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．基础实验诊断研究．
调节高致病力ＣＡ．ＭＲＳＡＯｔ一毒素表达的
基因筛选及功能研究
李敏胡锦辉李茹张心菊阮斐诒吕元
【摘要】目的从ＣＡ?ＭＲＳＡ全基因组水平筛选出除域值感知（ｑｕｏｒｕｍ
ｓｅｎｓｉｎｇ）基因系统以外对ａ一毒素表达有明显调节作用的基因，并研究其调
节机制。方法使用本实验室构建并已申请国家专利的真核转座酶为基
础的转座系统构建ＣＡ－ＭＢＳＡ转座子，并随机插入突变文库。通过用５％
羊血平板筛选出与野生株相比溶血明显改变的克隆，接着用定量ＲＴ－ＰＣＲ
以及ＷＢ等实验筛选出ａ一毒素表达明显下降的突变菌株，运用随机引物
反向ＰＣＲ和测序等方法鉴定出突变基因。通过基因互补表达实验、小鼠
菌血症与皮肤脓肿模型实验以及荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ等方法对目标基因以
及其编码蛋白的功能进行研究。结果在ＣＡ－ＭＲＳＡ中建立了一个库容
量约为１０４个克隆的转座子随机插入突变库，最终筛选出２５株仅一毒素表
达明显下降的突变菌株。ＣＡ．ＭＲＳＡ野生株溶血直径平均为２１２ｍｍ，而其中ＡｒａＣ转录调节子突变株
（ＡｒａＣ－）几乎无溶血，当将ＡｒａＣ基因互补回突变株（ＡｒａＣ—ｐＴｌ８１ａｒａＣ）后，其溶血直径平均为１９７ｍｉｌｌ，
部分恢复到野生株溶血水平。荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ结果显示。与ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株（ＰＳＭａ为２５７．３０±
３７．３３，ａｇｒ为１１５．６０±Ｏ．８１，ｄ．毒素为３．２３±０．２１）相比，在ＡｒａＣ冲Ｏｔ－毒素、ＰＳＭａ以及ａｇｒ表达均
明显下调（叶毒素１．０９±０．０１：ｔ＝１０．１８，Ｐ＜０．０１；ＰＳＭａ３４．８５±２．１５：￡＝５．９５，Ｐ＜０．０５；ａｇｒ３５．１９
±１．７２：ｔ＝４２．３３，Ｐ＜０．０１）。小鼠菌血症模型实验结果为ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株与ＡｒａＣ．（露±５）差异具
有统计学意义（，＝２１．３４，Ｐ＜０．０１）。ＡｒａＣ－ｐＴｌ８１ａｒａＣ中ＰＳＭａ、ａ乳ａ－毒素（—‰）表达（分别为
ＰＳＭａ：１８０．１０±１５．２９，ａｇｒ：１０１．５０±８．９６，Ｃｔ．毒素：２．５９±０．２６）均部分恢复到野生株表达水平，与
ＣＡ－ＭＲＳＡ野生株相比，差异无统计学意义（ＰＳＭａ：ｔ＝１．９１４，Ｐ＞０．０５；ａｇｒ：ｔ＝１．５６３，Ｐ＞０．０５；Ｃｔ一毒
素：ｔ＝１．９２３，Ｐ＞０．０５）。ＣｌｐＰ在ＡｒａＣ－（０．２１±０．０１）和ＡｍＣ－ｐＴｌ８１ａｒａＣ（０．１７±０．０３）中的表达与
ＣＡ－ＭＲＳＡ野生株（０．２０４－０．０１）相比，差异无统计学意义（ｔ＝Ｏ．５５５，Ｐ＞０．０５和ｔ＝０．８５１，Ｐ＞
０．０５）。小鼠皮肤脓肿模型结果显示，ＣＡ．ＭＲＳＡ野生株接种的小鼠皮肤表面脓肿面积为（１３６．５４－
２１。４５）ｍｍ２，ＡｒａＣ－接种的小鼠皮肤表厩脓肿面积（５５。６９±１３．８１）１１１１１１２，ｃＡ—ＭＲＳＡ野生株与ＡｒａＣ－
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍｓ．ｊ．ｉ眦１００９－９１５８．２０１０．０７．０１９
基金项目：上海市浦江人才计划（Ａ）类资助项目（０９ＰＪｌ４０２３００）；国家自然基金资助项目（３０９０００２６）
作者单位：２０００４０上海，复旦大学附属华山医院检验医学科（李敏、胡锦辉、李茹、阮斐诒、吕元），中心实验室
（张心菊）
通信作者：吕元，电子信箱：ｙｕａｎｈ＠ｌａｓｈ．ｓｔｎ．ｓｈ．ｃｎ
作者简介：李敏，女，１９７５年１月出生。２００５年毕业于复旦大学上海医学院临床检验诊断学专业，获博士学
位。２００８年于美国ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）博士后出站回国。复旦大学附属华山医院副研究员，硕士生导
师。主要从事重要病原微生物致病机理的研究。
注：本文在第六次全国中青年检验医学学术会议暨第三届中国检验医学中青年论坛阳普优秀论文奖评选活动
中荣获一等奖。
本文直接使用的缩略语：ＣＡ－ＭＲＳＡ（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｍ口啪瑚），社区获得
性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；ＨＡ．ＭＲＳＡ（ｈｏｓｐｉｔａｌ．ａ啪ｃｉａｔｅｄｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓ蠡叩锄【Ｄ。ｏｃｃ郴㈣艘ｕ）。医院
获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；ＲＴ－ＰＣＲ（ｍｖｅｎｍ４ｒａｎｓｃｄｐｆｉｏｎｐｏｌｙｍｅｎｍｅｃｈ茸ｉｎ地ａｃｌｉ帆），逆转录聚合酶链
反应；ＰＳＭｑ（ｐｈｅｎ０１．ｓｏｌｕｂｌｅｍｏｄｕｌｉｎｎ），酚溶调控蛋白ａ；ａＦ（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ８ｅｒｉｅｍｇＩｌｌａｌｏｒ），附属基因调节子；
ＣｌｐＰ（ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＣｌｐｐｒｏｔｅａｓｅ），ＡＴＰ依赖性Ｃｌｐ蛋白酶；ＷＢ（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）。免疫印迹法
生堡捡坠匡堂盘壶垫！Ｑ生！旦筮！！鲞箍！翅ｇ毡！』丛幽：地垫！Ｑ：堕堑：坠Ｚ
ＤＮＡ污染的去除以及逆转录成ｃＤＮＡ按Ｑｉａｇｅｎ公司ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔｉ陀ｖｅｉ＇ＢｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ说明书进行。定量ＰＣＲ按Ｑｉａｇｅｎ公司ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲｇｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ说明书在ＡＢＩ７０００荧光定量ＰＣＲ仪上进行，定量ＰＣＲ引物见表ｌ，每一基因的标准曲线用０．００５－５０彬Ｌ金黄色葡萄球菌基因组ＤＮＡ作为模板获得。ｇｙｒＢ为内参，每次实验至少重复３次。
８．统计学分析：采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０统计软件进行统计分析。ＲＴ．ＰＣＲ检测毒力因子表达值各组间比较采用ｔ检验，小鼠菌血症体内模型的死亡曲线各组间比较采用生存曲线（ｓｕｒｖｉｖａｌｃｕｒｖｅ）的ｒ分析，小鼠皮肤脓肿模型脓肿面积各组间比较采用ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果
１．红霉素抗性基因ｅｒ？ｎ插入到ＣＡ－ＭＲＳＡ基因
组的单一随机性鉴定：通过随机选取５０个阳性克隆，通过ＰＣＲ以及序列测定方法确定嗍插入位点。结果显示，随机插入率为８６％（４３／５０），无明显插人热点。以珂７，ｌ为探针进行的ＳｏｕｔｌＩｅｍｂｌｏｔ结果显示所有克隆基因组ＤＮＡ中ｅｒｍ均为单一性插入。
２．对ＣＡ—ＭＲＳＡ仅一毒素表达有明显调节作用的基因鉴定：初步筛选出２５株理一毒素表达与野生株相比明显下降的突变菌株，这些突变菌株被佩破坏的基因功能预测发现对ｏｔ?毒素表达有明显调节作用的蛋白有些为调节蛋白：ＳＡＵＳＡ３００—２３２６（ＡｒａＣ－ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ＳＡＵＳＡ３００—０２０９；有些为膜蛋白：ＳＡＵＳＡ３００—２０５７、ＳＡＵＳＡ３００—２２８２；有些蛋白与代谢有关：ＳＡＵＳＡ３００—１６７６、ＳＡＵＳＡ３００—０４８３；有些蛋白功能未知：ＳＡＵＳＡ３００—１７２０、ＳＡＵＳＡ３００＿２０５６。
３．ＡｒａＣ一与野生株及ａｒａＣ基因互补株（ＡｒａＣ．ｐＴｌ８１ａｒａＣ）表型的异同点：与ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株相比，ＡｒａＣ一在５％羊血平板上几乎无溶血（图１），而ＡｒａＣ—ｐＴｌ８１ａｒａＣ能恢复到与野生株相似的溶血能力。图２是ＡｒａＣ－、野生株及ＡｒａＣ—ｐＴｌ８１ａｒａＣ的生长曲线，ＡｒａＣ一生长比野生株略慢一些，但当将ａｒａＣ基因互补回ＡｒａＣ．后，ＡｒａＣ—ｐＴｌ８１ａｒａＣ生长可以恢复到与野生株相似的速度。
４．ＡｒａＣ转录调节子基因特点及册插入部位：ＣＡ．ＭＲＳＡ的ＡｒａＣ转录调节子是含有包括ＡｒａＣ结构域在内的多结构域蛋白，由７０１个氨基酸组成，ＡｒａＣ结构域位于整个蛋白Ｃ端（从第１５０到２５０个氨基酸），约由１００个氨基酸组成。对ＡｒａＣ转录调节子突变株进行测序发现佩插入部位位于编码ＡｒａＣ结构域基因中部，在ＡｒａＣ结构域第１８５个氨基酸处，破坏了ＡｒａＣ结构域的结构，使其无法发挥功能。
注：ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株溶血直径平均为２１２衄，而ＡｒａＣ一几乎
无溶血，当将ＡｒａＣ基因互补回突变株后（ＡｍＣ?ｐＴｌ８１ａｒａＣ）
其溶血直径平均为１９７ｍｍ，部分恢复到野生株溶血水平
田１ＣＡ?ＭＲＳＡ野生株、ＡｔａＣ一以及ＡｒａＣ—ｐＴｌ８１ａｒａＣ在５％
羊血平板上的溶血情况
注：ＡｍＣ．在培养４ｈ末Ａ值为２．０７±Ｏ．０４，在培养８ｈ
末Ａ值为３．５７±ｏ．１１；ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株在培养４ｈ末
Ａ值为２．６１土Ｏ．１０。在培养８ｈ末Ａ值为４．１２土ｏ．０３；
ＡｍＣ－ｐＴｌ８１ａｒａＣ在培养４ｈ末＾值为２．５４±０．０４，在
培养８ｈ末Ａ值为４．０１±Ｏ．０２。ＡｍＣ－生长略慢于ＣＡ—
ＭＲＳＡ野生株。当将ＡｍＣ基因互补回突变株后（ＡｍＣ?
ｐＴｌ８１ａｒａＣ）生长速度与野生株相似
圈２ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株、ＡｒａＣ一以及ＡｍＣ?ｐＴｌ８１口ｗａＣ的
生长曲线
５．ＡｒａＣ转录调节子对ＣＡ．ＭＲＳＡ毒力的调节（体内实验结果）：通过小鼠菌血症模型和皮肤脓肿模型进一步研究ＡｒａＣ转录调节子对ＣＡ．ＭＲＳＡ毒力的影响。图３为小鼠菌血症模型结果，我们连续观察７ｄ，ＰＢＳ对照组小鼠活动良好，无死亡；ＣＡ－ＭＲＳＡ野生株７ｄ末小鼠的存活率只有１０％；ＭａＣ一７ｄ末小鼠的存活率为５０％，小鼠菌血症模型实验结果ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株与ＡｒａＣ．存活率（孑４－ｓ）差异具有统计学意义（Ｘ２＝２１．３４，Ｐ＜Ｏ．０１）。图４为小鼠皮肤脓肿模型结果，连续观察１４ｄ，ＰＢＳ对照组小鼠皮肤表面未见脓肿产生，ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株接种的小鼠皮肤表面脓肿面积为（１３６．５４－２１．４５）ｍｍ２，ＭａＣ．接种的小鼠皮肤表面脓肿面积（５５．６９４－
１３．８１）ｍｍ２，ＣＡ—ＭＲＳＡ野生株与ＡｒａＣ?小鼠皮肤脓
肿面积差异具有统计学意义（ｔ＝３．１６９，Ｐ＜Ｏ．０５）。
图３小鼠菌血症模型实验结果
圈４小鼠皮肤脓肿模型实验结果
６．ＡｒａＣ转录调节子对ＣＡ．ＭＲＳＡ重要毒力因子的表达调控：通过定量ＲＴ—ＰＣＲ方法在转录水平分析ＡｒａＣ转录调节子对目前已知的重要的毒力因子如ＰＳＭａ、ａｇｒ、ａ毒素（ｈ／ａ）以及ＣｌｐＰ的表达调控。表２为ＡｒａＣ转录调节子对ＣＡ．ＭＲＳＡ重要毒力因子的表达调控结果，检测结果采用相对定量（检测基因的拷贝数／内参基因ｇｙｒＢ的拷贝数），ＲＴ—ＰＣＲ检测结果各组间比较采用ｔ检验。与ＣＡ－ＭＲＳＡ野生株相比，在ＡｒａＣ－中ＰＳＭａ、ａｇｒ、Ｏｔ．毒素表达明显降
低（ＰＳＭａ：ｔ＝５．９４９，Ｐ＜ｏ－０５；ａｇｒ：ｔ－－４２．３３，Ｐ＜０．０１；Ｏｔ一毒素：ｔ＝１０．１８，Ｐ＜０．０１），ＡｒａＣ—ｐＴｌ８１ａｒａＣ中
ＰＳＭａ、ａｇｒ、仅－毒素（ｈｌａ）表达均部分恢复到野生株表达水平，与ＣＡ．ＭＲＳＡ野生株相比差异无统计学
意义（ＰＳＭａ：ｔ＝１．９１４，Ｐ＞０．０５；ａｇｒ：ｔ＝１．５６３，
Ｐ＞０．０５；Ｏｔ．毒素：￡＝１．９２３，Ｐ＞０．０５）。ＣｌｐＰ也是目前已知的ＣＡ．ＭＲＳＡ的毒力因子，实验结果显示，ＣｌｐＰ在ＡｒａＣ－和ＡｒａＣ－ｐＴｌ８１ａｒａＣ中的表达与ＣＡ－
ＭＲＳＡ野生株相比差异无统计学意义（ｔ分别为
０．５５５和０．８５０．Ｐ均＞０．０５）。
讨
论
ＭＲＳＡ是目前医院感染最常见的病原体之一，ＭＲＳＡ的感染症状轻重不一，严重时可致败血症、心内膜炎等［２］。最近的研究发现与ＨＡ－ＭＲＳＡ相比，ＣＡ—ＭＲＳＡ的致病力更强，预后差，传播速度更快，其毒力因子及致病机制更是目前国际各研究部门研究热点。２００６年ＣＡ—ＭＲＳＡ克隆株ＵＳＡ
３００一ＦＰＲ３７５７
的全基因组测序已完成，从而将对ＣＡ—ＭＲＳＡ的致病因子的研究推向高潮…。
从基因组水平筛选自己感兴趣的基因比较有效而可行的方法是利用有效的转座系统构建转座子突变文库。从目前发表的文章看用于构建转座子突变文库的转座系统主要为Ｔｎ５５１或Ｔｎ９１７【ｓＪ，但从我们实验室以及目前发表文献的研究结果发现这种转座系统用于革兰阳性菌后往往插入到几个特定的基因位点，不具有随机性插入到基因组的特点。为了解决这一问题，本实验室构建了新的真核转座酶为
基础的转座系统，研究结果证实真核转座酶为基础的转座系统具有良好的随机性、单一性、稳定地插入到革兰阳性菌基因组的特点，无明显基因的插入热点。这样建立的转座子突变文库具有非常高的随机性和实用性。目前我们已为该转座系统申请了专利（《一种用于革兰阳性菌的高效转座系统》，专利申请号：２００９１００５４０３１．４）。
我们用已申请专利的真核转座酶为基础的转座系统建立了ＣＡ—ＭＲＳＡ转座子突变文库。初步筛选出２５株Ｏｔ一毒素表达明显下降的突变菌株，这些Ｏｔ．毒素表达明显下降的突变株ｅｌｒ／Ｒ插入到基因编码的蛋白包括有调节蛋白、膜蛋白、与代谢有关的蛋白等。其中ｅｒｍ，插入到ＡｒａＣ转录调节子基因后该突变株与野生株相比几乎无溶血，而将该基因互补质粒转入突变株后可以恢复其溶血功能。ＡｒａＣ转录调节子是由７０１个氨基酸组成的、由多个功能域组成的调控蛋白，它包含一个保守结构．ＡｒａＣ结构域。对ＡｒａＣ转录调节子家族分子功能的研究在各类原
表２
ＡｒａＣ转录调节子调节毒力因子表达的ＲＴ－ＰＣＲ结果（检测基因拷贝数／内参基因ｇｙｒＢ拷贝数）
调节高致病力CA-MRSA α-毒素表达的基因筛选及功能研究
作者：李敏， 胡锦辉， 李茹， 张心菊， 阮斐诒， 吕元， LI Min， HU Jin-hui， LI Ru，ZHANG Xin-ju， RUAN Fei-yi， L(U) Yuan
作者单位：李敏,胡锦辉,李茹,阮斐诒,吕元,LI Min,HU Jin-hui,LI Ru,RUAN Fei-yi,L(U) Yuan(复旦大学附属华山医院检验医学科,上海,200040)， 张心菊,ZHANG Xin-ju(复旦大学附属华山医
院中心实验室,上海,200040)
刊名：
中华检验医学杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE
年，卷(期)：2010,33(7)
参考文献(14条)
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2.李敏附属基因调节系统（agr）-Ⅰ型对表皮葡萄球菌生物膜形成调节关系的研究[学位论文]2005
本文链接：https://www.doczj.com/doc/027553417.html,/Periodical_zhyxjy201007019.aspx