p53蛋白在细胞凋亡中的作用机制研究
下载全文加入收藏夹点击:101 下载:1
Bad(Bcl-2 antagonist of cell death)是Bcl-2蛋白家族的成员之一，是细胞凋亡的正调控因子，正常情况下定位于细胞质中。像其它的BH3-only蛋白一样，使结合在Bcl-2或者Bcl-xl上的Bax游离下来从而促进凋亡。Bad的凋亡活性通过它的Ser112，Ser136和Ser155三点的磷酸化来调控。在没有外界压力的细胞中，Bad被几个蛋白激酶如蛋白激酶A(PKA)或者蛋白激酶B(AKT)磷酸化，从而与14-3-3结合。但是，当细胞受到凋亡刺激时，Bad被迅速地去磷酸化并且迁移到线粒体上，从而诱导细胞凋亡。肿瘤抑制因子p53在不同的刺激下分别调节细胞周期或者细胞凋亡。它可以转录活化许多靶基因，如p21，Bax，p53DINP1，Bid，Puma等等。但是，还有研究证明p53也通过转录非依赖的形式来调节细胞凋亡，尽管这个作用的机制还没有被详细的阐明，但是最近的研究报道说明了，p53可以直接转移定位到线粒体上，与Bcl-2或者Bcl-xl结合后，从而使Bax游离下来并活化。同样，p53还可以通过打断Bak/Mcl-1或者Bak/Bcl-2之间的结合来诱导细胞凋亡。尽管Bcl-2家族中的许多分子，例如Puma，Noxa，Bax和Bid，都可以被p53转录调控，这些已经被报道并且研究的很透彻，但是Bad与p53之间的关系至今仍没有被报道和研究。这里，我们报道了p53可以结合在Bad基因起始密码子上游的大约6.6kb的区域，转录活化Bad的表达。我们还阐明了Bad可以和细胞质中的p53结合，从而阻止了p53的进核，导致了p53对于Bad转录活性的降低。另外，Bad可以介导p53定位于线粒体上，并且在线粒体上形成Bad/p53的复合物。两个系列的证据说明了此结论：其一，当我们利用从H1299细胞中纯化的线粒体和纯化的p53蛋白，野生型的Bad或者突变体的Bad(这个突变体仍然可以结合p53，但是不能定位于线粒体上)蛋白质共同孵育时，p53只可以被野生型的Bad蛋白介导定位于线粒体上，而不能被突变体的Bad介导并定位到线粒体上；其二，利用小RNA干扰的实验，降低细胞内Bad的蛋白水平时，同时也减少了
p53在线粒体上的定位。在线粒体上形成的Bad/p53复合物通过诱导Bak的活化和寡聚化从而诱导了细胞凋亡。通过小RNA干扰试验减少Bad的表达水平明显的降低了etoposide(鬼臼毒素)诱导的细胞凋亡。从而，我们的实验数据首次证明了Bad在p53转
录依赖的和非依赖的通路中扮演了双重的角色。总之，我们发现了Bad基因上游6.6kb处的p53的结合作用区域，并且可以被p53转录活化；Bad通过与p53结合，一方面抑制了p53的进核，控制了细胞核内p53的量，从而使细胞内Bad的蛋白水平处于平衡，另一方面，Bad通过介导p53定位于线粒体上从而促进了p53诱导的细胞凋亡。蛋白之间相互作用Siva1是CD27结合的蛋白，在细胞凋亡的内在途径和外在途径中均起着重要的作用。过量表达Siva1可以结合BCl-xl，并抑制Bcl-xl介导的对于uv诱导细胞凋亡的防护。Siva1和它的剪切突变体Siva2在T淋巴细胞中都可以介导caspase依赖的线粒体途经的细胞凋亡。据报道，Siva1包含在TCR介导的细胞凋亡过程中。Jacobs SBR等人报道，Siva1对于神经元细胞中p53依赖的凋亡是重要的。总之，这些报道都是关于Siva1在凋亡刺激的情况下，它的促凋亡能力，但是，在没有外加压力的情况下，Siva1和Siva2在细胞中起着怎样的功能一直没有报道。肿瘤抑制因子p53,在细胞周期，细胞凋亡和基因组的稳定性等的多个方面中起着关键的调节作用。它可以转录活化很多的靶基因，如
p21waf1，Bax，Bad，Hmd2和Siva等等。其中一些靶蛋白如Hdm2和Bad等可以结合p53,从而形成了负反馈来调节p53。在正常情况下，p53的蛋白水平被严格地控制着，通过许多的调控因子进行严格的调节，其中最关键的是Hdm2。Hdm2所介导的p53的泛素化降解又可以被细胞内的很多分子进一步更加精确的调节，如PCAT和Daxx等。PACT 可以直接与Hdm2结合，增加了Hdm2与p53之间结合的能力，从而增加了p53的泛素化降解。与此相近的是，Daxx通过结合Hausp来稳定了Hdm2，从而增加了Hdm2对于p53的降解活性，进一步增加了p53的泛素化降解。此外，p53还可以影响细胞的迁移和肿瘤的发生。据文章报道，在没有外界压力的情况下，p53可以促进细胞迁移，而缺乏p53的细胞其迁移能力减弱。然而，也有文章报道，Gadea G等报道p53的缺失可以促进RhoA-ROCK依赖的细胞迁移。当细胞受到外界压力时，肿瘤抑制因子p53诱导很强的抗存活能力，p53的这种能力在正常的细胞中被限制，主要是由于被Hdm2所介导的迅速泛素化和降解。p53诱导Hdm2蛋白的表达，从而两者之间建立了负反馈调控机制。
p53-Hdm2二者之间相互作用的调控机制以及其他的哪些蛋白也存在于p53的这种负反馈抑制中还没有被完全地研究。在本章中，我们主要展示了在没有外界压力的细胞中，
p53-Hdm2的相互作用被Siva1蛋白所加强。Siva1蛋白，与Hdm2相类似的是，它也是p53靶基因的产物。Siva1既可以与p53结合，也可以与Hdm2结合，与二者结合的
区域是不同的，从而加强了Hdm2介导的p53的泛素化和降解。此外，Siva1抑制了p53所介导的基因表达，细胞凋亡和细胞的迁移。Siva1的功能可能与它自身可以形成同源二聚体有关，因为Siva1的一个剪切突变体Siva2，它不能形成二聚体而且丧失了降解p53的功能。在小鼠成瘤试验中，过量表达的Siva1可以抑制p53介导的肿瘤抑制功能，而下调Siva1的表达则增加了p53的这种功能。当DNA受到损伤时，Siva1与p53之间和Siva1与Hdm2之间的结合被减弱。这些结果证明了Siva1作为一个重要的接头分子促进了Hdm2介导的p53降解。综上所述，当细胞受到外界压力时，Siva1将作为抑制p53活性的负反馈的一部分。
细胞凋亡主要发生机制及相关作用研究 摘要 细胞凋亡是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是细胞接受某些特定信号刺激后在基因调控下所发生的一系列细胞主动死亡过程，通常来说是一种正常生理应答反应。目前认为细胞凋亡信号传导通路主要包括三种：内源性途径、外源性途径以及内质网途径。细胞凋亡的研究已成为当前生命科学研究热点之一。研究细胞凋亡的信号传导通路及其调控对进一步认识和治疗凋亡相关疾病有重要意义。 关键词：细胞凋亡信号传导通路疾病治疗
ABSTRACT Apoptosis is an orderly or programmed cell death way, is a series of cells active death process under gene regulation that after cell accepted certain specific signal stimulation, it is a normal physiological response. At presently, the cell apoptosis signaling pathways mainly includes three types: intrinsic pathway, extrinsic pathway, and the way of endoplasmic reticulum. The research of apoptosis has become the life science research hotspot. Researching cell apoptosis signaling pathways and regulation can get further understanding and also have the important meaning to treatment of apoptosis related diseases. Key words: A poptosis Signal conduct pathway Treatment of diseases
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。
细胞凋亡机制的研究及其意义 摘要: 细胞凋亡是维持神经系统正常发育, 维持其免疫系统正常功能所必需过程。目前, 对细胞凋亡的研究已经成为生命科学领域研究的热点。本文就细胞凋亡的发生机制、基因调节机制等方面作一综述。 关键词: 细胞凋亡; 机制；意义 引言：细胞凋亡对机体的健康发育甚为重要，在生理条件下，它作为机体正常细胞群生长与死亡相协调的重要方式，有利于清除多余的细胞、无用细胞、发育不正常细胞、有害细胞、完成正常使命的衰老细胞；有利于维持机体细胞群的自身稳定，从而维持器官组织的正常发育。细胞凋亡过少时，机体易患肿瘤性疾病、自身免疫性疾病；细胞凋亡过多时，机体易患神经系统方面的疾病。人的艾滋病等疾病之所以发生，主要是由于机体细胞凋亡发生异常的结果。 正文： 1、细胞凋亡机制 1.1 信号传递机制 凋亡一般由细胞外的调节因素与其在细胞表面的受体结合而启动。经活化的受体又启动胞内第二信号系统，激活核酸内切酶，引起DNA裂解，进而引发细胞凋亡。细胞外的调节因素包括生理活性因子：如肿瘤坏死因子、转化生长因子及表皮生长因子等；非生理因素：如X射线、紫外线、一氧化氮、毒素及化疗药物等；感染因素：如EB病毒、腺病毒及HIV病毒等。有学者认为，细胞凋亡的信号传导能使用或部分利用细胞增殖和分化过程中的传统信号途径。传统信号途径包括G 结合蛋白信号途径和酶蛋白信号途径，前者可以调节第二信使cAMP和钙离子的生成，细胞内cAMP和钙离子浓度的变化可以对细胞凋亡产生影响；后者可通过酪氨酸蛋白激酶（PTK）、Ras-MAPK或JaK-STAT等途径参与凋亡信号的传导。但众多研究表明可直接启动细胞凋亡的信号途径或死亡信号途径是两种死亡因子，即肿瘤坏死因子和Fas配体与细胞膜表面的相应受体TNF受体和37? 结合以后所发生的凋亡反应。目前对TNF和FasL与相应受体结合所介导的细胞凋亡信号途径及其机制已取得了突破性进展 1.2 酶学机制 1.2.1 caspases蛋白酶 胱冬蛋白酶（caspases）是近几年研究的热点之一，属于ICE/CED3蛋白酶家族成员，目前发现至少有14种之多,分别命名为caspases1-caspases14。与细胞凋亡密切相关，它是通过级联反应，最终激活核酸内切酶来实现的。也有人认为凋亡并不总是引起caspases的释放，而caspases的释放也并不总是引起凋亡，很可能还与细胞的迁移和分化有关.。蛋白酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部分，H2N端是抑制区域被移去，另一端COOH端断裂成一大一小亚单位
细胞凋亡在医学上的应用 （专业：动物遗传育种与繁殖） 摘要：细胞凋亡是细胞的自杀过程，通过自杀方式去除体内非必需细胞或即将发生变异的细胞，细胞凋亡不同于创伤性死亡，它可以帮助人类预防诸如癌症和自身免疫性疾病。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如早老性痴呆症、帕金森症、舞蹈症肿瘤，自身免疫性疾病等。研究表明，多种人类恶性肿瘤细胞具有较低响应生理刺激而经历凋亡的能力[1]。因此，诱导癌变细胞凋亡被看作是一种新的癌症治疗方法[2]。开发各种有效提高细胞凋亡能力的试剂——细胞凋亡诱导剂，可能是最有前途的治疗癌症的策略。许多抗癌药，如adrlamycin，vinblastin和紫杉醇等，都可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗癌症。细胞凋亡异常在肿瘤特别是肝癌发生中具有重要作用。 正文：细胞凋亡在免疫学和临床医学中的应用中受到广泛应用，在免疫学中研究胸腺细胞成熟过程中的凋亡及活化诱导的细胞死亡较为突出，细胞凋亡在临床医学中，发现HIV病毒感染造成CD4+细胞减少是通过细胞凋亡机制，同时，从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致，更为重要的细胞凋亡的研究将给自身免疫病带来真正的突破。 最新研究进展 蛋白尿促肾小管细胞凋亡机理：武汉大学中南医院肾病内科李晓宁博士经多年研究发现，蛋白激酶C－delta在蛋白尿中表达升高，会成为尿蛋白诱导肾小管细胞死亡的“元凶”，如成功抑制，有望避免致肾小管细胞死亡的现象。研究人员发现，肾病水平的蛋白尿可以在体内和体外诱导肾小管细胞凋亡，他们同时发现细胞凋亡的早期特征性事件以及晚期特征性事件等，从而分别从细胞水平，亚细胞水平、DNA水平和蛋白质水平证实了白蛋白对肾小管细胞的直接毒性作用。为找到治疗手段，研究人员分别用化学药物和基因转染的方法，成功抑制了蛋白尿诱导的肾小管损伤。李晓宁认为，这一结果在蛋白激酶C－delta基因敲除的蛋白尿小鼠模型中得到证实，这表明医学界有望在进一步研究中通过药物控制蛋白激酶C－delta水平，以彻底消灭蛋白尿引起的肾小管损伤[3]。 ( 发现细胞凋亡开关有助癌症治疗：美国科罗拉多大学博尔德分校的研究小组通过研究线虫，首次发现引起细胞凋亡的“开关”，此项研究结果可用于治疗人类由于“非正常细胞凋亡”引起的癌症等疾病。研究小组利用线虫的半胱天冬酶（ caspase ）进行试验。半胱天冬酶是细胞凋亡的“酶刽子手”，因为它的主要作用就是切断和破坏细胞的蛋白质。但是，研究小组在试验中发现半胱天冬酶对Dicer酶具有不同的作用，当半胱天冬酶分裂 Dicer酶后，它并没有杀死Dicer 酶，而只是改变了 Dicer酶的功能（ Dicer酶是一种RNA切割酶），Dicer酶开始分裂染色体，并杀死细胞。这个实验首次表明，利用半胱天冬酶分裂Dicer 酶（这是一种RNA切割酶），可以改变Dicer酶的功能，使其转变为DNA切割酶."
第十三章细胞衰老、死亡与癌变 第三节细胞凋亡的分子机理 细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 一、凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 1．Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶；③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE 亚族和CED-3家族（图13-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。 细胞中还具有caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）[3]与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA 的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 一、过氧化物酶标记测定法 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。 毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。 本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。 检测晚期凋亡。 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。 罗氏试剂盒 一、试剂1、酶浓缩溶液5×50μl——末端脱氧核糖核酸转移酶（10×）试剂 2、标记溶液5×550μl——含有核苷酸混合液的反应液（1×）试剂 3、转化剂-POD 3.5ml——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后4℃保存） 二、所需的溶液和仪器 10mM Tris/HCl（pH7.4~7.8）、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精） 1,充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min×5； ②3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min，抑制内源性过氧化氢酶。 ③用蛋白酶K（20μg/ml溶于Tris/HCl中，pH7.4~8.0）室温孵育15~30分钟。 ④PBS洗约5min*2次，擦干样品周围的水。此阶段配制TUNEL反应混合物——从试剂2中取出100μl标记溶液作为两个阴性对照；将试剂1中取5μl+试剂2中45μl标记液中，配成50μl TUNEL反应混合物混匀（即配即用，4℃避光！） ⑤标记反应：滴加50μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60分钟（为防蒸发和保证TUNEL反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*3次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。
细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。为此，在形态学上把细胞凋亡分为3个阶段[3]：第一个阶段是凋亡的开始。此阶段只是进行数分钟，细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等。第二阶段是形成凋亡小体。核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体。第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。其次此过程中质膜保持完整，内含物也不发生外泄。 2 细胞凋亡的基本机制 细胞凋亡的途径复杂，在不同环境、不同细胞或不同刺激的情况下，细胞凋亡的途径是不同的，而且细胞凋亡的信号途径具有多样性，这使得凋亡的发生及调控机制非常复杂。本章将从以下几个方面来说明细胞凋亡途径。 2.1线粒体途径及调控 线粒体为一双层膜围成的囊状结构，外膜与内膜间的空腔称为外室，由内膜包围的腔称
综述：细胞凋亡 人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式， 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。 凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。 细胞凋亡的研究历史 1．凋亡概念的形成 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞这些的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。 2．细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段：（1972-1987） 1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。 2）染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。 3）RNA/蛋白质大分子的合成。 4）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。 5）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。 3．细胞凋亡的分子生物学研究阶段，最近几年 1）与细胞凋亡的相关基因及调控 2）细胞凋亡的信号转导 3）与细胞凋亡的各种分子及其相互作用及相互关系 4．细胞凋亡的临床应用基础研究阶段 细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。细胞凋亡的一般概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就象树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊?quot;Apoptosis"来表示，意思是象饕痘蚧ǖ淖匀坏蚵洌 梢胛 赴 蛲觥?BR>1．胞凋亡与细胞程序性死亡（PCD） 其实从严格的词学意义上来说，细胞程序性死亡与细胞凋亡是有很大区别的。细胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一
细胞凋亡相关分子机制的研究进展
细胞凋亡相关分子机制的研究进展 【摘要】凋亡发生是一个主动过程，该过程的启动和进行受到基因的精确调控，目前发现细胞凋亡存在三条通路：死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路，各条通路间又有相互联系，共同控制细胞凋亡。 【关键词】细胞凋亡；死亡受体；线粒体；内质网；信号传导通路 细胞凋亡是生物体细胞的主动消亡过程，是多细胞有机体调控机体发育、控制细胞衰老、维持内环境稳定的重要机制。细胞凋亡发生过程的启动和进行受到精确调控，具有独特而复杂的信号系统。各种凋亡信号通过信号传导通路传至细胞内，激活靶分子而产生细胞效应，引发细胞凋亡[1]。细胞凋亡的最终途径是DNA的降解，迄今为止，细胞的凋亡过程确切机制尚不完全清楚，根据起始激活的Caspase不同，凋亡激活的途径分为3种：死亡受体活化途径、线粒体损伤途径、内质网应激启动的凋亡途径[2]。 1 死亡受体活化途径。 死亡受体活化途径又称外源性途径，是经典的凋亡途径。死亡受体介导细胞凋亡的途径主要是通过Fas/FasL、TNFR、TRAIL诱导的，各途径主要是通过跨膜受体将信号
由胞外传递到胞内，衔接蛋白与受体结合后，再由执行蛋白与衔接蛋白结合，进而诱导细胞凋亡[3]。Fas/FasL：Fas（又名Apo1或CD95），是细胞表面分子量为48 kD的Ⅰ型转膜蛋白，含有319个氨基酸残基。Fas由胞浆的C末端区、跨膜区、胞膜外的N末端区三部分组成。胞内区含有死亡结构域DD，在传递凋亡信号中发挥关键性作用，但其C末端15个氨基酸若被除去，则细胞对凋亡的敏感性增强，因此也被认为是死亡抑制域；疏水性的跨膜区由19个aa组成；胞外的N末端区含有3个CRD、长度约40个aa的结构域，是配体结合区域。Fas可在许多组织细胞中表达，其中以免疫系统的表达最丰富，如活化的T和B淋巴细胞、NK细胞等，在肝、肾、心、肺、等组织中也有较高水平表达，特别是成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞FasL是Fas的配体，是由281个aa组成的分子量为40kD的Ⅱ型转膜蛋白，也分为胞内区、跨膜区和胞外区三部分。FasL的分布较为局限，主要分布在活化的T淋巴细胞表面。膜结合型的FasL（mFasL）可被金属蛋白酶介导的蛋白水解作用产生可溶性的FasL （sFasL），而三聚化的sFasL才具有功能。Fas的天然配体为FasL（Fas ligand），属肿瘤坏死因子配体超家族（tumor necrosis factor ligand superfamily member）成员。FasL与其受体Fas结合，诱导Fas分子聚集形成三聚体，通过胞浆内死亡结构域与适配蛋白FADD结合，FADD效应结构域与