tRNA，即转运RNA（Transfer RNA），是用来运送氨基酸到对应的mRNA密码子上的小RNA。
tRNA有74-95个氨基酸组成，形成带有4个恒定臂的三叶草二级结构（在更长的tRNA中另有一个侧臂）。其中包括：
接受臂：由碱基配对的干组成，其端部有不配对的序列，其2'或3’羟基能与氨基酸相连；TΨC臂：因其含有TΨC三联体而得名（Ψ代表假尿嘧啶，一种修饰碱基）
D臂：因其含有二轻尿嘧啶而得名
额外臂：位于TΨC臂与反密码子臂之间，由3-21个碱基组成
反密码子臂：在其环中央含有反密码子三联体
每个tRNA的二级结构进一步折叠成紧凑的L形三级结构，其中与氨基酸结合的3'端远离与密码子结合的反密码子。
tRNA的结构为其功能提供了一个普遍结论：其执行特定功能的位点最大限度的分开。
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中 数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子 遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。 随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。 全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。 人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、 血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分 裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇 论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1
如何查找基因序列？（转载） (2010-08-01 11:47:41) 如何查找基因序列？ ——在Genbank中寻找目的基因的实例 ——献给受类似问题困扰的广大酷友，以及给我动力和信心发表原创帖的基因酷的朋友们。 酷友感言：网络的世界很精彩，网络的查询很无奈。为了我们的科学研究事业，为了我们能够顺利毕业，我们的广大酷友们在网络的海洋里遨游…遨游…咋就找不到彼岸呢？今天要设计这个基因的PCR引物，明天又要查那个基因的信息，那么大一张网，唉想起来就郁闷……鉴此，我们推出了利用Genbank查找基因序列的帖子，希望对大家有所帮助，并请大家多多指教！当然，如果您已经是此中高手，那就权当我是班门弄斧了，呵呵。 1. 根据文献 搞reasearch肯定要读文献的，如果你曾经在文献中看到过你感兴趣的基因，而且文中还提到了该基因在Genbank中的ID号，那就好办了，直接打开https://www.doczj.com/doc/0615345112.html,，在Search后的下拉框中选择Nucleotide，把Genbank ID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他了。 举例说明，例如：在2003年JBC的文章（Conditional Knock-out of
Integrin-linked Kinase Demonstrates an Essential Role in Protein Kinase B/Akt Activation）中出现了“calreticulin (GenBank accession number gi 16151096)”，那么把“16151096”输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到该基因了（当然包括基因序列等相关信息）。 在出现了检索结果界面（下图）后，直接点击红箭头所指的 AY047586就可以看到基因的相关信息了...（呵呵，是不是有点太......easy 了） 这里需要指出一下，在显示基因的页面右侧有一个Link，点击后出现一个小菜单，里面是与该基因相关的链接，很有用的，值得一个一个地去看看，这里我就不多说了。点击 AY047586后出现的界面如下：如果你只想获得序列（例如去设计PCR引物的时候），那就可以选择FASTA，这样就得到了FASTA格式的序列文件，没有其他数字和格式的干扰。 （缩略图，点击图片链接看原图）这就是FASTA格式的序列： （缩略图，点击图片链接看原图）2. 根据已经获得的基因的相关信息进行查找（待续......） 鼓励一下吧，累坏了正如路漫漫所说，如果只是知道基因的名字，怎么查序列呢？还是举例说明，比如我想做的基因名称是人的VEGF基因，那么怎么在Genbank中找到它呢？还是一步一步来...打开https://www.doczj.com/doc/0615345112.html,/ 在search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基
1 技术优势 全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是利用高通量测序平台对人类不同个体或群体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行生物信息分析。可全面挖掘DNA 水平的遗传变异，为筛选疾病的致病及易感基因，研究发病及遗传机制提供重要信息。 全基因组测序 平台优势 HiSeq X 测序平台 读长：PE150 通量：1.8T/run 测序周期：3 天 专为人全基因组测序准备、测序周期短、通量高
生物信息分析 技术路线 技术参数 样品要求 样本类型：DNA 样品 样本总量：≥1.0 μg DNA (提取自新鲜及冻存样本) ≥1.5 μg DNA (提取自FFPE 样本)样品浓度：≥ 20 ng/μl 测序平台及策略HiSeq X PE150 测序深度 肿瘤：癌组织(50X),癌旁组织/血液样本(30X)遗传病：30~50 X 项目周期37天
3 案例解析 该研究选取3个家系中6个患者和1个正常个体，首先使用基因芯片寻找纯合突变位点，然后对其中无亲缘关系的2例患者采用全基因组测序研究，在2例患者非编码区域均发现相同的变异，10号染色体PTF1A 末端发生一个点突变（chr10：23508437 A>G），且变异在患病人群和细胞试验中均得到了验证。研究解释了生长发育启动子隐性变异是罕见孟德尔遗传病的常见致病原因，同时说明许多疾病的致病突变也可能位于非编码区。 图1 检出的变异信息 智力障碍是影响新生儿心智发育的一类疾病。这项研究选取50个经过基因芯片和全外显子测序未确诊致病因子的trio 家系，全基因组测序检出84个de novo SNVs 和8个de novo CNVs，及一些结构变异（如VPS13B、STAG1、IQSEC2-TENM3），检出率为42%。揭示编码区的de novo SNVs 和de novo CNVs 是导致智力障碍的主要因素，全基因组测序可以作为可靠的遗传性检测应用工具。 案例一 单基因病研究——全基因组测序鉴定PTF1A末端增强子常染色体隐性突变导致胰腺 发育不全[1] 案例二 复杂疾病研究——全基因组测序解析智力障碍的主要致病因素[2] 图2 PTF1A 的家系图谱
人全外显子组序列捕获及第二代测序 概述 外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含合成蛋白质所需要的重要信息，涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。外显子组序列捕获及第二代测序是一种新型的基因组分析技术：外显子序列捕获芯片（或溶液）可在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域，后续利用Solexa/SOLiD/Roche 454测序直接解析数据。 与全基因组重测序相比，外显子组测序只需针对外显子区域的DNA 即可，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。可用于寻找复杂疾病（如：癌症、糖尿病、肥胖症等）的致病基因和易感基因等的研究。同时，基于大量的公共数据库提供的外显子数据，我们能够结合现有资源更好地解释我们的研究结果。 目前，SBC提供的外显子组序列捕获芯片是NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array及Agilent SureSelect Target Enrichment System（Human Exome）。 技术路线 以Nimblegen外显子捕获结合Solexa测序为例加以说明：基因组DNA首先被随机打断成500bp左右的片段，随后在DNA片段两端分别连接上接头。经过PCR库检合格后的DNA 片段与NimbleGen 2.1M Human Exome Array芯片进行杂交。去除未与芯片结合的背景DNA 后，将经过富集的外显子区域的DNA片段洗脱下来。这些DNA片段又随机连接成长DNA片段
后，再次被随机打断并在其两端加上测序接头，经过LM-PCR的线性扩增，在经qPCR质量检测合格后即可上机测序。 外显子组测序的实验流程示意图（https://www.doczj.com/doc/0615345112.html,） 生物信息学分析流程图 研究内容 1．外显子组捕获与测序 将基因组DNA随机打断成片段，通过与人全外显子捕获芯片杂交富集外显子区域，通过第二代测序技术对捕获的序列进行测序。 2．基本数据分析 数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。 3. 高级数据分析 高级数据分析内容包括： （1）Clean reads序列与参考基因组序列比对； （2）目标外显子区域测序深度分析； （3）目标外显子区域一致序列组装；
全球首次完成杨树全基因组测序 由美国能源部启动并实施的杨树全基因组测序计划已圆满完成，并于2004年9月21日对公众开放了全序列数据库。南京林业大学科研人员尹佟明副教授参与了此项研究。杨树基因组的新闻发布及庆祝会定于12月6日在美国加州举行。该项研究可望使杨树这一重要树种的品种改良时间大大缩短，用区区几十年跨越千年关。 研究的完成，使杨树成为继拟南芥和水稻之后，第三个测定全序列的植物，并且是第一个测定全基因组序列的多年生木本植物。杨树因此被广泛接受为研究多年生植物基因组的模式物种，这使该项工作具有重大的科学意义。杨树同时又是一种重要的工业用材树种，杨树全基因组计划实施，将为生物能源的开发提供知识贮备，具有重要的实际应用价值。目前，杨树的改良还处在一种半野生的初级改良阶段，在基因组研究的基础上，通过群体和数量遗传学的手段在杨树属不同树种间开发有用等位基因，并通过遗传工程的手段进行基因重组，可望在几十年的时间里完成一般作物几千年的改良历程。 杨树全基因组全序列用“鸟枪法测定”，序列库中共含有7，649，993个序列片段，去除叶绿体基因组的污染，测得的序列大约为8×基因组长度。目前对序列拼接的组装已完成了483Mb，占杨树基因组物理全长的90%以上，基本上覆盖了杨树基因组常染色体的大部分。基于基因芯片和单核苷酸多态性检测技术，对小的序列拼接及序列间隙的填充工作正在进行中，预期这部分工作将于明年完成。南京林业大学尹佟明副教授自2001年以来一直参与此项研究，对杨树基因组的注释工作将于今年12月初完成。 国际杨树基因组计划协作组的总负责人杰瑞先生认为，从世界范围来看，杨树在中国的林业生产中占有的比重是最大的，因此在杨树基因组信息的应用方面，中国在未来的研究中可能会居于世界前列。杨树全基因组计划的完成对我国从事林业及生物技术的科学家而言，提供了前所未有的机遇和挑战。 Science 15 September 2006: Vol. 313. no. 5793, pp. 1596 - 1604 DOI: 10.1126/science.1128691 RESEARCH ARTICLES The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray) G. A. Tuskan,1,3* S. DiFazio,1,4S. Jansson,5J. Bohlmann,6I. Grigoriev,9U. Hellsten,9N. Putnam,9S. Ralph,6S. Rombauts,10 A. Salamov,9J. Schein,11L. Sterck,10 A. Aerts,9 R. R. Bhalerao,5 R. P. Bhalerao,12 D. Blaudez,13 W. Boerjan,10 A. Brun,13 A. Brunner,14 V. Busov,15 M. Campbell,16 J. Carlson,17 M. Chalot,13 J. Chapman,9 G.-L. Chen,2 D. Cooper,6 P. M. Coutinho,19 J. Couturier,13 S. Covert,20 Q. Cronk,7 R. Cunningham,1 J. Davis,22 S. Degroeve,10 A. Déjardin,23 C. dePamphilis,18 J. Detter,9 B. Dirks,24 I. Dubchak,9,25 S. Duplessis,13 J. Ehlting,7 B. Ellis,6 K. Gendler,26 D. Goodstein,9 M. Gribskov,27 J. Grimwood,28 A. Groover,29 L. Gunter,1 B. Hamberger,7 B. Heinze,30 Y. Helariutta,12,31,33 B. Henrissat,19 D. Holligan,21 R. Holt,11 W. Huang,9 N. Islam-Faridi,34 S. Jones,11 M. Jones-Rhoades,35 R. Jorgensen,26 C. Joshi,15 J. Kangasj?rvi,32 J. Karlsson,5 C. Kelleher,6 R. Kirkpatrick,11 M. Kirst,22 A.
已完成植物基因组测序情况（更新至2014年11月） 中文名拉丁名发表时间刊物科、属基因组大小拟南芥Arabidopsis thaliana 2000.12 Nature 十字花科、鼠耳芥属125M 水稻Oryza sativa. ssp. indica 2002.04 Science 禾本科、稻属466M 水稻Oryza sativa. ssp. japonica 2002.04 Science 禾本科、稻属466M 杨树Populus trichocarpa 2006.09 Science 杨柳科、杨属480M 葡萄Vitis vinifera 2007.09 Nature 葡萄科、葡萄属490M 衣藻Chlamydomonas reinhardtii 2007.01 Science 衣藻科、衣藻属130 M 小立碗藓Physcomitrella pattens 2008.01 Science 葫芦藓科、小立碗藓属480M 番木瓜Carica papaya 2008.04 Nature 番木瓜科、番木瓜属370M 百脉根Lotus japonicus 2008.05 DNA Res. 豆科472 Mb 三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum 2008.11 Nature 褐指藻属27.4M 高粱Sorghum bicolor 2009.01 Nature 禾本科、高粱属730M 玉米Zea mays ssp. mays 2009.11 Science 禾本科、玉米属2300M 黄瓜Cucumis sativus 2009.11 Nature Genetics 葫芦科、黄瓜属350M 大豆Glycine max 2010.01 Nature 豆科、大豆属1100M 二穗短柄草Brachypodium distachyon 2010.02 Nature 禾本科、短柄草属260M 褐藻Ectocarpus 2010.06 Nature 水云属196M 团藻Volvox carteri 2010.07 Science 团藻属138M 蓖麻Ricinus communis 2010.08 Nature Biotechnology 大戟科、蓖麻属350M 小球藻Chlorella variabilis 2010.09 Plant Cell 小球藻科46M 苹果Malus × domestica 2010.09 Nature Genetics 蔷薇科、苹果属742M 森林草莓Fragaria vesca 2010.12 Nature Genetics 蔷薇科、草莓属240M 可可树Theobroma cacao 2010.12 Nature Genetics 梧桐科、可可属430-Mb 野生大豆Glycine soja 2010.12 PNAS 豆科、大豆属915.4 Mb 褐潮藻类Aureococcus anophagefferens 2011.02 PNAS 57M 麻风树Jatropha curcas 2010.12 DNA Res. 大戟科、麻风树属410M 卷柏Selaginella moellendorffii 2011.05 Science 卷柏属212M 枣椰树Phoenix dactylifera 2011.05 Nature biotechnology 棕榈科685M 琴叶拟南 芥 Arabidopsis lyrata 2011.05 Nature Genetics 十字花科、鼠耳芥属206.7 Mb 马铃薯Solanum tuberosum 2011.07 Nature 茄目、茄科、茄属844M 条叶蓝芥Thellugiella parvula 2011.08 Nature Genetics 盐芥属140M
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.doczj.com/doc/0615345112.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.doczj.com/doc/0615345112.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
世界第一个黄种人全基因组序列图即将完 成 世界上第一个黄种人全基因组序列图即将由我国科学家绘制完成，这项工作正在位于深圳市盐田区的深圳华大基因研究院内紧锣密鼓地进行着。 该研究计划被命名为“炎黄一号”。计划发言人叶佳说，以黄种人的基因组图谱为研究目标，将为黄种人的基因研究和疾病治疗提供更准确和更有针对性的“基因标准图库”，“好比为你的基因做了一张参考CT”。 据悉，该研究由深圳华大基因研究院、生物信息系统国家工程中心及中国科学院北京基因组研究所的科学家共同承担，这一合作团队是曾经参与了“人类基因组计划”1%任务的主要成员。计划一旦成功，意味着中国将实现人类基因组序列图绘制工作从1%到100%的成功跨越。 目前全世界共发现2000个与疾病有关的人类基因，其中有1500个已在美国用于临床诊断。叶佳说，我国经政府批准用于临床诊断的基因种类仅几十个，不到美国的3%.由于黄种人突变位点与白种人不尽相同，不能完全照搬国外的诊断标准。因此，“开展黄种人基因与疾病关系的基础和应用研究显得意义非凡，但前提是，黄种人的基因组要有一个标准序列图，深圳开展的工作不一定就能定为标准图，但一定
是黄种人的第一个”。 相关技术的进步，尤其是新测序仪器的问世，大大加快了这一计划的速度。由六国合作的“国际人类基因组计划”，耗资数亿美元，花了几年时间才完成了任务；而如今利用新技术可在几个月时间内，花几千万人民币就能完成。“随着技术上的不断突破，有望在年内降至万元水平。”叶佳说。 “将来每个人都可能拥有自己的基因组图谱，就像拥有自己的CT图一样，”叶佳说，“这意味着实现个体化诊断、个体化治疗的梦想越来越近。” “炎黄一号”计划同时也是我国科学家与英国桑格基因组研究院合作进行的千人个体基因组多态性研究的一部分。这一计划的主要内容是，以新一代测序和高性能计算机技术为支撑，通过对白、黑、黄三人种进行大样本的全基因组测序和序列比较，探索人类基因组在不同人群中的多态性分布和变化规律。 科学家认为，个人测序与之前的人类基因组计划有所不同。之前的测序没有在每个染色体的两个副本之间、甚至是不同捐赠者的DNA之间作出区分，从而混淆了等位基因。 今年以来已经宣布完成个人基因组图谱的有两人。一是今年六月美国贝勒医学院的基因组中心，宣布完成了诺贝尔奖获得者、“DNA之父”詹姆斯·沃森的个人基因组序列图；另一个是今年9月刚刚在美国学术杂志上发表的，以传统测
外显子捕获结题报告2010-11-22
内容 1 项目信息 (1) 2 工作流程介绍 (2) 2.1 Agilent液相捕获平台 (2) 2.2 NimbleGen 液相捕获平台 (3) 2.3 生物信息分析流程 (4) 3 分析报告 (5) 结果 (5) 3.1 标准生物信息分析 (5) 3.1.1 数据产出统计 (5) 3.1.2 目标区域单碱基深度分布图 (6) 3.1.3外显子捕获测序的均一性 (7) 3.1.4一致序列组装和SNP检测 (7) 3.1.5 SNP注释 (8) 3.1.6插入/缺失(indels)检测 (9) 3.1.7插入/缺失(indels)注释 (9) 3.2个性化分析 (9) 3.2.1氨基酸替换预测 (9) 3.2.2群体SNP检测和等位基因频率估计 (12) 3.2.3孟德尔遗传病分析 (13) 3.2.4 NGS-GW AS 分析 (14) 3.2.5正向选择信号的检测 (14) 4 数据分析方法说明 (15) 4.1信息分析软件及常用参数介绍 (15) 4.2参考数据库 (16) 4.3数据文件格式 (17)
1 项目信息 PROJECT NAME CONTRACT NUMBER SAMPLE INFORMATION Species Information Genome Information Additional Information CUSTOMER INFORMATION PI Contact Person Company Name Contact Methods Name Tel E-mail Name Tel E-mail CONTACT INFORMATION (BGI) Sales Information Name Tel E-mail Name Tel E-mail Customer Service Name Tel E-mail Name Tel E-mail PROJECT DIRECTOR APPROVAL THE RESULTS HAVE BEEN APPROVED AND CAN BE SUBMITTED Signature: Date:
一、名词解释 1.比对将测序序列比对到参考基因组序列 2.单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多 态性 3.三体家系样本，父亲，母亲，和孩子家系外显子组中的一组家系样本 4.小的核苷酸的插入缺失 5.拷贝数变异是由基因组发生重排而导致的,一般指长度为1 kb以上的基因组大片段 的拷贝数增加或者减少,主要表现为亚显微水平的缺失和重复 二、填空题 1.bwa GATK 2.1% 3. 全基因组重测序全外显子组区域捕获测序 4. snp indel CNV SV 5. 5 50X 6. 1.5 3.5 7.0.1% 1% 8.液氮冻存-80冰箱冻存 9.血液 10.Agilent SureSelect All Exon V4 (+ UTR), NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0, Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit 51M(71M), 64M, 62M 三、问答题 1. 建库：将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180-280bp的片段，末端修复和加A 尾后在片段两端分别连接上接头制备 DNA 文库。 捕获：带有特异index的文库pooling后与多达543,872个生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将20,965个基因的334,378个外显子捕获下来。 扩增及测序：经PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。 2. 人类85%的疾病位点位于编码区 域外显子组可以提供更深的测序 深度外显子组花费更低 3. 数据质控，比对到参考基因组，去重复重校正，预测个体snp和indel，预测体细胞突变，预测CNV和SV，候选位点注释 4. 常染色体显性遗传 常染色体隐形遗传 伴X 染色体显性遗传 伴X 染色体隐性遗传 伴Y 染色体遗传 找Denovo mutation，只在患病孩子有，不在健康父母里存在的位点 5．
基因组序列的差异分析 ----mVISTA的在线使用说明 当然，除了在线版的，我们还可以在网站上填写信息申请离线的软件。但我试用了一下，需要先自己比对，然后要按照一定的格式来制作文件，当然你还必须得安装java才能运行软件；总之，我感觉没有在线版的方便。 1 将数据放入服务器中 在首页，你将被要求确定你想要分析的基因组序列的数量。输入这个数字之后，点击“提交”，将带你到主提交页面。 mVISTA服务器最多可以同时处理100条序列。 1.1主提交页面必填的内容 E-mail 地址 通过E-mail，我们可以提示你的在线处理已经得到结果。
序列 你可以用2种方式来上传你的序列： 1.使用“Browse”按钮从你的电脑上，上传纯文本的Fasta格式文件。如果是一个作为参 考的生物体的DNA序列必须作为一个contig提交(可以进行一定的定向排列将多个片段合并为一个contig)，而其他非参考序列可以在一个或多个contig中提交(draft)。 Fasta格式的示例序列(您可以在NCBI站点上找到关于该格式的更多细节)： >mouse ATCACGCTCTTTGTACACTCCGCCATCTCTCTCT … ！！！注意:序列里面我们只接受字母CAGTN和X。请确保提交序列是作为一种纯文本格式，而不是Word或HTML文件格式。 如果您以FASTA格式提交序列，我们建议您为它取一个有意义的名称（比如直接是你的物种名之类的），因为这些名称将出现在我们生成的图形中。如果您使用的是一个draft草图序列，那么结果中每个contigs的命名都将按照您在“>”符号后指示的命名进行。 2.您可以给出它的GenBank登录号，系统将自动从GenBank数据库里进行检索序列。 在这两种情况下，序列的总大小都不应超过10M，而且任何一条序列都不应超过2M。 1.2主提交页面选填的内容 这些选项允许您自定义您的VISTA分析。您可以使用独立获得的基因注释，选择合适的Repeat Masker选项，给分析的序列指定名称，并改变序列保存分析的参数。如果您没有填写这些选填选项，我们将使用它们的默认值。 比对程序 根据您分析的具体内容(参见“about”-链接中的详细信息)，您可以选择以下比对程序之一：1、AVID----全局两两比对。如果您选择使用这个程序，其中一个序列应该被完成比对，其他 所有序列可以完成或以草图draft格式完成。对于集合中所有已完成的序列，AVID生成所有相对所有成对的比对结果，可以使用任何序列作为基础(参考)来显示。如果某些序列是草图格式，AVID将生成它们与最终序列的比对，这将被用作基础(参考)。这是该服务器上唯一可以处理草图序列的比对程序。 （小知识：草图序列与完整序列DNA sequence, draft: Sequence of a DNA with less accuracy than a finished sequence. In a draft sequence, some segments are missing or are in the wrong order or are oriented incorrectly. A draft sequence is as opposed to a finished DNA sequence.）2、LAGAN----完成完整序列的全局两两比对和多重比对。如果某些序列是草图格式，您的查 询将被重定向到AVID以获得两两比对。多重比对将由VISTA可视化，它将计算并显示序列的保守区，以您指示的任何序列作为参考。这是该服务器上唯一能够产生真正的多重
人外显子测序 药明康德基因中心，陆桂1. 什么是外显子测序（whole exon sequencing）？ 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究基因的SNP、Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 2. 外显子捕获试剂盒有哪些？ 目前主要有Roche、Illumina和Agilent三家的外显子捕获试剂。Nimblegen和Illumina的捕获试剂盒中的探针是DNA探针，化学性质稳；Agilent的捕获试剂盒是RNA探针，有可能RNA 不是很稳定。 3. 外显子捕获效率是什么？ 外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分，这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以，测到的序列中，有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。 Nimblegen大约是70% Agilent大约是60% Illumina大约是50% 4. 外显子测序一般建议做多少倍的覆盖？ 一般做100X或者150X。较高的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现小比例的突变。另外，外显子测序的覆盖不是很均匀，这样较高的平均覆盖率有利于保证大部分的区域有足够的覆盖倍数。 5. 外显子测序能够测出多大的片段缺失？ 大致能测出50bp的片段缺失。目前的测序主要还是用Hiseq 2000,单侧的测长就是100bp。由于外显子测序的覆盖很不平均，所以如果有大段的缺失，无法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。目前能够测到的，就是在一个read中发现的缺失。一个read的长度也就是100bp，所以大到50bp以下的片段缺失可以从外显子测序中测出来。 6. 外显子捕获可以做CNV吗？ 外显子测序因为有一个杂交捕获的过程，这样就会有一个杂交捕获效率的问题。各个外显子的杂交效率是不同的，其同源竞争的情况也不同，所以不同的外显子的覆盖率的差异就很大。所以一般情况下，外显子测序不能用于CNV的检测。但在癌症研究中，利用癌组织和癌旁组织对照，可以检测CNV。 现在我们有另外两种常规方法来检测CNV，一种是全基因组重测序，另外一种是用Affymetrix SNP6.0的芯片来测。其中Affymetrix SNP6.0的检测费用大约只有全基因测序费用的1/10，是一个相对经济的手段。 7. 外显子测序的优点是什么？
华大智造外显子捕获测序解决方案 概述 随着测序技术发展和成本降低，临床外显子组测序(cWES)和全外显子测序(WES)在遗传病检测领域崭露头角。外显子测序借助捕获探针(DNA或RNA)对人基因组约1-2%的区域测序，可覆盖绝大多数基因的编码序列和>99%（临床基因组资源库，ClinGen）疾病相关区域。华大智造基于自有的探针合成平台和高通量测序仪（MGISEQ/BGISEQ 系列），能为客户提供外显子测序一站式解决方案。 图1 外显子测序示意图（以MGI测序平台为例）
MGIEasy 外显子组捕获V5探针试剂套装 MGIEasy 外显子组捕获V5探针试剂套装除了涵盖传统外显子探针覆盖的区域，还有针对性的做了探针优化，保证了生育健康、新生儿、心脑血管、遗传性肿瘤、单基因病、安全用药、个人基因组、遗传性耳聋、免疫缺陷、线粒体缺陷等致病基因的全覆盖。 产品亮点 ●探针区域69Mb ●更多的疾病致病位点 ●更优的数据利用率 ●稳定而高效的捕获效率 技术优势 数据库覆盖情况 MGI V5与竞品（Vendor A6/N3/I）比，有更多的独有区域，涵盖了华大自主研发的 图2 CCDS、GENCODE、UCSC、miRBase和RefSeq数据库基因数量覆盖情况 基因覆盖更全面
MGI V5能100%覆盖的基因数达到455个，远高于A5 (125个)、N3 (33个)和I (357个)，其独有100%覆盖基因数达到160个，是A5和N3之和。 BBS10基因是巴比二氏综合征的致病基因，MGI V5完整涵盖了基因区和内含子区，其中包括ClinVar数据库中报道的已知临床突变位点。 基因覆盖均一性更优 MGI V5在测序深度达到100x时，96%的区域覆盖度均能达到20X以上。与竞品N3和I共有的区域，MGI V5显示了更优秀的覆盖均一性。 性能比较 图3 100%覆盖的基因数和BBS10基因覆盖情况 图4 >96%区域达到20X覆盖图5 共有区域的覆盖更均一
技术参数 样品要求捕获平台测序策略 测序深度 项目周期 外显子组测序 37天 1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序 HiSeq PE150 Agilent SureselectXT Custom Kit 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本） ≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本）样品浓度：≥20 ng/μl 参考文献 外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突 变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。 1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量 技术优势 生物信息分析 基本信息分析 1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度 3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本） 高级信息分析（单基因病） 高级信息分析（复杂疾病） 高级信息分析（癌症） 1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息） 2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本） 1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息） 2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析 1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测11. NovoDR耐药突变筛选12. 基因组变异Circos图展示 案例解析 ［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。 ［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13] 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找De novo mutatio n 。发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实CREST突变与ALS相关。 ［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。 [1] Krawitz PM, Schweiger MR, R?delsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572. [3] Wei A H, Zang D J, Zhang Z, et al. Exome sequencing identifies SLC24A5 as a candidate gene for nonsyndromic oculocutaneous albinism[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2013, 133(7): 1834-1840. [4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.[5] Musunuru K, Pirruccello J P , Do R, et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2220-2227. [6] O'Roak B J, Deriziotis P , Lee C, et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations[J]. Nature genetics, 2011, 43(6): 585-589. [7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-231. [8] Yan X J, Xu J, Gu Z H, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia[J]. Nature Genetics, 2011, 43(4): 309-315. [9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116. [10] Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J]. Science, 2010, 329(5987): 75-78. [11] Tennessen J A, Bigham A W, O’Connor T D, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes[J]. Science, 2012, 337(6090): 64-69. [12] Caburet S, Arboleda V A, Llano E, et al. Mutant cohesin in premature ovarian failure[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(10): 943-949.[13] Chesi A, Staahl B T, Jovicic A, et al. Exome sequencing to identify de novo mutations in sporadic ALS trios[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(7): 851-855.[14] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multi region sequencing[J]. Science, 2014, 346: 256-259. 群体研究 藏族人高原适应性研究[10]；深度解析人类罕见遗传变异[11]；…… 图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置） 图2 ALS家系图及CREST突变功能验证 图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率