-09-18 基金项目：福建省卫生厅青年基金（2006-1-25）、福州市科技局科技计划孵化器发展专项（2006-F-140）作者简介：王瑾（1979—），女，助理研究员，主要从事中药化学成分的研究。 图1 长春碱标准品色谱图 m V min Journal of Fujian University of TCM February 2009，19（1） 福建中医学院学报2009年2月第19卷第1期32
1.1溶剂提取法 多酚就是多羟基化合物,它的结构特点决定多酚易溶或可溶于水、醇类、醚类、酮类、酯类等,所以,溶剂提取法主要有水溶剂提取与有机溶剂提取两种。水溶剂提取植物多酚类物质早90年代就有报道,该法由于工艺简便、成本低、纯度高而被广泛使用,但此法提取率低。有机溶剂提取就是利用多酚在不同溶剂中的溶解度不同进行回流提取,常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,此法可提高提取率、缩短反应时间。姚永志[2]等人在比较水溶剂及乙醇溶剂提取花生红衣多酚物质的研究中报道,当以水作溶剂提取花生红衣多酚物质时,最佳工艺:水浴温度40℃、液料比75、提取时间lh、提取率为6.41％,而乙醇作溶剂时最佳工艺:乙醇浓度55％、水浴温度60℃、提取时间0.5 h、料液比1:37.5,提取率达到7.858％。但有机溶剂成本高、回收困难,有毒易燃,不利于安全生产。 1.2微波辅助提取 微波辅助提取技术就是利用微波能来提高提取率的一种技术。在微波提取过程中,微波辐射能 够导致植物细胞内的极性物质吸收微波能,产生大量热量,使细胞内温度迅速上升,液态水汽化,从而使产生的压力在细胞膜与细胞壁上形成微小孔洞,使胞外溶剂可以进入细胞内溶解并释放出胞内物质,因此可以有效的提高产率,降低反应时间,减少溶剂的使用量。由于目前微波的设备比较普遍,因此,微波提取植物多酚的方法为更多的人所接受与使用。宋薇薇等[3]人用微波辅助法提取石榴皮多酚类化合物,确定了石榴皮多酚提取的最优工艺条件:40％(体积分数)乙醇作溶剂,料液比(g:m1)l:35,微波功率为242 W,提取时间60 s,提取三次,以该优化条件提取时,多酚粗提物得率26.52％,这个结果较贾冬英[43以20％(体积分数)乙醇作溶剂,料液比(g:mL)1:20,温度50℃,提取时间1 h,以该优化条件提取所得石榴多酚得率22.86％高,与醇提法相比,微波辅助提取能强化浸取过程,体系受热均匀,提取物中多酚含量高,提取时间较短等优点。 1.3超声波辅助提取 超声波辅助提取法就是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,可加速有效成分进入溶剂,从而提高提取率,缩短提取时间,并可避免高温对提出成分的影响。超声波提取的操作具有简便快捷、提取温度低、时间短、提取率高、提取物结构不易被破坏的特点.该法的缺点就是获得产品纯度不高。陶令霞c5]等人对苹果渣中多酚的超声辅助提取工艺条件进行了优化研究,确定最佳工艺条件为:70％乙醇,提取时间50 min,提取功率200 W,料液比1:15,提取温度35℃,提取2次,苹果多酚得率为4.29g／kg。同时,超声波辅助提取方法在荷叶多酚大麦多酚、以及诃子多酚中也有相应的报道。 1.4生物酶解提取 生物酶解提取技术就是根据酶反应具有高度专一性的特点,选择相应的酶,水解或降解细胞壁组成成分纤维素、半纤维素与果胶,从而破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或交溶于溶剂中,达到提取目的。酶法提取最大的优势就是反应条件温与。由于酶法提取就是在非有机溶剂下进行,所得产物纯度、稳定性、活性都较高,无污染,解决了有机溶剂提取法有机溶剂回收困难、用量大等缺点。此外,酶法提取在缩短提取时闻、降低能耗、降低提取成本等方面也具有一定优势[6]。刘军海等人[7]以低档绿茶为原料,采用复合酶法在较低温度下提取茶多酚。以单因素试验考察了酶用量、提取温度、提取时间及pH对茶多酚提取率的影响。通过正交试验优化并确定最佳提取工艺条件:酶用量为0.20％、提取温度为60℃、提取时间80 min、pH为4.6,在此工艺下茶多酚提取率为13.6％,其中儿茶素占茶叶干重的含量比沸水提取法高出 2.31％。1.5离子沉淀法离子沉淀法就是利用多酚能与金属离子络合生成沉淀,使其在浸提液中与其它物质分离而出,从而得到纯度较高多酚。目前常用金属离子有A13+、Zn2+、Fe2+、M92+、Ba2+、Ca2+等,其中A13+、Zn2+较为理想。离子沉淀法优点就是不使
天然植物有效成分的提取新技术——生物酶解技术 酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2．1 用于天然植物细胞破壁的酶 2．1．1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。 2．1．2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2．1．3果胶酶 果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃，作用pH值3～6。
开题报告 食品质量与安全 酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化 一、选题的背景与意义 胶原蛋白，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白。由于胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而其被广泛的应用于化工、食品、医学、生物材料以及农业等诸多领域。因此，胶原蛋白的提取一直是研究的热点。 目前国际上已开发出许多胶原保健品和功能性胶原生物材料。相对于我国，其在胶原蛋白的基础研究上已经具有一些优势并拥有一定的国际专利，而且部分已经投入市场，形成一定的市场规模。而我国的高质量胶原蛋白基础研究还有差距，有关这方面的核心专利技术不多。 但就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。另一方面在肉制品和制革加工过程中含有丰富胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头）利用的附加值很低。这样既浪费资源又污染环境，利用这些废弃物生成胶原蛋白实现资源的合理和有价值的利用，实现经济和社会效益的双赢。 本实验的以牛肉制品的下脚料——牛皮为原料，利用酶解法提取胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1、对牛皮成分的测定：主要测其水分、脂肪、粗蛋白、胶原蛋白等。 2、酶制剂的选择和复合：选择两种胶原蛋白提取率比较高的酶，然后按一定比例进行复合试 验。 3、研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响：通过对加酶量、水解pH、水解温度、水解 时间、固液比等因素进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验得出优化的工艺条件。拟解决的问题： 1、如何选择合适的比例对两种单酶进行复合。 2、如何提高胶原蛋白的提取率。 三、研究的方法与技术路线： 研究的方法： 1、牛皮成分测定：水分测定采用直接干燥法；脂肪测定采用索式提取法；蛋白质测定采用凯 式定氮法；胶原蛋白的含量测定采用羟脯氨酸法
酶法提取原理 摘要：简要介绍了酶法提取的基本原理、特点及提取速率的影响因素，结合酶法在提取有效成分中的应用实例和与其他技术的联用，对酶法在中药提取领域的前景进行展望。 关键词：酶法；中药提取；综述 中药是中华民族灿烂文明中一朵盛开的奇葩，有着几千年的悠久历史。中药成分复杂且很多贵重有效成分含量很低，因此中药开发中的关键工序即为如何有效地提取中药中的有效成分。传统提取方法如煎煮、回流、浸渍、渗漉法，存在着周期长、工序多、提取率不高等缺点。酶作为一种生物催化剂，在中药提取中，对中草药细胞壁的有效成分进行分解破坏，从而降低传质阻力，提高提取率；可改变中药目标产物的生理生化性能，优化产物效用，并且酶法提取操作简单，条件温和，环保无毒，现已将其用于中药提取过程。本文就酶法的提取技术及其应用进展方面进行综述。 1酶法提取的基本原理 大多数中药为植物性草药，中药材中的有效成分多存在于植物细胞的细胞质中。在中药提取过程中，溶剂需要克服来自细胞壁及细胞间质的传质阻力。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质等物质构成的致密结构，选用合适的酶(如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶)对中药材进行预处理，能分解构成细胞壁的纤维素、半纤维素及果胶，从而破坏细胞壁的结构，产生局部的坍塌、溶解、疏松，减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞间质的阻力，加快有效成分溶出细胞的速率，提高提取效率，缩短提取时间[1]。 而且，在中药提取中酶法可作用于目标产物，改善目标产物的理化性质，提高其在提取溶剂中的溶解度，减少溶剂的用量，降低成本；也可改善目标产物的生理生化功能，从而提高其效用。 2酶法提取的特点 2.1反应条件温和，产物不易变性 酶法提取主要采用酶破坏细胞壁结构，具有反应条件温和、选择性高的特点，而酶的专一性可避免对底物外物质的破坏。在提取热稳定性差或含量较少的化学成分时，优势更为明显。杨云龙等[2]用酶法提取洋葱中黄酮类化合物，采用酶解法来处理洋葱皮，避免了因高温对黄酮类化合物结构的破坏，提高了黄酮类化合物的提取率。 2.2提高提取率，缩短提取时间
中草药所含成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，中草药提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但常用的提取方法（如煎煮法。回流法、浸渍法。渗漉法等）在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多。提取率不高等缺点。近10年来，在中药提取方面出现了许多新技术、新方法，这些新技术和方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。本文就这方面作一综述。 1. 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取（简称SC FEFE）是一种以超临界流体（简称SCF）代替常规有机溶剂对中草药有效成分进行革取和分离的新型技术，其原理是利用流体（溶剂）在临界点附近某区域（超临界区）内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，利用这种SCF作溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分。常用的SCF为CO。，因为CO。无毒，不易燃易爆，价廉，有较低的临界压力和温度，易于安全地从混合物中分离出来。超临界CO。萃取法与传统提取方法相比，最大的优点是可以在近常温的条件下提取分离，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，产品纯度高，操作简单，节能。 廖周坤等用不同浓度的乙醇作夹带剂，对藏药雪灵芝进行了总皂苷粗品及多糖的苹取试验，与传统溶剂萃取工艺相比较，收率分别提高至旧．9倍和 1．62倍。何春茂、梁忠云利用超临界CO。卒取技术从黄花蒿中革取所得的萃取物中杂质（蜡状物）含量低，青蒿素提纯精制简单，收率高产品质量好。雷正杰等利用超临界CO。流体萃取技术，对厚朴的有效成分进行萃取和分离，革取物为淡黄色膏状物，经分析该萃取物由厚朴酚等11个化学成分组成，其中厚朴酚和厚朴酚的相对含量高达46．81％和45．00％。葛发欢等探讨了从黄山药中萃取薯预皂素的最佳条件，同时进行了中试放大，证明应用超临界CO。萃取薯预皂素进行工业化生产是可行的，与传统的汽油法相比较，收率提高15倍，生产周期大大缩短，避免使用汽油有易燃易爆的危险。葛发欢等研究了超临界CO。萃取柴胡挥发油和皂苷的工艺，STh－CO。法提取柴胡挥发油，与传统水蒸气蒸馏法相比较，能大大提高收率，缩短提取时间，而挥发油组成一致，只是各成分含量有差异。原永芳等通过五因素一四水平正交试 验法，用超临界流体萃取技术对川穹的挥发油萃取条件进行了优化选择，结果最佳萃取条件为压力34．smPa，温度60℃，改性剂乙醇0．3ml，静态苹取时间10min，动态萃取量10ml，以水作为吸收。与水蒸气蒸馏法相比较，该法具有耗时少，提取安全等优点。 SCFE技术对于提取分离挥发性成分、脂溶性物质、高热敏性物质以及贵重药材的有效成分显示出独特的优点，但SCFE设备属高压设备，一次性投资较大，运行成本高，因此这一技术目前在工业生产中还难以普及。 2. 超声提取技术 超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散。击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、
酶解法提取食用菌多糖 食用菌多糖是由l0个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，存在于食用菌的菌丝体、子实体和发酵液中。食用菌多糖有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和抗感染活性【1，同时还有增强免疫、抗氧化、降低血糖、抗溃疡、抗衰老、抗辐射等方面的生物活性和生理功能 食用菌组成复杂，除多糖外还含有蛋向质、纤维素、半纤维素和果胶等物质，这些物质的存在会影响多糖的浸L叶J．因此在多糖提取过程巾适当加人酶制剂如水解纤维素的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等有利于多糖的浸，在提高溶出效率的同时，为后续捉取液的精制创造有利条件{l0】。酶解法的一般方法为按一定料液比加入样品干粉和生物酶、蒸馏水，在合适温度和pH值下酶解一定时间，然后升温灭酶，在合适的温度下提取一定时间，离心取上清液，即可测定多糖含量I?。以下分别介绍单一酶法和复合酶法在食用菌多糖提取巾的应用。 1．1 单一酶法提取食用菌多糖单一酶法是指一种酶来辅助提取食用菌多糖，从而提高多糖提取率。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等。 蛋白酶可破坏蛋白质的肽键，水解细胞中的游离蛋白质．破坏其空问结构，使其变得松散。同时蛋白酶还可水解蛋白聚糖和糖蛋白中的蛋向质，降低其对多糖的结合率，使多糖更易浸}H。刘青娥I?彳F推荐的最佳提取条件下分别考察了果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶对袖珍菇多糖提取效率的影响，以直接水提法为对照，结果显示木瓜蛋白酶酶解法有最佳提取效果，多糖提取率提高了95％，试验考察了酶解温度、酶用量、pH和酶解时问对木瓜蛋白酶法多糖得率的影响．得的结果是酶解温度为50℃左右时多糖提取率最高，随着温度的升高，多糖提取率下降；木瓜蛋白酶朋量为2．O％。冈浓度增加到2．0％以后，再增加酶用量多糖提取率基本不再增加；最佳酶解pH 值为5．2，因酶对pH值较为敏感，适当的pH值可维持酶活性中心的最佳空问构象，促进酶与底物的结合，提高反应速率：多糖得率随着酶解时间的延长而增加，超过100 rain时有所下降，是由于酶解时间太长会引起糖结构变化甚至碳环裂解，致使多糖得率降低。 纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，从而使细胞内的成分更易向提取介质扩散，食用菌多糖存在于子实体的细胞壁内，细胞壁的结构由纤维素维持，使用纤维素酶可水解细胞壁，提高多糖的浸率。刘晓鹏等I l利用纤维素酶辅助提取茶树菇多糖，比较了酶解法和水提法2种方法，水提法提取茶树菇多糖料液比为1：60，提取时间120 rain．温度为6O℃时提取效果最佳，其多糖平均提取率为1．40％。纤维素酶酶解辅助提取茶树菇多糖的平均提取率为2．38％，比水提法提高了70．47％。纤维素酶酶解辅助提取茶树菇子实体多糖的料液比为1：80，酶浓度1．5％，浸提液DH值为6．0，提取温度为50℃，提取时间为60rain．可以发现纤维素酶解法节省原料，缩短了提取时间，反应条件更为温和．提取率更高。而刘青娥?的酶法提取袖珍菇多糖试验中，纤维素酶酶解法较之水提法多糖提取率提高了42％。李清等llU 以羊肚菌为实验材料研究了酶法提取的T 艺条件．其中纤维素酶加量为15％，温度为 45℃．提取时间为1 h时，其多糖浸提率为2．063％，优于水浸提法，同样条件的热水浸提法羊肚菌多糖得率仅为0．56％。使用纤维素酶提取食朋菌多糖优于水提法，其条件温和．提取率高且不影响后续提取。 1．2 复合酶法提取食用菌多糖
用酶法从虎杖中提取白藜芦醇的工艺流程图 45—50℃, PH4.8±0.2,沿壁缓慢 加入HCl调节PH值,轻轻搅拌 加复合酶增加收率原因：一是植物细胞壁被破坏，使内容物溶出率增加；二是白藜芦醇苷在复合酶的作用下被转化成白藜芦醇。 可用复合酶SPE—002、SPE—007醇提前和醇提后的酶解结果与单独进行乙醇提取得率进行比较。
从茶叶中提取茶多酚 过滤 提取物 酶提法优点： ○1可以软化植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出，提高收率；对茶叶进行复合酶法提取, 茶多酚提取率可达98 %以上; 酶解法提取的茶多酚中儿茶素相对含量较沸水提取的高出9 %～10 %。○2酶法提取茶多酚及多糖具有提取率高, 且茶多酚的主要活性成分———儿茶素氧化损失少, 原料茶叶不需粉碎○3节省时间，降低成本；
酶法提取红景天有效成分的工艺流程图 1、酶提法 红景天 SPE —001或007 提取物〈 2、醇提法（略） 3、水提法（略） 酶提法优点： ○1可以使植物细胞壁破裂，使有效成分最大限度溶出，提高收率； ○ 2可替代水提醇沉工艺，节省时间，降低成本； ○ 3可降解红景天中的氨基酸、多肽、多糖、易于滤过。 每次分别为3、2、1小时 粉碎
1、酶提法 菊花 SPE — 007 提取物 2、醇提法（略） 3、水提法（略） 酶提法、醇提法与水提法进行比较 SPE-007：主要用于破除植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出。SPE-006：主要用于提取液的沉清，加快滤过速度，降低成本。 加7倍量水 60℃水浸泡30min 40℃温水，PH ：4.8 活化5—10min 1∶10倍量水溶解酶 用水煎煮3h 温度降至45-52℃，PH ：3.5—4.5,时间1.5h 提取液 用SPE-006（干物 质重量）的40ppm
0引言 灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，素有“仙草”之美誉[1]。古今药理与临床研究均证明，灵芝有防病治病延年益寿之功效。而灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗衰老以及活血化瘀等广泛的药理活性[2-5],因此灵芝多糖也是目前灵芝研究的一个热点。 灵芝多糖存在于子实体的细胞壁内壁，而子实体结构紧密，在提取过程中传质阻力比较大，且灵芝多糖相对分子量很大，仅靠单纯的扩散原理的传统提取方法的提取效率较低。而酶法是一种通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程，能最大限度提取中药有效成分的方法[6]，越来越受到重视。故本试验选取灵芝作为酶法提取的对象，试图破坏灵芝的细胞壁结构，来提高灵芝多糖提取效率，对于实际应用有着现实的意义。 1仪器与试药 HY-02型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司），上海菁华754分光光度计，电子天平，HH-S型恒温水浴锅（江苏国盛实验仪器厂），循环式多用真空泵SHZ-IIIB（临海市谭氏真空设备有限公司）。 灵芝子实体（江苏农林职业技术学院食用菌研究所）；纤维素酶活力≥400U/mg；浓硫酸、苯酚、无水葡萄糖、乙醇均为国产分析纯。 2方法与结果 2.1多糖的提取方法 干燥的灵芝切片在高速粉碎机下粉碎至一定粒度，精密称取0.25g的灵芝粉及适量的纤维素酶加入去离子水在一定温度水浴下进行酶解提取，后在沸水浴中灭酶4分钟，抽滤得提取液。 2.2多糖的含量测定方法 2.2.1还原糖的测定-DNS法[7] 2.2.1.1试液的制备 对照溶液的制备：精确称取在105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品25mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀即得。 样品溶液的制备：灵芝多糖提取液定容至100ml，移取50ml减压蒸馏浓缩后加蒸馏水至10ml，备用。 2.2.1.2样品还原糖的测定方法 精密吸取样品液1ml，对照品溶液1ml，分别置于25ml容量瓶中，各加1.5mlDNS试剂，摇匀置沸水浴中加热5min，迅速用凉水冷却。分别加水至刻度，摇匀。以水1ml按同样方法操作所得溶液作空白，在520nm分别测定吸光度值。 2.2.1.3样品还原糖量的计算方法 还原糖量=样品液吸光度值×每ml对照品中所含糖的克数×样品稀释倍数 标准品吸光度值 2.2.2总糖含量的测定—苯酚-硫酸法 2.2.2.1试液的制备 5%苯酚溶液的制备：精密称取5g苯酚(重蒸馏)，加水使之溶解，定容至100ml，棕色瓶保存。 对照品溶液的制备：精密称取10mg干燥至恒重的无水葡萄糖,加水使之溶解，定容至100ml，即得0.1mg/ml葡萄糖对照品溶液。 2.2.2.2标准曲线的绘制 分别精密量取0.1mg/ml葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于25ml比色管中，一次添加水至1.0ml，加入5%的苯酚1.0ml，摇匀，加入6.0ml的浓硫酸，迅速振摇混匀，于室温放置30min 后490nm处测吸光度。以葡萄糖溶液的浓度mg/ml为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。求得标准曲线回归方程为y=6.9650x+0.0057，r=0.9999，在0.02-0.10mg/ml范围内，葡萄糖曲线C与吸光度A线性关系良好。 2．2.2.3样品溶液总糖浓度的测定 将得到的提取溶液定容到100ml，精密移取2.0ml稀释定容至50ml，取1.0ml稀释液于25ml比色管，后加入5%的苯酚溶液1.0ml，振荡摇匀，加入6.0ml的浓硫酸，迅速振摇混匀，于室温放置30min后490nm处测A。 2.2.2.4灵芝总糖量计算 根据标准曲线计算出样品液中总糖的浓度后按下式计算总糖量。 灵芝总糖量=浓度×体积×稀释倍数 2.2.3多糖提取率的计算方法 灵芝多糖提取率=灵芝总糖量-还原糖量*100% 供试品量 2.3单因素试验 2.3.1酶量 固定其他因素，分别考察加酶量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时灵芝多糖的提取率。 图1酶量对多糖提取率的影响 由图1可知，在加酶量为0.5％～2.0％之间时，随着酶量的增加，整个体系中酶浓度上升，同一时间内酶与底物的接触机会增加，被酶水解的底物分子数增加，致使灵芝多糖能更多更快地提取出来。当酶量超过2.0％时，灵芝多糖的提取率略有增加，但考虑成本等因素，选择2.0％的酶量较为合理。 2.3.2酶解时间 固定其他因素，分别考察酶解时间为30min、60min、90min、120min时灵芝多糖的提取率。 图2酶解时间对多糖提取率的影响 由图2可见，随着酶解时间的增加，灵芝多糖的提取率也增加，到90min以后，多糖得率几乎不增大，故选择90min为最合适的酶解时间。 2.3.3料液比 固定其他因素，分别考察料液比为1:10、1:20、1:30、1:40条件下灵芝多糖的提取率。 图3液料比对多糖提取率的影响（下转第308页） 纤维素酶提取灵芝多糖的单因素研究 吕兴萍杨薇红马春娇 （江苏农林职业技术学院，江苏句容212400） 【摘要】利用纤维素酶从灵芝子实体中提取灵芝多糖，通过单因素实验研究酶量、酶解时间、料液比、酶解温度对灵芝多糖提取率的影响。实验结果表明：纤维素酶能够显著提高灵芝多糖的提取率，提取的最佳工艺条件为酶量2.0％，酶解时间90min，料液比1:30，温度50℃。 【关键词】灵芝多糖；提取；纤维素 酶 295
酶解法提取黑豆多糖的研究 魏俊青，肖春玲，陆 楠，张慧敏，王君翠，张海燕 （山西师范大学工程学院，山西临汾 ０４１００４） 摘 要：以黑豆为原料，采用不同种类的酶研究了提取黑豆多糖的技术，试验在不同的酶解浓度、温度、时间、ｐＨ值对黑豆多糖提取率的影响的基础上，用星点设计法优化了酶法提取黑豆多糖的最佳工艺参数。结果表明：在用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶进行的提取中，纤维素酶法提取率最高；最优的提取参数为酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ６．０、酶解时间１２０ｍｉｎ、酶解温度５０℃、黑豆多糖得率为０．３２１４％，与理论贴近度９９．４１％，各因素对多糖得率的影响顺序为ｐＨ＞酶解时间＞酶解温度。 关键词：黑豆；多糖；酶解法；星点设计 黑豆在我国种植范围很广，其具有高蛋白，低热量的特性［１］，黑豆还具有软化血管，润皮肤，延缓衰老的作用，特别是对高血压，心脏病，肝脏和动脉等方面的疾病有一定的疗效［２］。目前对植物中多糖的提取主要采用热水浸提法、碱浸提法、酸浸提法［３］。热水浸提法因它的溶剂是水，原料中的多糖不容易从细胞中大量溶出；碱浸提法和酸浸提法，因为原料的结构受到了破坏，提取率相对较低。目前利用酶解法提取多糖仅仅是在香菇、蓝莓、蛤蟆油［４－６］，而采用酶解法对黑豆中多糖的提取尚未见报道。试验以黑豆作为原料，采用酶解法，利用星点优化设计对黑豆中的多糖提取工艺进行优化，并确定其最佳参数，以期为黑豆酶解多糖的提取工艺提供理论依据。１ 材料与方法 １．１ 试验材料与试剂 黑豆购于临汾新银河超市；石油醚、无水乙醇、无水葡萄糖标准品、乙醇（９５％）、浓硫酸、苯酚、柠檬酸、氨水均为分析纯；纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶均购于华科生化试剂商城。 １．２ 主要仪器与设备 ｐＨＳ－３ＴＣ精密数显酸度计，上海沪粤明科学仪器有限公司；ＲＪ－ＴＤＬ－４０Ｃ台式低速大容量离心机，上海精科实业有限公司；ＵＶ－１１００型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Ｆ８０高速粉碎机，金城市金城国胜实验仪器厂。 收稿日期：２０１２－０６－１８ 基金项目：山西师范大学大学生创新性训练项目（ＳＤ２０１２ＣＸＳＹ－０６）；山西师范大学科研课题组（８７３０４１）。 作者简介：魏俊青（１９８８－），女，学士，食品科学。 通信作者：肖春玲（１９６８－），女，教授，硕士，主要从事食品科学教学研究工作 櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭 。 播种，种植密度为１．２万株／６６７ｍ２）处理组合的油菜产量最高，达２３２．０ｋｇ／６６７ｍ２。 另外，试验结果是在一年试验条件下获得，由于播期试验受年度间气候因素的影响，不同年度最适播期可能有所不同，存在一定的差异，如何更合理地安排播种期、科学施肥，进行标准化栽培，以提高秦优１９在适宜区的商品性和经济收益，有待今后进一步的研究和探索。 参考文献： ［１］ Ａｓｔｈａｎａ．Ａ．Ｎ．ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉａｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ａｔ ｔｗｏｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｕｎｉｒｒｉｇａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｌｎｄ．［Ｊ］．Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉ，４３ （１）：３８－４１． ［２］ 梁建芳，和中秀．春油菜青杂２号在湟中县川水地区种植密度试验初报［Ｊ］．甘肃农业科技，２００５， （１０）：１８－２０． ［３］ 官春云．甘蓝型油菜产量形成的初步分析［Ｊ］．作物学报，１９８０，６（１）：３５－４４． ［４］ 刘后利主编．实用油菜栽培学［Ｍ］．上海：上海科技出版所，１９８７，２２０－２３０，３３０－３４５． ［５］ 杨经泽，徐育松．等．油菜密植增角的高产裁培模式［Ｊ］．中国油料，１９９３，（２）：４９－５２． ［６］ 袁继超，张垃仲．雅安地区蓉油３号综合高产栽培技术研究［Ｊ］．四川农业大学学报，１９９７，１５ （３）：３５－５４． · ６ ·陕 西 农 业 科 学２０１３（１）
纤维素酶的分离及纯化方案 纤维毒酶已广泛应用于食品、医药、饲料和纺织等领域。 纤维素酶来源广泛、组分复杂,各组分的分子量和等电点相差很小,分离纯化工作比较困难；而纤维素酶的分纯工作非常重要,只有得到纯酶,才能了解其组成、性质及相互关系,并可根据纤维素酶的不同理化性质纤维材料的作用特点,开展纤维素降解机制的研究,为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和ＤＮＡ体外定点诱变等提供依据。 1 材料 1.1 粗酶液：取菌种发酵液于4℃,8000rpm,离心15分钟,收集上清液即为粗酶液。 1.2 纤维素酶分离纯化材料与介质透析超滤材料:10,000ＮＭＷＬ透析袋;分离纯化介质:SephadexG-100；SephadexG-75；SephadexG-50 1.3 主要仪器:柱层析系统；ＤＹＹ-2稳压稳流电泳仪；ＤＹＹ-ｍ24Ｄ型电泳槽；层析柱50ｃｍ× 2.6cm；紫外检测仪；记录仪;分步收集器;高速冷冻离心机;全温震荡培养箱。 2 方法 2.1 纤维素酶活力测定方法:3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶 活力 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 2.2 蛋白质含量测定：采用Bradford法测定蛋白质含量,以牛血清白蛋白(ＢＳＡ)做标准曲线。 采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliant blue，G250，简称CBB—G250)作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBB—G250单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋
酶解法提取小龙虾副产物中的蛋白质 摘要：本文对酶解法从小龙虾副产物中提取蛋白质的工艺条件进行了研究。通过单因素实验和正交实验确定酶解法制备小龙虾副产物中蛋白质的最佳水解条件为：酶解温度50℃，酶解时间3h，酶与底物比9300u/g，PH=7。此条件下蛋白质的提取率为94.02%。 关键词：龙虾；副产物；蛋白质；酶解。 LI Ya-nan，WANG Hai-bin*，WANG Qi (College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China) Abstract: Key words:chicken lobster; coproduct; enzymatic; protein.
小龙虾是生长在淡水中的甲壳类动物，学名克氏原螯虾，广泛分布于我国湖北、江苏、江西、安徽等长江中下游各省市。虾头、虾壳占虾体重的70%～80%[12]，含有丰富的氨基酸、多肽、蛋白质和其他营养素[11]。 小龙虾虾头蛋白质中必需氨基酸占45.33％，与牛奶蛋白粉的45.69％和酪蛋白的46.14％基本接近[14,15]。是极好的蛋白质来源，具有很高的开发价值[l-3,10,18]。虾头、壳中游离氨基酸的种类较齐全、含量丰富，必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的41.52％，必需氨基酸与非必需氨基酸比值为70.99％[16]。 水解动物蛋白(HAP)富含人体所需的各种氨基酸，营养价值高，容易消化吸收，并能很好地保持动物原料固有的风味特点，可作为香精香料的基料或直接用于食品工业，近年来得到迅速发展和广泛应用。[10] 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1材料 克氏原螯虾虾头：湖北楚玉食品有限公司 碱性蛋白酶：sigma 1.1.2 试剂 双缩脲试剂、氢氧化钠、氯仿、甲醇、缓冲溶液等。 1.2 仪器与设备 万能粉碎机 SHA-C显数恒温水浴振荡器 V-1100可见分光光度计 智能型台式超声波清洗器 旋转蒸发仪 恒温水浴锅 数显鼓风干燥箱 分析天平 1.3方法 1.3.1 原料预处理 虾壳解冻，淋干水分，放入105℃烘箱中烘干取出，万能粉碎机粉碎备用。 1.3.2 酶解工艺流程 取虾粉5g→加缓冲溶液及酶混合→恒温水浴震荡酶解→冰水浴冷却。 1.3.3 理化指标测定 水分：直接干燥法。GB 5009.3-2010 灰分：高温灼烧法。GB 5009.4-2010 粗脂肪：氯仿甲醇法。 粗蛋白：凯氏定氮法。GB 5009.5-2010
摘要:介绍了提取新技术酶法的原理,以及酶处理技术在中草药各部分提取工艺的研究应用现状,并展望了酶处理技术的应用前景。 关键词:酶法，提取 Abstract: The extraction of the principle of the new enzyme technology and processi ng technology of Chinese herbs in all parts of extraction process of application status and prospects of processing applications. Key words: enzymatic extraction [中图分类号] [文献标识码] A [文章编号] 现代中药提取中越来越多的应用到纤维素酶，纤维素酶可以快速、温和的分解细胞壁，使中药有效成分析出。恰当地利用纤维素酶处理中药材，可改变细胞壁的通透性，提高药效成分的提取率。本文就酶法提取的原理以及酶法对于中草药不同部位的提取情况作一综述。 1.酶法提取的原理 中药中植物药占90%，植物细胞由细胞壁及原生质体组成。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质，木质素等物质构成的致密结构，一般分为3层，即胞间层、初生壁和次生壁。胞间层的主要成分为果胶质。初生壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成。初生壁的结构甚为复杂，由纤维素分子组成的微纤丝构成了其基本骨架，在微纤丝之间的空隙中，填着果胶质和半纤维素的胶体状物质。和初生壁一样，次生壁的骨架也是由纤维素分子组成的微纤丝构成[1]。在中药提取过程中，细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。通过选用一些恰当的酶类，如纤维素酶、半纤维索酶、果胶酶等作用于药用植物细胞，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶等物质降解，破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率提高[2]。中药酶法提取是在传统的溶剂提取方法的基础上，根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有
四、酶的提取技术 1、酶提取的方法 （1）盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、（NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同，一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。但是由于（NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高，故在生产上普遍应用（NH4)2SO4。一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。 以中性盐盐析蛋白酶时，酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。在高盐溶液中，温度高时酶蛋白的溶解度低，故盐析时除非酶不耐热，一般不需要降低温度。如酶蛋白不耐热，一般需冷却至30℃盐析。 同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的，利用这一性质，在酶液中先后添加不同浓度的中性盐，就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来，这就是分步盐析法。分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术，采用此法分离不同的酶或蛋白质，必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。 盐析法的优点：不会使酶失活；沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少；沉淀物在室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。 用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小，而母液的相对密度较大，故用离心分离法分离时分离速度慢。 （2）有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清
楚。各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强，但因挥发损失相对较少，价格也较便宜，所有工业上常以作为沉淀剂。有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质，但其效果不如分部盐析法好。 按照食品工业用酶的国际法规，食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类（食盐等例外），所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质，而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。由于具有此种特点，此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。又由于它不需要脱盐，操作步骤少，过程简单，收率高，国外食品工业用的粉剂酶如霉菌的淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶和纤维素酶等都是用有机溶剂一次沉淀法制造的。 为了节省有机溶剂的用量，一般在添加有机溶剂前先将酶液减压浓缩到原体积的40%~50%。有机溶剂的添加量，按照小型实验测定的沉淀曲线来确定。要避免过量，否则会使更多色素、糊精及其他杂质沉淀。 除以上两种方法外，还有单宁沉淀法、吸附法等提取方法，此外还有酶的精制技术等。 2、酶提取的过程 （1）发酵液预处理如果目的酶是胞外酶，在发酵液中加入适当的絮凝剂或凝固剂并进行搅拌，然后通过分离（如用离心沉降分离
酶法提取山茶油的工艺研究 山茶油是从山茶科(Camellia)山茶(CaroLelliafera AbeL)树种子中获得的,是我国最古老的木本食用植物油之一。浙江省是我国山茶的中心产区之一,主要分布在常山、开化等浙南部的山地丘陵,其栽培历史有2300年以上。 山茶油具有很高的药用价值,《中国药典》(95版)将山茶油列为药用油脂。油脂的提取工艺包括:压榨法、浸出法、超临界流体萃取法和酶法提取等,而酶法提取工艺又包括水酶法、酶法辅助冷浸出法或压榨法、水相酶解萃取法。 各个方法间都有其优缺点。本文采用酶法提油工艺,首先优化了酶法提取山茶油的工艺,考察酶的用量、体系pH值、含水量、温度、反应时间等一系列影响因素,结果是3%的中性蛋白酶/山茶籽、pH7.0、含水量44.4%、温度40℃、反应时间18 h是最佳的工艺条件。 在单因素的基础上,响应面优化的结果是酶法提取山茶籽油的最优三个提取条件为:pH值为6.82,缓冲液体积4.18 mL,温度45℃,在最佳条件下酶解压榨后山茶籽饼粕的残油率8.6%明显低于普通山茶籽饼粕的残油率9.97%,得到结论,酶解预处理可以提高压榨出油效果。其次优化了浸出法提取山茶籽饼粕油的工艺,单因素实验考查粉碎颗粒大小、提取次数、溶剂用量、径高比、温度对山茶籽饼粕油提取效果的影响。 以山茶籽饼粕的提油率作实验结果的考察指标。得到的结论是选定提取次数为一次;溶剂用量选用11 mL/10g山茶籽饼粕,即此时溶剂用量和山茶籽饼粕的比值为1.1:1(v/m);在40℃下,浸出过程较为强烈,浸出速度较高;径高比选定为 1/13.6;山茶籽饼粕的颗粒大小越小,饼粕与溶剂的接触面积越大,有利于提油率的增加。