实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应
一、目的意义
1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。
2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应
当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸
和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。
该反应十分灵敏，1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应
含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。
OH +
HNO 3
HO
NO 2
+
H 2O
HO
NO 2
+
O
N
OH
OH
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。
(2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。
(3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。
(4) 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。
2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。
四、操作方法
1、双缩脲反应
(1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加
热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2
滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。
(3) 注意事项
加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。
(4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。
2、茚三酮反应
(1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL
0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。
(2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴
一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。
(3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。
3、黄色反应
向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
实验二蛋白质的沉淀反应
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出（浑浊现象），此现象叫蛋白质的沉淀反应。
（一）蛋白质的盐析作用
一、目的意义
了解盐析法及可逆沉淀的原理，学习用盐析法沉淀分离蛋白质。
二、实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。
盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实验时要加足够量的盐。
蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。
三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。
⑵饱和硫酸铵溶液；
⑶10%氢氧化钠溶液；
⑷1%硫酸铜溶液。
四、操作方法
1、取蛋白质溶液约2mL于试管中，加入过量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置3分钟则析出沉
淀。
（二）重金属盐类沉淀蛋白质
一、目的意义
了解重金属盐类沉淀法的原理，学习用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。
二、实验原理
溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。
重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解，此时的溶解为生成憎水胶体的缘故。
三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；
⑵5% CuSO4溶液；
⑶3%AgNO3溶液。
四、操作方法
1、取试管2支各加蛋白质溶液1mL。
2、向各管分别滴加2－3滴加5％CuSO4溶液、3％AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。
3、在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入5％CuSO4
溶液，观察沉淀的溶解。
（三）有机酸沉淀蛋白质
一、目的意义
了解有机酸沉淀法的原理，学习用有机酸沉淀法沉淀分离蛋白质。
二、实验原理
生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成不溶性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛地被用于沉淀蛋白质，为首选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物，加热可除去。
三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；
⑵5%三氯醋酸溶液；
⑶5% 单宁酸溶液。
四、操作方法
1、取蛋白质溶液1mL于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。
2、取蛋白质溶液1mL于试管中，加数滴单宁酸溶液，观察现象。
实验三氨基酸的纸层析
一、目的意义
1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
2、学习纸层析的操作技术，分离鉴定未知样品的氨基酸成分。
二、实验原理
纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品在滤纸上（此点称为原点），用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值Rf来表示的
在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某物质的Rf值是一个常数，借此可作定性分析依据。
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 氨基酸标准溶液：1%的甘氨酸、脯氨酸。
(2) 混合氨基酸溶液：将1%的甘氨酸、脯氨酸也按1%浓度制成混合溶液。
(3) 展层剂：将20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层后备用。
(4) 显色剂：0.1%茚三酮－正丁醇溶液。
2、仪器
层析缸（12*12CM规格，垂直型）、层析滤纸（新华一号滤纸，事先裁成11*11CM规格）、电吹风（学生自带，每组一个）、三角板、铅笔和干纸巾（学生自带，每组一套）、毛细管。
四、操作方法
1、准备滤纸：三个点，每隔2CM画一个“+”，用铅笔连起描成一条直线。每个“+”点距离滤纸底端2CM。
2、点样：每个样品用毛细管点3次，每次点完后用电吹风吹干。一个样品用一支毛细管。
3、饱和平衡：在缸底部玻璃突起的一侧加入10-15ml展层剂，另一侧先不加；让滤纸都放先放到未加展层剂的干燥一侧，然后盖上盖子平衡饱和20分钟。（可写试验报告，简单讲课）
4、开始层析：稍微拿出滤纸，再在干燥的一侧也加入10-15ml展层剂，然后让滤纸分别在该侧开始层析。
5、结束层析：等到展层剂上升到距离滤纸上端3cm左右，就拿出滤纸，用铅笔划线描出液体的上边界，然后用电吹风吹干。
6、茚三酮显色：把滤纸放在桌面上，整张纸用滴管滴加满茚三酮溶液，再用热风吹干，直到有结果出现。
7、计算RF值：用铅笔描出每个氨基酸的区域，测量距离计算甘氨酸和脯氨酸的Rf值。（每个组需将该滤纸夹在组长的实验报告中，并注明是第几组）
五、结果计算
1、用铅笔将层析结果轮廓和中心点描出来，计算各种氨基酸的Rf值。
2、分析混合样品中未知氨基酸的组分。
六、作业题
1、若展开剂高于点样线，对最终的层析结果有何影响？
2、点样时，样品浓度太高或斑点之间间距过小，对最终的层析结果有何影响？
实验四牛奶中酪蛋白的制备
一、目的意义
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100mL。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 95%乙醇；
(2) 无水乙醚；
(3) 0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液：先配A液与B液，
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL；
B液：0.2mol/L醋酸溶液，称纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL；
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。
(4) 乙醇—乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）。
(5) 10%醋酸溶液
2、仪器：新鲜牛奶；台式离心机、抽滤装置、精密pH试纸、恒温水浴锅、烧杯、温度计、50ml大离心管。
四、操作方法
1、酪蛋白的粗提
20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃（实验前水浴锅提前预热到43℃）、pH4.7的醋酸缓冲液20mL，对照精密pH试纸用10%醋酸溶液调pH至4.7（肉眼可见絮状物质如果牛奶与缓冲液混合后，絮状沉淀出现不充分，需要加入较多的醋酸溶液，否则离心后没有分层）。
将上述悬浮液冷却至室温。离心10分钟（3000r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、酪蛋白的纯化
(1) 加入40ml蒸馏水搅拌洗涤沉淀，直接抽滤（事先检查真空泵是否已加满水）。
(2) 在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤（注意不要沾
壁）。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀1次（不要更换滤纸），最后用乙醚洗沉淀1次，抽干。
(3) 将沉淀摊开在干燥滤纸上，电炉上烘干，得酪蛋白纯品。
(4) 准确称重，计算含量和得率。 五、结果计算
X ＝
100m
V
式中：X ──酪蛋白含量，g/100 mL 牛乳；
V ──量取牛奶的体积，mL ； m ──收获酪蛋白的质量，g 。
六、注意事项
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用
酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指
标计算。
七、作业题
1、试验中，分别加入乙醇、乙醚洗涤沉淀的作用是什么？
2、试验中，你觉得影响最终酪蛋白纯度和得率的因素可能会有哪些？请简单分析
实验五 酵母RNA 的提取
一、目的意义
掌握稀碱法提取RNA 的原理和方法，学会抽滤操作。 二、实验原理
酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA ，含量为干菌体的2.67%~10.0%，而DNA 含量较少，仅为0.03%~0.516%。为此提取RNA 多以酵母为原料。工业上制备RNA 多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA ，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。
稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA 或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA 有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。 三、仪器与试剂 1、试剂
⑴ 0.2%氢氧化钠溶液；⑵ 酸性乙醇溶液：30mL 乙醇加0.3mL HCl ；⑶ 95%乙醇；⑷ 乙醚； 2、仪器：酵母粉、量筒、抽滤瓶、布氏漏斗、台式离心机、天平等。 四、操作方法
1、研磨：称取3g 干酵母粉于研钵中（如果是10个组，称取30克，大研钵中磨，再分装给各个组），加入30mL （10个组，是300 mL ）0.2%NaOH 溶液中，加入少量石英砂，研磨均匀10min 。
2、沸水提取：将酵母匀浆转入100mL 小烧杯中沸水浴（提前打开水浴锅，加热到95度）加热20分钟，不断搅拌。冷却后移到离心管，4000r/min 离心10分钟后，沉淀弃去，将上清液移到小烧杯中，慢慢倾入20mL 酸性乙醇，边加边搅。静置10min 。
3、离心：待RNA 完全沉淀，移到离心管，4000r/min 离心5分钟。
4、洗涤、抽滤：弃去上清液，加入30ml 95%乙醇洗涤沉淀并搅拌后，转移至布氏漏斗抽滤，继而再用20ml 无水乙醚洗涤，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。沉淀在空气中干燥。
5、称重计算：称量所得RNA 粗品的重量。 五、结果计算
X ＝
100m
V
式中：X ──RNA 粗品含量，g/100g 酵母；V ──酵母的质量，g ；m ──收获RNA
粗品的质量，g 。 六、作业题
1、RNA 的含量测定还有其它方法吗？试举例简单说明
2、沸水浴的作用是什么？
实验六糖的呈色反应和定性鉴定
（一）Fehling试验
一、目的意义
了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二、实验原理
费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。
三、仪器与试剂
1、试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。
2、试剂乙：称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶
中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合成Fehling试剂。
3、1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液（先配好）。
四、操作方法
取试管，编号，各加入Fehling试剂1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2~3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。
（二）Benedict试验（班氏试验）
一、目的意义
了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二、实验原理
Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。
三、仪器与试剂
1、Benedict试剂（班氏试剂）：将170g 柠檬酸钠和100g 无水碳酸钠溶于800mL水中；另将
17g硫酸铜溶于100mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠－碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。该试剂可长期使用。
2、1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。
四、操作方法
取试管，编号，分别加入2mL Benedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。
五、作业题：1、除这两个试验方法外，还有其它何种办法鉴别还原糖和非还原糖？请简述
实验七淀粉的提取和性质实验
一、目的意义
1、熟悉淀粉与碘的呈色反应。
2、了解淀粉的提取方法和水解条件及产物。
二、实验原理
1、淀粉的提取
淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物，广泛分布于植物界，谷类、果实、种子、块茎中含量丰富。工业用的淀粉主要从玉米、甘薯、马铃薯中制取。淀粉是一种白色粉末，不溶于冷水，在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。
2、淀粉与碘的显色反应
直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可用它来分析碘的含量。
淀粉和碘的显色反应除了吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。
淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200－980或相对分子质量范围是32 000－160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20－28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。
表2－1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色
淀粉跟碘生成的包合物不稳定，易被乙醇、氢氧化钠和热等作用，使颜色褪去，而只在pH = 4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。
3、淀粉的水解
淀粉进入人体后，一部分淀粉受唾液中淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在
肠液中麦芽糖酶催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。
反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6
淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 乙醇、0.1％淀粉液（1mL1%淀粉溶液加5 mL蒸馏水）、10％NaOH溶液、20％H2SO4溶
液、10％Na2CO3溶液。
(2) 2%碘液：将碘化钾20g及碘10g溶于100mL水中。使用前稀释10倍。
(3) 班氏（Benedict）试剂：见糖的呈色反应实验。
2、仪器：生马铃薯、组织捣碎机、纱布、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、试管夹、量筒、烧杯、
白瓷板、试管。
四、操作方法
1、淀粉的提取（演示，实验不再做）
生马铃薯去皮，切碎，称取50g，加少量水，捣碎匀浆，用四层纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中淀粉很快沉淀，然后用水多次洗涤淀粉，再抽滤后滤饼放在表面上风干即可。
2、淀粉与碘的反应
(1) 取少量自制淀粉于白瓷板孔内，加碘液两滴，观察颜色。
(2) 取试管一支，加入0.1％的淀粉液6mL，碘液两滴，摇匀，观察颜色变化。另取试管两支，将前述淀粉液均分为三等份并编号做如下实验：
1号管在酒精灯上加热，观察颜色变化。然后冷却，又观察颜色变化。
2号管加入10％NaOH溶液几滴，观察颜色变化
3号管加入乙醇4mL，观察颜色变化。
记载上述实验过程和结果，并解释现象。
3、淀粉的水解
(1) 在试管1中加入少量淀粉和4mL水，在试管2中加入0.5g淀粉和4mL 20%的硫酸溶液。分别加热试管煮沸3~4min。
(2) 把试管2中的一部分溶液倒入试管3中，留作下一步实验用。
(3) 向试管1和试管2中加入几滴碘溶液，观察现象。
(4) 向试管3中滴入20% Na2CO3溶液，中和溶液中的硫酸，把溶液调呈弱碱性，使溶液的pH值约为9~10（直到CO2气泡冒完为止）。再加入2mL班氏试剂，加热煮沸后观察现象。
记载上述实验过程和结果，并解释现象。
六、作业题：1、在加热的过程中，为什么碘与淀粉会呈现不同的颜色反应？
实验八油脂氧化酸败的定性检验及定量测定
一、目的意义
1、进一步掌握油脂氧化酸败的机理。
2、学会油脂氧化酸败的定性检验及酸值测定的操作技术。
二、实验原理
油脂氧化酸败的过程是极复杂的化学变化过程，对食品质量影响很大。酸败的油脂中某些分解产物对人体有害，例如环氧丙醛。过氧化物是油脂自动氧化的主要初级产物，过氧化物可进一步分解，生成低级的醛、酮和羧酸，通过油脂中过氧化物、醛类的检出，可定性判断油脂是否已发生酸败。
环氧丙醛在酸败的油脂中不呈游离状态，而是成为缩醛。在盐酸作用下，环氧丙醛逐渐释出，释出的游离环氧丙醛与间苯三酚发生缩合反应，生成红色的凝聚物（环氧丙醛-间苯三酚凝聚物），由红色凝聚物的生成可判断油脂已发生酸败。
酸值是评定油品酸败程度的指标之一，它是指中和1g油脂中游离脂肪酸所消耗的氢氧化钾的质量(mg)。油脂中游离的脂肪酸与氢氧化钾发生中和反应，从氢氧化钾标准溶液消耗量计算出油脂的酸值。反应如下：RCOOH＋KOH → RCOOK＋H2O
三、仪器与试剂
1、试剂
⑴ 0.1％间苯三酚乙醚溶液；
⑵浓盐酸；
⑶中性乙醚－乙醇混合液(体积比为2∶1)，临用前用0.1 mol/L氢氧化钾溶液中和至酚酞指
示剂呈中性；
⑷酚酞指示剂：1％乙醇溶液；
⑸ 0.1000mol/L氢氧化钾标准溶液；
⑹花生油(新鲜与不新鲜样品各1种)。
2、仪器：恒温水浴、锥形瓶、试管及试管架、量筒、25mL比色管、滴定管、容量瓶。
四、操作方法
㈠油脂氧化酸败的定性检验
1、间苯三酚乙醚溶液法（克莱斯氏环氧丙醛反应）
取试样2mL 于试管中，加入浓盐酸2mL ，用橡皮塞塞好管口，剧烈振荡10s 左右，再加0.1％间苯三酚乙醚溶液2mL,加塞剧烈振荡10s 左右，使酸层分离。观察下层溶液颜色。
结果表示：下层呈桃红色或红色表示油脂已酸败，下层呈浅粉红色或黄色表示未酸败。 ㈡ 油脂酸值的测定
精密称取3g 试样置于锥形瓶中，加入30mL 中性乙醚－乙醇混合液，摇匀使油脂溶解（必要时可置热水中，温热使其溶解，冷至室温）。加入酚酞指示剂2－3滴，用0.1mol/L 氢氧化钾标准溶液滴定至初现微红色，且30秒内不褪色为终点。记下消耗0.1mol/L 氢氧化钾溶液的用量。 五、结果计算
X =
m
C V 11
.56??
式中：X ──试样的酸值（以氢氧化钾计），mg/g ；
V ──试样消耗氢氧化钾标准溶液体积，mL ； C ──氢氧化钾标准溶液实际浓度，mol/L ； m ──试样质量，g ；
56.11──与1.0mL 氢氧化钾标准溶液相当的氢氧化钾毫克数。
六、注意事项
1、间苯三酚乙醚法试验、酸值测定，切忌明火。
2、酸值测定中，如油样色泽深，可减少试样用量或适当增加混合溶剂的用量；如因色深判断终点困难，可改换指示剂，用碱性蓝6B 、百里酚酞做指示剂或用酚酞试纸作外指示。
3、测定蓖蔴油酸度时，只用中性乙醇而不用混合溶剂。
4、光线会促进空气对试剂的氧化，应注意避光存放试剂；
实验九维生素C的定量测定
一、目的意义
掌握2，6－二氯靛酚法测定维生素C的原理和方法。
二、实验原理
维生素C又称抗坏血酸，还原型抗坏血酸能还原染料2，6－二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6－二氯靛酚钠离子呈红色，被还原后变为无色。
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 2%草酸溶液；
(2) 0.001N 2，6－二氯靛酚钠溶液：称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中，然后称取
2，6－二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却定容至250mL，过滤至棕色瓶内，保存在冰箱中。每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度。
2、仪器：匀浆机、小锥形瓶、酸式滴定管、研钵、容量瓶、移液管、小离心管等。
四、操作方法
1、样液的制备及滴定
称取100g青椒匀浆，取（x/8，x代表匀浆体积数，约为50；8代表组数）mL青椒匀浆液移入50mL容量瓶中，用2%草酸溶液定容摇匀。每次量取20mL提取液放入锥形瓶内，用2，6－二氯酚靛酚钠溶液进行滴定呈现淡粉红色，并在15－30秒内不褪色，滴定过程必须迅速，不要超过2分钟。平行试验进行2次，记录消耗2，6－二氯酚靛酚钠溶液的用量。
2、滴定
滴定管装入，滴定至提取液，
另取10mL 2%草酸按上法作空白对照试验，记录消耗2，6－二氯酚靛酚钠溶液的用量。
五、结果计算
M=[(V A-V B) ×C×0.088×100]/（D×W）
式中：M——100g样品中含抗坏血酸的质量，mg；
V A——滴定样品管时所用去染料体积数，mL；
V B——滴定时空白管时所用去染料体积数，mL；
C——提取液总毫升数，mL；
D——滴定时所取的样品的提取液毫升数，mL；
W——被检样品的重量，g；
0.088——0.001N 2，6－二氯酚靛酚钠溶液1mL相当于0.088mgV C。
实验十酶的特性实验
一、目的意义
1、加深对酶所具有特性的认识。
2、了解淀粉酶、过氧化物酶的作用
二、实验原理
淀粉和蔗糖缺乏自由醛基，故无还原性。在淀粉酶的作用下，淀粉很容易水解生成麦芽糖。麦芽糖是还原性糖，可使班氏试剂中二价铜离子还原成一价亚铜，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。但淀粉酶不能催化蔗糖水解生成具有还原性的葡萄糖或果糖，而蔗糖本身不具有还原性，故不能与班氏试剂产生砖红色沉淀。
过氧化物酶能催化过氧化物释放出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质，例如可氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙（橙红色）。
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 1%蔗糖溶液；
(2) 1%淀粉溶液（需新鲜配制）：称取可溶性淀粉1g，加5mL蒸馏水，调成糊状，再加入80℃
以上蒸馏水使其溶解，最后定容至100mL。
(3) 唾液淀粉酶溶液：用水漱口两次（可安排一个学生用矿泉水请洗涤口腔，取得），口腔含
水做咀嚼运动，促进唾液分泌，收集后用两层纱布过滤，取滤液5mL用蒸馏水稀释10倍，混匀备用；
(4) 煮沸淀粉酶溶液：取10mL淀粉酶溶液，在沸水中煮沸20分钟使淀粉酶变性失活。
(5) 班氏（Benedict）试剂；
(6) 缓冲液A 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取35.62g磷酸氢二钠溶于1000mL蒸馏水中；
缓冲液B 0.1mol/L柠檬酸溶液：称取19.21g无水柠檬酸溶于1000mL蒸馏水中；
(7) 1%焦性没食子酸水溶液：称取1g焦性没食子酸，用少量蒸馏水溶解，然后定容至100mL。
(8) 2%过氧化氢溶液。
(9) 白菜梗提取液：称取白菜梗约5g，切成细块，置于研钵中加蒸馏水约15mL，研磨成浆，经纱布过滤后滤液备用。
2、仪器
试管及试管架、滴管、水浴锅、天平、试管、漏斗、滴管、剪刀等。
四、操作方法
1、淀粉酶的专一性
取3支试管编号，按下表操作。
混匀后置于37℃水浴保温10分钟，然后向各管中加入班氏试剂20滴，放入沸水中煮沸，观察并分析结果。
2、过氧化物酶作用试验
取4支试管编号，按下表操作。
摇匀后观察并记录各管颜色变化。
五、注意事项
1、操作过程中严格防止试剂污染。
2、严格按照顺序加试剂。
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH
三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2 滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴 一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月
实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品：果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆 2．移液管的使用： 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3．离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 4．分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 5．水浴锅的使用 三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写） 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论
实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾－碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 （一）淀粉酶的观察 1、取3支大试管，编号后按表操作 2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应
生物化学实验报告 姓名： 专业： 院系： 学号：
实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体
积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可改写成： Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积；Vi内体积；Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况： 1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题： （1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？ 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需采用间歇式方式进行操作？ 为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？ 防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！ 动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败） 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。 单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。 检测器：将单色器分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。 测量装置：通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光：200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定：其应用波长范围为200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定：用波长为400～850nm的可见光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
生物化学实验方法手册 Markus R Wenk National University of Singapore, Singapore Aaron Zefrin Fernandis National University of Singapore, Singapore A Manual For Biochemistry Protocols 2007,127pp. Paperback ISBN 978-981-270-066-7 Markus R Wenk等编 该书是生物医学研究手册丛书的第三卷，其前两卷分别是《初级哺乳动物细胞培养手册》和《生物医学研究中的显微镜技术》，后续还将推出《生物材料及骨架编织技术手册》和《知识产权管理手册》，这五卷均由世界科学出版社出版。 本手册共分为6章，各章内容分别是：1.蛋白纯化；2.蛋白分析；3.脂肪分析；4.哺乳动物细胞培养；5.显微镜学； 6.分析与鉴定。作者希望这本手册不仅仅是将各种生物化学实验方法的简单罗列，更希望读者能够通过这本手册掌握生
物化学实验技巧进而理解这些方法背后的原理。这本手册将给广大读者带来一个全景式的生物化学，尤其对于那些初次踏入生物化学领域的读者，选择这本手册会是一个不错的开始。 这本手册的编者都是科研一线人员，所编著的方法实用且前沿，并且详尽地介绍了生物化学中可能会使用的实验方法。 本手册适合从事生物化学、分子生物学的相关人员，在实验中它是一本不错的参考工具。 程恩隽，博士生 (国家纳米科学中心） Chengenjun, DoctoralCandidate (National Center for Nanoscience and Nanotechnology ,China)
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应 一、目的要求 (1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 (2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 二、原理 ㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法 蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。 1．双缩眠反应 当脲(即尿素)加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。 然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。
2．Salkowski(1888)蛋白黄色反应 它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯 反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。 硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是： 3．茚三酮反应 蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色 外．其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。
三、器材与试剂 ㈠器材 ⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管 ㈡试剂和材料 ⒈10％NaOH溶液⒉1％CuSO4溶液⒊0.5％苯酚溶液⒋浓HNO3 ⒌卵清蛋白溶液（蛋清：水＝1︰20）⒍尿素⒎0.1％茚三酮乙醇溶液 四、操作步骤 1.双缩脲反应 （1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。试管冷却后，加入约1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。