实验四厌氧菌
一、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌
（一）目的要求
1. 掌握破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的形态特点、培养特性和鉴别要点。
2. 熟悉破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的分离培养过程、鉴别的一般原则和常用方法。
3. 解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的外毒素毒性动物实验。
（二）器材和试剂
1．菌种破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌菌种及其形态示教片。
2．培养基疱肉培养基、血琼脂培养基、牛乳培养基、五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵管、牛心脑浸液肉汤与琼脂、脂酶培养基。卵黄琼脂、溴甲酚紫牛乳培养基。
3. 试剂革兰染色液（一套）、芽胞染色液（石炭酸复红、95％酒精、碱性美蓝）、焦性没食子酸、100g/L氢氧化钾、溴甲酚紫；产气荚膜梭菌抗血清、肉毒梭菌多价抗血清、索氏梭菌抗血清；2０g／L尿素L-色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。
4. 其他小白鼠、家兔、无菌注射器、无菌吸管、滴管、中、小试管、消毒纱布块；固体石蜡或凡士林、酒精灯、三角架、碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；剪刀、镊子、玻片、药勺、钯粒；厌氧袋、厌氧罐、离心机、水浴锅等。
（三）步骤和方法
1．破伤风棱菌
（1）形态观察观察破伤风梭菌示教片，其繁殖体型为革兰阳性细长杆菌，散在排列，芽胞型的芽胞呈正圆形，位于菌体顶端，直径大于菌体，使芽胞和菌体呈鼓槌状；该菌鞭毛为周身鞭毛。
（2）培养物观察破伤风梭菌在疱肉培养基中生长缓慢，厌氧培养2～7天后其生长现象为培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑，有少量气体。生成的甲基硫醇、H２S等使培养物变臭。
破伤风梭菌在血琼脂平板上形成圆形、扁平的菌落。菌落中心结实，周边疏松似―羽毛状‖。菌落周围有α溶血环，培养时间延长可变为β溶血环。
（3）生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴锅中加热。热煮沸10min，迅速冷却。以无菌吸管吸取破伤风梭菌纯培养物，分别滴加。于牛乳培养基与五糖发酵管中，接种毕，在液面上加一薄层熔化的石蜡。经37℃孵育24～48h，观察结果。结果破伤风梭菌五糖（葡乳麦甘蔗）均不分解，牛乳培养基无变化。‖
（4）破伤风梭菌芽胞染色法
①原理芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上后又难以脱色的特点设计的。所以芽胞染色法都基于同一个原则，采用
着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。
②方法：a.用破伤风梭菌培养物涂片，干燥，火焰固定；b.滴加石炭酸复红液于涂片上，用微火加热至染料冒蒸汽（切勿煮沸）维持3～5min，加热过程要随时添加染液，勿让标本干涸，待玻片冷却后，水洗；c.用95％酒精脱色30s～1min，水洗：④滴加碱性美蓝液复染30s～lmin，水洗。⑤干燥后，镜检。
③结果：芽胞染呈红色，菌体染呈蓝色。
2. 产气荚膜梭菌
(1)形态观察产气荚膜梭菌镜下检查为革兰染色阳性粗大杆菌，两端钝圆，散在或短链状排列；荚膜染色法可见肥厚荚膜；芽胞卵圆形，与菌体等宽，位于菌体中央或次未端。(2)培养物观察产气荚膜梭菌在疱肉培养基中呈现混浊生长，肉渣呈粉红色，不被消化，产气甚多；在血琼脂平板上多数株有双层溶血环；高层葡萄糖琼脂培养管中，可见气体产生，使琼脂有断裂分层现象。
(3)生化反应
①五糖发酵试验：将五糖发酵管置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。以无菌吸管吸取产气荚膜梭菌纯培养物，分别滴加于五糖发酵管中，接种后，在液面上加一薄层熔化的石蜡。经35℃孵育24～48h，观察结果。结果葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖均分解，产酸产气。
1汹涌发酵现象
a.原理：产气荚膜梭菌能迅速分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，并产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲散形成分散的海绵状碎块，并将培养基表面的石蜡冲至试管塞处。此为汹涌发酵现象。
b.方法：甩无菌吸管（或接种环）取产气荚膜梭菌疱肉培养物接种于溴甲酚紫牛乳培养基，置35℃孵育18～24h，观察结果。
c.结果和意义：一般于孵育6h后即可发生，产气荚膜梭菌迅速分解乳糖，产酸产气，酪蛋白被酸凝固，形成凝块与乳清，凝块被产生的大量气体冲击，形成分散的海绵状碎块，将部分培养基冲至试管口塞处。这种气势凶猛现象，为本菌的重要特征之一。
③卵磷脂酶试验和奈格尔试验
a.原理：产气荚膜梭菌能产生卵磷脂酶，在卵黄琼脂平板上，能将培养基中可溶性的磷脂酞胆碱分解生成磷酸胆碱和不溶性的二脂酞甘油酯，后者在菌落周围形成不透明区（有乳白色环），此为卵磷脂酶试验阳性。奈格尔（Naglar）试验是抗原抗体中和试验用产气荚膜梭菌抗血清，实际是卵磷脂酶抗血清（抗体）涂在琼脂上，由于抗原（卵磷脂酶）抗体中和反应，使菌落周围不形成不透明区，即无乳白色环，则为奈格尔（Nag1ar）试验阳性。这样可确证该菌能产生卵磷脂酶。
b.方法：将卵黄琼脂平板底部划分两个区，琼脂的一半均匀涂上产气荚膜梭菌抗血清，置37℃待干后，将待检细菌先在未涂抗血清区划线接种，然后在有血清区划线接种，置37℃厌氧孵育24～48h、观察结果。
c.结果：未涂抗血清的一半平板，菌落周围形成较大的混浊不透明区，表示卵磷脂酶试验阳性；涂抗血清的一侧，菌落周围无不透明区（无乳白色环），表示卵磷脂酶活性已被抗毒素所中和，为奈格尔试验阳性；如两侧菌落周围均无不透明区，表示该菌不产生卵磷
脂酶。产气荚膜梭菌卵磷脂酶试验为阳性，破伤风梭菌、肉毒梭菌为阴性。
(4)动物实验
①原理：产气荚膜梭菌接种小白鼠腹腔后，可使小白鼠各脏器肿胀、并有许多气泡，
尤以肝脏为甚，故又称为海绵肝或泡沫肝。
②方法：将产气荚膜梭菌培养液0．2～1．0ml注射小白鼠腹腔，5min后断髓处死，置37℃孵育5～8h，观察小白鼠腹腔是否膨胀有气肿现象，然后解剖小白鼠，观察各脏器，尤其是肝脏的变化。
③结果：剖检可见各脏器肿胀，并有许多气泡，尤以肝脏为甚，称海绵肝或泡沫肝。如果取内脏组织涂片，革兰染色、镜检，可见具有荚膜的革兰阳性梭菌。
3.肉毒梭菌
(1)形态观察肉毒梭菌为革兰染色阳性、两端钝圆的粗大杆菌，单独或成双排列；菌
体的芽胞为卵圆形，宽于菌体，位于菌体次未端，使细菌呈―网球拍‖状；鞭毛染色可见周鞭。
(2)培养物观察肉毒梭菌在扈肉培养基中生长旺盛，呈均匀混浊，产生少量气体，肉渣被消化变黑色，看腐败性恶臭；在血琼脂平板上呈现半透明、有光泽、边缘薄、弥散而不规则的
菌落，有β溶血环。
(3)生化反应
①五糖发酵试验：将五种糖发酵管与牛乳培养基置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。以无菌吸管吸取肉毒梭菌培养液，分别滴加于五糖发酵管与牛乳培养基中，接种后在液面上加一薄层熔化的石蜡。经35C孵育24～48h，观察结果。
结果：肉毒梭菌能分解葡萄糖，麦芽糖与蔗糖，不分解乳糖与甘露醇，牛乳培养基一般无变化。
②脂酶试验
a.原理：肉毒梭菌能产生脂酶，它作用于卵黄中游离脂肪，产生甘油和不溶性游高脂肪酸，在菌落的周围形成局限的不透明区，并于菌落表面产生一层珠光层。为一薄层脂肪酸，可与卵磷脂的分解产物（二脂酰甘油酯）区别。
b.方法：将肉毒梭菌接种于卵黄平板，置35℃厌氧孵育48～72h，观察结果。
c.结果：菌落表面有珠光层，菌落的周围有不透明区者为脂酶阳性，各型肉毒梭菌（G型除外）脂酶试验阳性，破伤风与产气荚膜梭菌该试验为阴性。
(4)动物试验
①原理：肉毒梭菌培养液注入小白鼠腹腔后其毒素作用于颅脑神经核、外周神经肌接头以及植物神经末梢，使小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难，眼睑下垂，瞳孔散大、流涎，最后因心力衰竭或呼吸困难而死亡。
②方法
a.准备滤液：取培养5天的肉毒梭菌液体培养物，离心3000r／min，30min，取上清经滤菌器除菌，取滤液作试验。
b.将动物分为三组：1组：取上述滤液0.5m1，注入小白鼠腹腔。2组：同法注入加热100℃30mm 的滤液于第二只小白鼠，3组：第三只小白鼠在注射肉毒梭菌多价抗毒素的同时再。注射不加热的滤液。
c.结果：注射后1小时（也有延至3～7天），第1组小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难、眼睑下垂、瞳孔散大、流涎等中毒症状，最后因心衰或呼吸困难而死亡。剖检，内脏可见明显充血，大量出血与血栓形成等，第2乃组动物不发病，存活。
4.临床意义：
破伤风芽胞梭菌又称破伤风杆菌，广泛存在于自然界，在土壤和人与动物的肠道中都有存在。当机体受创伤时或新生儿接生时使用不洁用具断脐带，破伤风梭菌可侵入伤口生长繁殖，分泌外毒素，引起机体痉挛性抽搐，称为破伤风，新生儿破伤风又称为脐带风。
产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。本菌可产生外毒素及多种侵袭性酶类。此菌的致病条件与破伤风梭菌相同，主要是大面积创伤、局部供血不足，组织缺氧坏死，氧化还原电势下降）菌体产生芽胞，产生毒素和侵袭性酶，引起感染致病。所致疾病主要是气性坏疽，某些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎，也常与兼性厌氧菌混合感染，引起深部脓肿，腹腔、盆腔、胸腔感染、败血症、心内膜炎以及胆道、泌尿道、女性生殖道感染等。
肉毒梭菌广泛存在于自然界，土壤中常可检出，偶尔存在于动物粪便中。在厌氧环境中，此菌分泌极强烈的肉毒毒素，引起特殊的神经中毒症状，病死率极高。本毒素尚可使婴幼儿感染与中毒。本病与典型的食人肉毒毒素引起的食物中毒不同，属于感染性中毒。
5.注意事项
(1)对预采集标本部位应首先清除污物、再用2％～2．5％碘酒75％酒精消毒，防止皮肤表面污染菌（需氧菌）混入标本而影响检测结果；所盛容器必须在用前进行灭菌。
(2)对不同部位的标本采集，应分别采取，如系瘘管应取部分坏死碎片，对闭锁性脓肿应以无菌注射器穿刺抽取脓汁和分泌物，取材后尽量排出注射器内空气，并将针头插入无
菌橡皮塞内，避免空气进入。
(3)对厌氧菌的分离培养、鉴定的全过程中均应防止氧气进入。
二、艰难梭菌
（一）目的要求
1.掌握艰难梭菌的形态特点及培养特性。
2.熟悉鉴别艰难梭菌的一般原则和常用方法。
3.了解艰难梭菌毒素对动物的毒性试验。
（二）器材和试剂
1.菌种艰雅梭菌。
2.培养基疱肉培养基、CCFA（环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、果糖、琼脂）平板培养基、卵黄琼脂培养基、五糖发酵管、七叶灵柠檬酸铁琼脂、20％胆汁心脑浸液、明胶培养基。
3.试剂芽胞染色液、焦性没食子酸、100g／L氢氧化钾、索氏梭菌抗血清、20g／L尿素、L一色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。
4.其他家兔、无菌注射器及针头、无菌吸管、滴管、中小试管、消毒纱布块；固体石蜡、酒精灯、三角架、消毒用碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水、剪刀、镊子、钯粒、产气袋、厌氧罐、水浴锅等。
（三）步骤和方法
1.形态观察艰难梭菌为革兰阳性粗长杆菌；芽胞为卵圆形或长方形，位于次极端或极端、运动性菌株为周鞭毛。
2.培养物观察在CCFA平板上，经48h厌氧培养后，产生特征性马厩（horsestable）气味，菌落直径3～5rnm，圆形、略凸起、白色或淡黄、不透明、边缘不整齐、表面粗糙或毛玻璃样菌落。在紫外线照射下，可见黄绿色荧光；在血琼脂平板上不溶血；在卵黄琼脂平板上不形成乳浊环或珠光层。
3.生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。以
无菌吸管吸取艰难梭菌培养液，分别滴加于五糖发酵管与牛乳培养基牛，接种后，在液面上加一薄层熔化的石蜡。经37℃厌氧孵育24～48h后，观察结果。结果艰难梭菌能分解葡萄糖和甘露醇产酸；不分解乳糖、麦芽糖和蔗糖；在牛乳培养基上，不凝固和不消化牛乳。
4.动物试验（家兔肠拌试验）
（1）原理：艰难梭菌的毒素注人家兔小肠后可使肠腔积有大量暗红色棍浊液甚至坏死。（2）方法：
①准备滤液：用于毒性检测的腹泻粪便标本，先经1000r／min，10min离心沉淀后，取上清液过滤除菌；疱肉培养基经37℃四天的培养液，离心沉淀，取上清液过滤除菌。
②家兔肠拌试验：取断食两天的家兔，剖腹后取出小肠扎成四段，分别注入a 待测标本滤液；
b 经56℃30min加热灭活的滤液；
c 索氏梭菌抗毒素和标本滤液；
d 生理盐水。24h后再行剖腹、观察各肠段内的液体贮积量。若只有注入未经任何处理的待测标本滤液的肠段内积有大量暗红色的混浊液；而其它肠段先变化者，判为阳性皮应.
表3-1-1 厌氧芽胞梭菌生化反应
葡萄乳麦芽甘露蔗牛吲硫化七叶明硝酸盐卵磷脂
糖糖糖醇糖乳哚氢灵胶还原脂酶酶
破伤风梭菌一一一一一 d 十一十一一十一一一产气荚膜梭菌十十十一十cd 一十 d 十＋一十一肉毒梭菌十一十一一 d 一十一十一一十艰难梭菌十一一十一一一一十十一一一注：＋：阳性；一：阴性；＋一：多数阳性；
牛乳：d消化；c：凝固；cd：既消化又凝固；一：不消化，不凝固
5.临床意义
艰难棱菌是人和动物肠道寄生菌。本菌与假膜性结肠炎有关。近年来，该菌已成为医院内感染的病原菌之一。除假膜性结肠炎外，艰难梭菌可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及肠道感染，菌血症和气性坏疽等。
6.注意事项
(1)艰难梭菌需要严格的厌氧条件，因此，从标本采集到培养鉴定全在无氧环境下进行。
(2)艰难梭菌培养需特殊培养基（CCFA），不能用一般培养条件进行培养。
(3)CCFA培养基按要求制成平板后装人塑料袋内2～8℃保存，最长不要超过8周。
三、弱类杆菌和产黑色素类杆菌
（一）目的要求
1.掌握脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌的形态特点及培养特性。
2 .熟悉鉴别脆溺类杆菌和产黑色素类杆菌的一般原则和常用方法。
（二）器材和试剂
1.菌种脆弱类杆菌、产黑色素类杆菌。
2.培养基血琼脂平板培养基、七叶灵柠檬觎琼脂、z0％LHfr心脑浸液、明胶培养
基、五糖发酵管、醋酸铅琼脂。
3.试剂革兰染色液、100g／L氢氧化钾、20g／L尿素、澳甲酚紫、L色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。、
4.其他无菌吸管、蒸馏水、剪刀、镊子、药勺、把粒、厌氧袋、厌氧袋、水浴锅、真空泵等。
（三）步骤和方法
1.形态观察脆弱类杆菌为革兰阴性短杆菌、两端圆而浓染、常并排存在或3～4个菌体排成短链。菌体有时细长，弯曲，含一个以上淡染区，易误为芽胞；多数株有荚膜。产黑色素类杆菌为革兰阴性短杆菌，呈球形，以球杆状多见，菌体笔直或略弯曲，有时呈多形性，菌体较长，两端浓染，着色不均匀，可见短丝状。
2.培养物观察脆弱类杆菌在血平板上生长良好，菌落圆形，直径1～3mm，中心略。凸起，半透明，灰白色，表面光滑，边缘整齐，多数菌株不溶血。
产黑色素类杆菌在血平板上生长良好，缓慢生长，经2～3天孵育后菌落直径0.5～3mm，圆形凸起，灰色或棕黑色，进而呈黑色，不透明）呈β溶血。
3.生化反应
(1)七叶灵水解试验：七叶灵（eseulin）的分子式为C15H16O9，化学名称为6β葡萄糖甙–7-二羟基香豆素，是一种葡萄糖甙。
①原理：细菌产生七叶灵水解酶，能水解七叶灵（苷），产生七叶亭和葡萄糖，加入5g／L 柠檬酸铁后，使铁结合在七叶亭的酚羟基上，生成棕黑色化合物。
②方法：a 斜面法：将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别接种在含七叶灵柠檬酸铁的琼脂斜面上，经24～48h厌氧培养，培养基变黑表示七叶灵已经水解，为阳性。b微量斑点法：将七叶灵0．2g／L（W／V）水溶液（淡蓝色）滴加于微孔板中（透明板）三孔，分别加脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌的菌液与蒸馏水（对照）37℃30～60min后，置360nm紫外灯下照射，进行观察。对照孔呈淡蓝色荧光。试验孔，无荧光者为阳性、说明被水解后荧光消失。与对照相同者则为阴性。
c.结果：脆弱类杆菌能水解七叶灵为阳性反应；产黑色素类杆菌一般不水解七叶灵为阴性反应。
(2)20％胆汁（2％胆盐）刺激生长试验
①原理：胆汁能抑制许多厌氧菌的生长，眉为胆盐可降低细胞膜表面张力，损伤细胞膜。但脆弱类杆菌群和少数其它厌氧菌，却能利用胆汁作为其营养物质，放生长旺盛
②方法（试管法）：将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别以相同菌量接种至胆汁的心脑浸液（BHI）培养基中和不含胆汁的BHI对照管。也可用2％胆盐BHI试验。
③结果：含胆汁的BHi管中，生长旺盛者，为阳性：抑制生长者为阴性。不含胆汁管对照，多为一般生长，为十。脆弱类杆菌胆汁试验阳性，产黑色索类杆菌胆汁试验为阴性。(4)明胶液化试验
①原理：明胶是一种动物蛋白，能在20℃凝固，高于20℃时液化；某些细菌有明胭能使明胶分解为多肽和氨基酸，即不再凝固。
②方法：将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别接种于明胶管中，另外放一未接种的明胶管对照，缉37℃2～5天孵育，取出置冰箱（4℃）中30ini山仍不凝固者为阳性，凝固者为阴性；而对照管37℃时呈液化状态，4℃冰箱中应凝固。
③结果：脆弱类杆菌明胶液化试验为阴性，产黑色素类杆菌明胶液化试验为阳性。
4.临床意义
脆弱类杆菌群存在于人及动物的大肠中，是健康人粪便中的正常菌群，每克粪便中约有1010~12个，为大肠埃希菌的100～1000倍。是厌氧菌感染中最常见的菌之一。主要为内源性感染。也可见于女性生殖系统、脓胸、颅内感染及菌血症等。
产黑色素类杆菌群可单独引起感染，但更常见与其它厌氧菌、需氧菌或兼性厌氧菌引起的混合感染。在正常情况下，本群细菌存在于人体口腔、大肠和阴道，组成这些部位的正常菌群。女性生殖道及口腔感染较为多见。是仅次干脆弱类杆菌群的常见菌。
5. 注意事项
(1)在采集标本时应注意标本的特征，如恶臭；这是厌氧菌终末代谢产物所产生的，尤其是梭杆菌和产黑色素类杆菌；砖红色荧光，这是产黑色素类杆菌产生的原叶琳所致；黑色坏死组织或黑色分泌物，一般是由产黑色素类杆菌所造成的。
(2) BBE琼脂平板有利于快速分离和初步鉴定脆弱类杆菌群，KVLB可用以选择带色素的或其他类杆菌。
(3)胞外酶快速生化试验，由于细菌不需要再繁殖，故亦不需厌氧培养，只需在有氧条件下置35℃孵育4h，即可观察结果
附录
常用培养基
1．疱肉培养基
牛肉渣0．5g 牛肉汤7m1
取制备牛肉浸液剩下的并经过处理的肉渣，装于15mm×150mm试管，每管0．5g，并加入pH7．6的肉汤培养基7m1，上盖3～4mm厚的融化凡士林，经103．43kPa高压灭菌15min 后备用。
2．卵黄琼脂
胰酪胨40g 葡萄糖2g
磷酸氢二钠59 琼脂20g
氯化钠2g 500g/L硫酸镁0．2m1
蒸馏水1000ml
将以上成分加热溶解，调pH7．3至7．4，103．43kPa高压灭菌15min，冷至60℃加入500g/L蛋黄盐水100m1，混匀倾注平板。4℃保存备用。
3．溴甲酚紫牛乳培养基
新鲜牛奶（脱脂）100m1 16g/L 溴甲酚紫溶液0．1ml
将澳甲酚紫指示剂加入牛奶中，分装试管，每管约5m1，于表面加已融化的凡士林，厚约5mm。55.16kPa高压灭菌20min后经37℃24～48h，若无细菌成长即可使用。
4．糖发酵培养基
胰蛋白胨15g 维生素C 0．1g
酵母浸出粉7g 硫乙醇酸钠0. 5g
L一半胱氨酸0．5g 溴甲酚紫0．01g
氯化钠2．5g 蒸馏水1000nll
上述基础培养液按10g／L加入所需的糖，即成各种糖发酵管。分装后，经68．95kPa高压灭菌20min后备用。
5．心脑浸液（BHI）及心脑浸液血琼脂
牛脑浸出液200ml 磷酸氢二钠2．5g
牛心浸出液250ml 半胱氨酸0．5g
琼脂10g 氯化血红素（5g／L）1ml
酵母浸出物（粉）5g 维生素K10g／L溶液0．1ml
葡萄糖2g 氯化钠5g
蒸馏水1000m1
牛心脑浸出液的制备：将去筋膜并绞碎的牛脑和牛心各500g分别置于两只2000ml的三角烧瓶中，各加1000ml蒸馏水。4℃置冰箱过夜。次日撇去浮油，分别置45℃水浴中加温1h，再煮沸30min，用纱布过滤。不易滤清时，再置冰箱待杂质沉降，吸取上清液。各补足水分至1000m1，103．43kPa高压灭菌15min，后备用。
将已制备的牛心脑浸液和上述成分加入容器内，加蒸馏水至1000ml加热溶解，冷却后调pH至7．6～7.8。分装后103．43kPa高压灭菌15min。
牛心脑浸液琼脂与血琼脂：上述牛脑浸液基础培养基加入2％琼脂，即为心脑琼脂。
在心脑琼脂中加入5％～10％脱纤维羊血，即成心脑血琼脂。
6．七叶灵琼脂培养基
糖发酵基础液（无指示剂）1000m1 柠檬酸铁0.5g
七叶灵1g 琼脂15g
7．20％胆汁培养基及其对照管
胆汁管：蛋白胨酵母葡萄糖（PYG）或硫乙醇酸盐基础液100m1
牛胆粉（或胆汁）2g
去氧胆酸钠0．1g
对照管：PYG或硫乙醇酸盐基础液100mI
胆汁管的各成分混合，加热溶解，调整pH至7．5分装小试管，每管2m1。对照管中培养基也调整pH至7．5。68．95kPa高压灭菌15min后备用。
8．硫乙醇酸盐（TH10）培养基
胰酶解酪蛋白17g 半肮氨酸0.25g
植物胨或大豆胨3g 亚硫酸钠0.1g
葡萄糖6g 0.5％氯化血红素溶液1m1
氯化钠 2.5g 10g／L维生素K1溶液0.1m1
硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.7g
蒸馏水1000ml
混合上述各成分加热至完全溶解，煮沸1～2min，冷却后调整pH至7．2～7．4。分装后置103.43kPa高压灭菌15min，4℃保存备用。
9. CDC厌氧血琼脂
胰酶解酪蛋白15 10g／L氯化血红素0．5m1
植物胨或木瓜酶消化豆粉5g 10g／L维生素K 1m1
氯化钠5g 半腕氨酸400mg
琼脂20g 脱纤维羊血或兔血50m1
酵母浸出粉5g 蒸馏水1000ml
①将上述成分（除血液外）混合，加热溶解，冷却后调整pH至7．4。②103．43kPa高压灭菌15min，冷却至50℃，加入无菌脱纤维羊血或兔血50m1，混匀后倾注平板。
10．明胶培养基硫乙醇酸盐及其他基础培养基加50g/L明胶即成。
11. L-色氨酸基质10g／L色氨酸加5ml 0.025mol／L pH7.4的磷酸盐缓冲液100ml, 过滤除菌，分装每管0．5m1，4℃保存。
12．糖发酵缓冲液
磷酸氢二钾0.04g 磷酸二氢钾0．01g
氯化钾0．8g 10g/L 酚红水溶液0.2m1
将上述成分加蒸馏水至100m1，过滤除菌，4℃保存备用。
13．0.025mol／L磷酸盐缓冲液
（1）原液：A液：Na2HPO4·2H20 35．6g加蒸馏水至1000ml；B液：NaH2P04·H2O27. 6g加蒸馏水至1000m1.
(2) 应用液：①0．025mol pH6．0酚红磷酸盐缓冲液A液6.15ml＋B液43.85m1十蒸馏水350ml＋1g／L 酚红0.8m1，混匀，过滤除菌，4℃保存。②0. 025mol／L pH6.8磷酸盐缓冲液：A液24．5ml＋B液25．5ml＋蒸馏水350m1，混匀，过滤除菌,4℃保存。③0．025mol ／L pH7．4磷酸盐缓冲液:A液40．5ml＋B液9.5ml＋蒸馏水350ml，混匀，过滤除菌，4℃保存。
14．CCFA培养基（环丝氨酸-头孢甲氧噻吩-果糖-蛋黄琼脂）
际胨2号40g 琼脂20g
磷酸氢二钠5g 1％中性红酒精溶液3m1
磷酸二氢钾1g 环丝氨酸500mg
氯化钠2g 头孢甲氧噻吩16mg
无水硫酸镁0.1g 50％蛋黄盐水悬液50m1
果糖6g 蒸馏水加至1000m1
除环丝氨酸、头抱甲氧噻吩、50％蛋黄盐水悬液外的上述成分，混合加热溶解，调pH 至7．6，103．43kPa高压灭菌15min。冷至50℃，以无菌操作加入环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、50％蛋黄盐水悬液，混匀后倒平板备用。
50％蛋黄盐水悬液的制备：取新鲜鸡蛋一只，置70％酒精中浸泡15min消毒，用无菌技术敲碎蛋壳一端，倒出蛋清后，将蛋黄倒人灭菌筒内，加入等量无菌盐水，用无菌玻棒搅匀后，即为50％蛋黄盐水悬液。
15．BBE琼脂平板（类杆菌-胆汁-七叶灵）
柠檬酸铁铵0．5g 植物胨5g
氯化血红素溶液5mg／ml）2ml 胰酪胨5g
庆大霉素溶液（40mg／ml）2．5ml 七叶灵1g
牛胆粉20g 琼脂15g
氯化钠5g 蒸馏水1000m1
上述各成分混合，加热溶解，调整pH7．0，103．43kPa高压灭菌15min，备用。16．卡那-万古霉素血琼脂（KVLB）
将CDC厌氧琼脂经高压灭菌后，冷却至50℃，加入无菌脱纤维兔血（5％），卡那霉
素（100ug/m1）和万古霉素（7．5ug/ml），混合后倾注平皿备用。
（姚淑娟）
实验五棒状杆菌属
（一）目的要求
1．掌握白喉棒状杆菌形态、常用染色方法、鉴别培养基及菌落特点。
2．熟悉白喉棒状杆菌鉴定试验和测定白喉毒素常用方法。
3．熟悉白喉棒状杆菌与类白喉棒状杆菌的鉴别要点。
（二）器材和试剂
1．菌种白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌。
2．培养基吕氏血清斜面、血液琼脂平板、尿素卵黄双糖琼脂斜面、单糖或糊精培养基、亚碲酸钾血液琼脂平板、Elek平板等。
3．试剂革兰染色液、Albert染色液、Neisser染色液、白喉抗毒素（DA T）。
4．其他1ml注射器、剃刀、豚鼠或家兔。
（三）步骤和方法
1．形态观察
（1）取白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌或模拟白喉咽拭子，涂片、固定、染色。典型的白喉棒状杆菌为革兰染色阳性，一端或两端膨大呈棒状；Neisser染色菌体呈棕黄色，异染颗粒呈棕褐色、菌体呈X、Y、W、N、M等字母形或栅栏状排列。
（2）Albert染色方法：在涂片上滴甲液5min后水洗，用乙液染1min后水洗。干后镜检，可见菌体呈草绿色，异染颗粒呈紫褐色，菌体排列同Neisser染色所见。
2. 菌落观察将白喉棒状杆菌分别接种于血平板、亚蹄酸钾血液琼脂平板、吕氏血清斜面或凝固鸡蛋清斜面。置35℃孵育18～24h，可在血平板上长出白色不透明菌落，本菌轻型菌株的菌落有狭窄溶血环，其余无溶血现象；在亚蹄酸钾血液琼脂平板上的菌落呈黑色；在吕氏血清斜面或凝固鸡蛋清斜面上可长出细小灰白色而有光泽的圆形菌落。
3. 生化反应将白喉棒状杆菌和其他（类白喉）棒状杆菌分别接种于明胶培养基、血清糖发酵管（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精）、尿素卵黄双糖琼脂斜面（先行穿刺接种，后在斜面划线接种）。置35℃孵育18～24h，观察结果（见表3-2-1及表3-2-2）。若呈阴性反应则延长至72h观察结果。
表3-2-1 白喉棒状杆菌和其他常见棒状杆菌的生化反应
触酶硝酸盐还原明胶液化葡萄糖麦芽糖蔗糖糊精
白喉棒状杆菌十十—十十一十
干燥棒状杆菌十十一十十十一
溃疡棒状杆菌十一一／十十十一十
表3-2-2 尿素卵黄双糖琼脂斜面上不同棒状杆菌的鉴别
底层（葡萄糖）斜面（蔗糖）
白喉棒状杆菌黄色不变色
干燥棒状杆菌黄色黄色
溃疡棒状杆菌红色红色
4. 血清学试验
（1）琼脂平板毒力试验：又称Elek平板毒力试验。
1）原理：白喉抗毒素与白喉毒素在琼脂中扩散，在相遇处发生特异性结合，形成肉眼可见的沉淀反应。用作白喉棒状杆菌毒力试验。
2）方法：①将E1ek培养基加热融化，冷至50～55℃，加入2ml无菌小牛血清或兔血清（经60℃30min灭活），混匀后倾注于无菌平皿中；②在琼脂尚未完全凝固前，将已浸有1000u ／ml白喉抗毒素（DA T）的无菌滤纸条（60mm×10mm）平铺于平板中央，然后将平板反扣于35℃（孵育箱）45min，以烘干表面水分；③用接种环分别取已知产毒素阳性菌、阴性菌和待检菌的大量菌苔，从滤纸条边缘垂直划线至平皿壁，划线宽为6～7mm，纸条两侧可分别接种3～4个菌株，各菌株间距10～15mm。将平板置35℃孵育24h、48h及72h，观察结果。
3)结果和意义：经35C孵育24～48h，若菌苔两侧出现斜向外侧延伸的乳白色沉淀线，并与邻近的阳性产毒株产生的沉淀线相吻合，可判断为产毒株。无毒株经72h仍不出现沉淀线。（2）SPA协同凝集试验：
1）原理：葡萄球菌A蛋白能非特异地与1gG的Fc段结合，而1gG的Fab段又能与相应抗原结合，形成抗原-IgG-葡萄球菌三者交互连接，出现肉眼可见的协同凝集反应。
2）方法：将待检培养物的上清液滴加于洁净载玻片上，滴加结合有DAT的SPA诊断试剂，混匀并静止片刻后观察结果。
3）结果和意义：若培养物上清液有白喉毒素,即可与SPA-IgG-DAT结合，出现肉眼可见的凝集反应。
（3）对流电泳：
1）原理：将抗原（白喉毒素）置于负极，抗体（DA T）置于正极，在电场中二者各自向对方泳动，经一定时间后二者相遇，并在比例合适的部位形成肉眼可见的乳白色沉淀线。2）方法：将DAi和待检菌培养物上清液分别加于琼脂板的两孔内，将DAT孔的一端置正极，培养物上清液孔的一端置负极，在电流4mA／cm、电压6～10V／cm的条件下电泳45min，判读结果。
3）结果和意义：若两孔间出现沉淀线，表示该待检菌为产毒菌株。
4）用途：本法简便快速，比E1ek试验敏感10～100倍，适用于大量标本检测白喉外毒素。5．动物试验
（1）原理：白喉外毒素可使敏感动物组织损伤以致死亡。若体内含有一定量的抗毒素，可中和进入的毒素，因而不出现局部组织的病变，使动物免于死亡，通常用豚鼠或家兔作为试验动物。
（2）方法：
1）取16～18h吕氏血清斜面或尿素卵黄双糖琼脂斜面上的纯培养，加肉汤1ml，制成悬液，用无菌吸管吸此菌液0.5ml加3.5ml肉汤混匀后即可使用。
2）选体重250g左右健康全白色豚鼠两只，一只在试验前24h腹腔注射DAT 1000U，使其获得免疫作为对照动物，另一只不注射DA T作为试验动物。接种前将豚鼠腹部朝上固定于架上。温水洗净腹部后剃毛（不可刮破皮肤，也不要消毒皮肤）。剃毛后再用生理盐水棉球擦洗一次，干后用1ml注射器吸取细菌悬液，分别注射0.1m1菌液于试验和对照豚鼠腹壁皮内。为防止菌株毒力太强使动物致死，接种4h后给试验动物注射DAT400U。通常每只豚鼠可接种6～8份标本；注射后24h、48h和72h分别观察皮内反应。
3）结果：产毒阳性菌株为阳性反应24h左右在腹壁注射部位出现红肿，48h红肿部位边缘呈化脓性病变，72h后可见硬块，并出现灰色坏死斑。不产毒株呈阴性，72h后注射部位元明显病变。若试验动物及对照动物的接种部位均有病变出现，则结果为可疑，可能因注射量过多或抗毒素量过少或失效所致，应重新试验。
4）用途：动物试验在临床检验工作中较少使用，仅用于检查ELek平板毒力试验结果可疑者。
（四）临床意义
本菌属中的白喉棒状杆菌以外毒素为主要致病物质，是呼吸道传染病白喉的病原菌。白喉外毒素侵入血流可引起心肌和神经系统损害。除白喉棒状杆菌之外的其他棒状杆菌统称为类白喉棒状杆菌，有些为条件致病菌，可引起机会感染。
（五）注意事项
为保持白喉棒状杆菌毒力，细菌培养物在室温中搁置时间不超过2h，在4℃不超过4h.毒力试验除用新分离菌株外，须有标准菌株（中间型park William N0.8菌株）作对照。附录
1．吕氏血清斜面
（1）成分：100g／L葡萄糖肉汤（灭菌，pH7．4）1份小牛血清（或兔、羊、马血清）3份。（2）配制方法：
1）用无菌操作法将上述成分混合于灭菌三角烧瓶.
2)无菌分装于15rnm×150mm灭菌试管，每管3～5m1。
3）将试管斜置于血清凝固器内，间歇灭菌3天。第1天徐徐加热至85℃，维持30min，使血清凝固，置35℃温箱过夜；第2天和第3天再用85～90℃灭菌30min，取出后置4℃备用。（3）用途：用于白喉棒状杆菌培养。
2．亚碲酸钾血琼脂平板
（1）成分：pH7．6营养琼脂100ml，10g／L亚碲酸钾水溶液2ml,50g／L胱氨酸水溶液2m1，脱纤维丰血或兔血5～10m1。
（2）配制方法：将pH7．6营养琼脂熔化，待冷至50℃左右，加入已灭菌的亚碲酸钾溶液，眺氨酸溶液及脱纤维血液，摇匀后即刻倾注无菌平皿，凝固后置4℃备用。
（3）用途：用于白喉棒状杆菌培养。
3.尿素卵黄双糖琼脂斜面
（1）成分：营养琼脂（pH7．8～8．0）100m1，1g／L酚红溶液2．5ml，200g／L蔗糖溶液5m1，100g/L葡萄糖溶液1m1，200g／L尿素溶液lml，新鲜鸡蛋黄（无菌取出）1个。（2）配制方法：
1）取营养琼脂熔化后加入酚红，高压蒸汽灭菌103．43kPa 15min，置70℃水浴中备用。
2）将蔗糖、葡萄糖、尿素等溶液混匀，加人卵黄1个，混匀后加入上述营养琼脂，充分混匀。
3）无菌分装制成高层斜面，待凝固后作无菌试验，如仍保持原来的鲜明淡红色即置4℃备用；如培养基已变淡黄色，表示有污染，不可使用。
（3）用途：用于白喉棒状杆菌鉴别培养.
4．ELek培养基
（1）成分：
1）甲液：胰蛋白胨4.0g、麦芽糖0．6g、纯乳酸0．14m1、加蒸馏水至100m1。
2）乙液：琼脂3．0g、NaCl 1．0g加蒸馏水至100m1。
（2）配制方法：
1）将甲、乙液中各成分分别加入蒸馏水中，加热溶解，用脱脂棉过滤后校正pH为7.8。
2）将甲、乙液等量混合，分装试管，每管15m1。
3）置试管于阿诺灭菌器，100℃20～30min间歇灭菌（同吕氏血清斜面），置4℃备用。使用时将熔化后冷至55C的Elek琼脂按5：1的量加入无菌正常兔或牛血清，充分混匀倾注无菌平皿，凝固后即可使用。
（3）用途：用于自喉棒状杆菌毒素测定。
（姚淑娟）
实验六需氧芽胞杆菌属
一蜡样芽胞杆菌
（一）目的要求
1. 熟悉蜡样芽胞杆菌形态染色、菌落特点、常用生化反应及鉴定试验、活菌计数方法。
2.了解蜡样芽胞杆菌肠毒素测定方法。
（二）器材和试剂
1.菌种蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。
2.培养基营养琼脂、血液琼脂、卵黄琼脂，葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷、乳糖、甘露醇、木糖等糖发酵管，葡萄糖蛋白胨水、柠檬酸盐培养基、醋酸铅明胶培养基。
3.试剂吲哚试剂、50％a-萘酚酒精溶液、含3g/L肌酸的40％KOH、鞭毛染色液、3％过氧化氢。
4.动物小鼠、家兔。
（三）步骤和方法
1.形态观察将待检标本（如食物中毒剩余食物）或纯培养物涂片，作革兰染色，可见两端钝圆、链杆状排列的革兰阳性大杆菌，无荚膜。培养6h后可形成小于菌体的圆形芽胞。鞭毛染色可见有周鞭毛。
2.菌落观察将可疑食物或培养物加适量生理盐水研磨后划线接种于普通平板和血液琼脂平板，35℃孵育18～24h。在普通营养琼脂上形成圆形凸起的菌落，表面粗糙有蜡光，不透明，似毛玻璃。血液琼脂平板上菌落周围形成。溶血环。在卵黄琼脂平板上菌落周围形成乳白色混浊环。
3.生化反应
（1）碳水化合物试验：将蜡样芽胞杆菌分别接种于葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷、乳糖、甘露醇、木糖等糖发酵管和葡萄糖蛋白胨水、柠檬酸盐培养基上，35℃孵育18～24h，观察结果。该菌能分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷产酸不产气，不分解乳糖、甘露醇，不产生吲哚，触酶、VP试验阳性。
（2）含氮化合物试验：将蜡样芽胞杆菌接种于醋酸铅明胶培养基，经35℃孵育18～24h，观察结果，该菌H2S阴性、明胶液化。
（3）乳光反应
①原理本菌能产生卯磷脂酶，在有Ca2+存在时，能迅速分解卵磷脂，生成甘油酯和
水溶性磷脂胆碱，故在菌落周围出现乳白色混浊环，称乳光反应或卵黄反应.
②方法：用接种针挑取可疑菌落点种在10％卵黄琼脂平板上，35℃孵育3h。
③结果和意义3h无菌落生长，但在点种处可出现混浊环，6h后混浊环直径可扩大至5～6mm。用于测定细菌能否产生卵磷脂酶，也可以此来计数菌落。
（4）触酶试验：阳性.
本菌与枯草芽胞杆菌的不同点是不分解木糖，与炭疽芽胞杆菌的不同点是能迅速液化明胶，利用柠檬酸盐。
4．动物试验
（1）毒力试验：将研磨过的可疑食物或培养物0．3～0．5ml接种于18-20g小白鼠腹腔内，小白鼠于接种后12～18h内死亡，解剖死亡小归鼠，取心血涂片，作革兰染色，可见蜡样芽胞杆菌典型形态。
（2）毒素测定：蜡样芽胞杆菌不同菌株产生不同类型的肠毒素。可用家兔肠管结扎试验鉴定。产生呕吐型肠毒素的菌株家兔肠管结扎试验阴性，而产生腹泻型肠毒素的菌株肠管结扎试验阳性。
5.活菌计数将残余食物用生理盐水稀释成10-1～10-3。
（1）乳光反应计数法：取各稀释度的悬液0.1ml以L形玻璃棒均匀涂布，接种于卵黄琼脂平板上，置35℃孵育6h，本菌在此平板上产生乳光反应，易于识别。
6.常用10％卵黄琼脂培养基
（1）成分：50％卵黄盐水20m1，pH7．4营养琼脂100m1。
（2）配制方法：将营养琼脂加热熔化，待冷却至55C左右，以无菌技术加入50％卵黄盐水悬液，混匀后倾注于无菌平皿内，凝固后置4℃备用。
（3）用途：用于测定蜡样芽胞杆菌的脂酶。
二炭疽芽胞杆菌
（一）目的要求
1．熟悉炭疽芽胞杆菌形态染色和菌落特点。
2．了解炭疽芽胞杆菌生化反应及具有鉴定意义的常用试验和方法。
（二）器材和试剂
1．菌种炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌。
2．培养基营养琼脂、血液琼脂、0．5％NaHCO，、10％马血液琼脂、含0.05～0.5IU／m1、5IU／m1、10IU／m1和100IU／m1的青霉素琼脂、戊烷眯琼脂、各种生化反应培养基。
3.试剂青霉素1IU／片纸片、AP631炭疽芽胞杆菌噬菌体
（三）步骤和方法
1．形态观察本菌是菌体两端平截呈矩形、短链状或竹节状排列的革兰阳性大杆菌，无鞭毛、芽胞椭圆形小于菌体，在陈旧培养物中可见游离的芽胞，有毒株可形成荚膜。2．菌落观察
（1）普通琼脂平板：接种本菌后经35℃孵育18、24h可生成直径2～4mm、扁平粗糙、不透明灰白色、无光泽、边缘不整齐的菌落，在低倍镜下可见到菌落呈卷发状。
（2）血液琼脂平板：接种本菌后经35℃孵育：12～15h，出现不溶血菌落，18～24h后可有轻微溶血。
（3）重碳酸盐平板：将有毒株接种于NaHCO3血琼脂平板，置5％CO2环境中，35℃孵育18-24h，可产生荚膜，菌落由粗糙型（R）变为粘液型（M），而呈现半圆形，凸起，有光泽的菌落。以接种针挑取菌落可出现拉丝现象。卷发状菌落和菌落拉丝现象是本菌的鉴别要点。
（4）戊烷眯琼脂平板、接种本菌经35℃孵育18～24h后可见灰白色不规则圆形，表面粗糙，呈卷发状的菌落，刚从孵育箱中取出时不溶血，24h后有时会出现轻微溶血现象本菌的无毒株为粗糙型菌落，有毒株为光滑型菌落。
3．生化反应将本菌接种于葡萄糖、麦芽糖、果糖、硝酸盐、葡萄糖蛋白胨水、明胶、尿素、柠檬酸盐等培养基，35℃孵育18～24h，观察结果，本菌分解葡萄糖、麦芽糖果糖产酸不产气，触酶阳性，能还原硝酸盐、vp试验和脲酶阴性，不液化明胶，不利用柠檬酸盐。4．血清学试验炭疽热沉淀反应，又称Asco1i试验。
取死亡病畜的腐败的脏器、皮毛、肉食及其制品剪碎，加入5～10倍生理盐水、先浸泡2～3h，再在沸水中煮5～15min，用滤纸过滤，滤液即为沉淀原。取3支沉淀管，吸取炭疽沉淀血清0.5ml加入第1、2管中，第3管加正常兔血清对照；吸取上述沉淀原，沿管壁轻轻加入第1、3管中，勿混匀；吸取正常组织或皮毛滤液加入第2管中作为正常抗原对照。如第1管界面出现白色沉淀环，即为阳性。
5．动物实验取纯培养物接种于肉汤培养液，35℃孵育18～24h，吸取0．1ml接种于小鼠皮下，小鼠于72-96h发病并死亡。解剖后可见接种部位呈胶样水肿，肝脾肿大出血，血液呈黑色且不凝固。取心血、肝、脾涂片染但镜检，可检出本菌。将肉汤培养物0.2m1接种于豚鼠或家兔；该动物于48~72h死亡，解剖所见同小鼠，蜡样芽胞杆菌对豚鼠或家兔无致病力。
6．重要鉴定试验
（1）噬菌体裂解试验：将一接种环待检肉汤培养物（经35℃孵育4～6h），涂布于营养琼脂平板，干后将AP631炭疽芽胞杆菌噬菌体滴于平板中央或划一直线，于后置35℃孵育18h出现噬菌斑或噬菌带者为阳性。每份标本应作2～3个同样的试验，同时滴种肉汤液作阴性对照。（2）串珠试验：将待检菌接种于0．05～0．5IU／ml青霉素的培养基，35℃孵育6h后。取菌涂片染色，可见炭疽芽胞杆菌形态发生明显变化，形成大而均匀成串的圆球状菌体，即串珠试验阳性。蜡样芽胞杆菌无此反应。
（3）青霉素抑制试验：将待检菌分别接种于含青霉素5、10、100IU／ml的青霉素琼脂平板，35℃孵育18～24h。炭疽芽胞杆菌能在含5IU／ml的青霉素琼脂平板上生长，在含10、100IU／ml的青霉素琼脂平板上受抑制而不能生长。
（4）串珠和青霉素抑制联合试骏：将待检菌新鲜肉汤培养物0．1ml滴于预温的2％血清琼脂平板的一半，另一半滴力加蜡样芽胞杆菌新鲜肉汤培养物0．1m1，分别用灭菌L形玻璃棒涂布，干后将含青霉素1IU/片纸片贴于其上，35℃孵育2h左右，打开平皿置低倍镜下观察，可见药物纸片周围有一无菌生长的抑菌环，其周围由于青霉素浓度低；菌体细胞壁受损而成为串珠。观察完毕继续置35℃孵育8～12h，测量抑菌圈直径。炭疽芽胞杆菌出现明显抑菌圈、串珠试验阳性而蜡样芽胞杆菌无此反应。
三产单核李特菌
（一）目的要求
1. 熟悉产单核李斯特菌形态学和菌落特点。
2．了解产单核李斯特菌的主要生化反应和兔眼结膜毒力试验。
（二）器材和试剂
1. 菌种产单核李斯特菌。
2．培养基营养琼脂、血液琼脂、萘啶酸琼脂、亚碲酸钾血琼脂，葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、果糖、水杨酸、乳糖、蔗糖、糊精等各种糖发酵管及葡萄糖蛋白胨水、尿素、明胶和硝酸盐还原培养基。
3．试剂甲基红试剂、α一萘酚酒精溶液、含3％肌酸的40％KOH、3％H202溶液。
4．动物幼兔。
（三）步骤和方法
1．形态观察取产单核李斯特菌涂片染色镜检，该菌为革兰阳性小杆菌，多形态，菌体直或稍弯，常呈―V‖字形成对排列，或呈丝状，多数菌体一端较大，似棒状，易误认为污染的
类白喉棒状杆菌，有时短小的菌体三五成链，似链球菌。该菌有鞭毛，无芽胞，不形成荚膜，在陈旧培养基上可转变为革兰阴性，两端浓染，易误判为革兰阴性双球菌。
2．菌落观察将产单核李斯特菌接种普通平板和血琼脂平板，经30～35℃孵育18～24h，菌落极小呈露滴状，且透明光滑，侧光微显蓝绿色J5C孵育数日可形成直径2mm的灰暗菌落。在血琼脂平板上，菌落有狭窄的p溶血环。接种在蔡陡酸选择平板上，经35C孵育数日，可见直径0．2～0．8mm边缘整齐、表面细密湿润的蓝色圆形菌落。在亚蹄酸钾血琼脂平板上可形成黑色菌落。
3．生化反应本菌分解葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、果糖、水杨酸产酸不产气，触酶阳性，MR、VP试验阴性，在3～10天内可迟缓发酵乳糖、蔗糖和糊精产酸不产气，吲哚、脲酶试验阴性，不液化明胶，不还原硝酸盐。
4．血清学试验本菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等多数革兰阳性菌及大肠埃希菌有共同抗原，故血清学试验无鉴别意义。
5．动物试验兔眼结膜毒力试验。将本菌18h肉汤培养物滴入幼兔眼结膜，24～36h 内引起化脓性角膜结膜炎，若角膜混浊，结膜水肿且有渗出物，即为阳性，在渗出物涂片和培养中均可查到此菌。
（四）临床意义
本菌属常经胎盘、产道感染，引起流产和新生儿脑膜炎；眼、皮肤与病畜接触可发生局部感染，甚至发展为败血症和心内膜炎等。近年报道因病畜污染牛奶和乳酪等可引起食源性感染的流行。
常用萘啶酸琼脂培养基
（1）成分：营养琼脂200m1、，10g/L萘啶酸2m1。
（2）配制方法：将营养琼脂熔化后加入萘啶酸即成。
（姚淑娟）
实验七分枝杆菌属
一、结核分枝杆菌
（一）目的要求
1．掌握结核分枝杆菌的染色性与形态学检查法。
2．熟悉结核分枝杆菌的培养方法、菌落特征及非典型分枝杆菌的鉴定方法。
（二）器材和试剂
1．菌种结核分枝杆菌、BCG、耻垢分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌。
2．培养基改良罗一琴培养基。
3．试剂5g／LNaOH、2％H2 SO4、二甲苯或汽油、10％Tween一80、30％H202、0.067mo1／L pH7．0的磷酸缓冲液、妻-尼（Ziehl一Neelsen）抗酸染液、金胺（O）荧光染液（pH6.8）。4．其他肺结核患者痰标本。
（三）步聚和方法
1．形态观察
（1）直接涂片法：用接种环挑取结核病人痰标本中的脓性或干酪样部分，直接涂于载玻片上，均匀涂抹成2．0cm×2．5cm大小的卵圆形痰膜；也可待干燥后再涂一层，制成厚膜涂片。自然干燥，微火固定，经抗酸染色或金胺（O）荧光染色，显微镜检查或荧光显微镜观察。
（2）集菌涂片法：
1）沉淀集菌法：尿、胸水、腹水及脑脊液等体液标本，多用离心沉淀，3000r／min离心30min，弃上清后取沉淀物涂片；痰液取2～3ml加1～2倍量20g／LNaOH，经103．43kPa
高压灭菌15min，3000r／min离心30min，取沉淀物涂片，再作染色镜检。
2）漂浮集菌法：取晨痰或12～24h痰液经103．43kPa高压灭菌15min，待冷后取5～
10m1放人100ml角烧瓶内（口径约2cm），加灭菌蒸馏水20～30m1，总体积勿超过容器的1/3，加二甲苯0.3m1，放振荡器上振荡10min后取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15～20min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于玻片上，自然干燥，火焰固定，作抗酸染色或金胺（O）荧光染色，镜检。（3）抗酸染色法、金胺（O）荧光染色法见第一章第一节
（4）结果观察与报告方式：
1）抗酸染色标本镜检：在淡蓝色背景下可见染成红色的细长或略带弯曲的杆菌，并有分枝生长趋向，为抗酸染色阳性菌。其他细菌和细胞呈蓝色。直接涂片标本中常见菌体单
独存在，偶见团聚成堆者。若在痰、脑脊液或胸、腹水中找到抗酸菌，其诊断意义较大。
显微镜物镜（100×）所见结果按下列标准报告：
—：仔细观察300视野（观察时间不少于4min），未发现抗酸杆菌。
士：可疑。发现抗酸菌1～2条／300视野。
1＋：发现抗酸菌3～9条／100视野。
2十：发现抗酸菌1~9条／10视野。
3十：发现抗酸菌：1～9条／每视野。
4十：发现抗酸菌≥10条／每视野。
以上报告方式只适于直接涂片，对集菌法涂片应按―发现抗酸菌‖或―未发现抗酸菌‖报告。
2）荧光染色标本镜检：在暗视野背景下抗酸菌呈黄绿色或橙黄色荧光。荧光染色后涂片应在24h内检查。物镜（20×）检查结果按下列标准报告。
一：荧光染色抗酸杆菌阴性，0条／50视野。
士：荧光染色抗酸杆菌可疑，1～3条／50视野。
1十：荧光染色抗酸杆菌，10～99条／50视野。
2十：荧光染色抗酸杆菌，1～9条／每视野。
3十：荧光染色抗酸杆菌，10～99条／每视野。
4十：荧光染色抗酸杆菌≥100条／每视野。
2．菌落观察
（1）培养特性：取痰标本1～2m1，加20g／LNaOH 2～4倍量，振荡器振荡5～10min或置室温30min，其间振荡2～3次，使痰液化。取消化后痰液0.1m1，无菌操作接种于罗-琴培养基斜面上，并反复倾斜培养基使痰液均匀分布，保持涂片于水平面，每分标本应同时接种两支斜面，置37℃孵育一周后再直立于试管架上培养4周以上。接种后第3天、7天观察，此后每周观察一次菌落生长情况，阳性生长斜面需经抗酸染色镜检确认是否为分枝杆菌后报告生长情况。
（2）菌落特点及报告方式：观察结核分枝杆菌或卡介苗在罗-琴培养基上的菌落，呈乳，白色或米黄色、呈粗糙颗粒状，形似花菜心，表面干燥。若无菌落生长需观察至第8周未。一：分枝杆菌培养阴性，斜面无菌落生长。
1＋：菌落数在20个以上或菌落占斜面面积1/4者。菌落在20个以下者实报菌落数。
2＋：菌落占斜面面积1／2。
3＋：菌落占斜面面积3／4。
4＋：菌落布满斜面面积，或菌落密集汇成菌苔。
3．生化反应（表3-5-1）
表3-5-1 生化反应鉴别表
分枝杆菌名称37℃生长生长速度耐热触酶硝酸盐还原脲素酶
结核分枝杆菌十缓慢一十十十十十
堪萨斯分枝杆菌十缓慢十十一
耻垢分枝杆菌十缓慢十十？
＋84％以上菌株阳性；一少于16％阳性；？无准确数据
（1）耐热触酶试验：
1）原理：有些分枝杆菌经68℃处理后，产生的过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。2）方法：取生长在改良罗一琴培养基3～4周的菌落，经磨菌比浊制备10mg／ml菌悬液，取0．5ml混悬于含1m1 pH7．0 15M PBS液的试管内，置68C水浴20min，待冷却后缓缓滴加30％H202与10％聚山梨酯（Tween一80）等混合液0．5ml（临用前混合配制）。
3）结果和意义：持续产生小气泡者为阳性。10～20min内仍无气泡产生为阴性。空白试剂对照无气泡产生。堪萨斯分枝杆菌为阳性，结核分枝杆菌为阴性。
（2）硝酸盐还原试验：
1）原理：某些分枝杆菌产生硝酸盐还原酶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在酸性条件下与氨基苯磺酸，N-奈乙烯二胺盐酸盐形成偶氮化合物，使菌液变成红色为阳性，不变色者为阴性。2）方法：取生长在改良罗氏培养基3～4周的菌落，经磨菌比浊制备10mg／ml菌悬液，取0．5ml混悬于含2ml硝酸盐溶液（NaNO30．085g溶于pH7．0 1／15M PBS I00m1 内，103．43kPa灭菌20min）中，放37℃水浴2h，取出后每管加1滴二倍稀释的浓HCL，再加2滴0．2％氨基苯磺酸和2滴N一奈乙烯二胺盐酸盐液，1min后观察结果。
3）结果和意义：1min后呈红色者为阳性，无色者为阴性，空白试剂对照为无色。结核分枝杆菌为强阳性，牛型分枝杆菌为阴性。
（3）脲酶试验：
1）原理：某些分枝杆菌产生脲酶，分解脲素，使菌液中指示剂呈红色。
2）方法：取在改良罗一琴培养基生长3～4周的菌落，经磨菌比浊制备10mg／ml菌悬液，取0．5m1混悬于3ml 0．12％尿素溶液（用无菌的pH6．71／10M PB配制0．12％尿素，经220nm微孔滤膜滤过除菌）内，每管加无菌的0.1％酚红1滴（酚红0．1g加0．05mol／LNaOH 溶液5．7m1溶解后，加水至100m1，54．04kPa l0min灭菌），置37℃孵育3天，观察结果。3）结果和意义：菌液呈红色者为阳性，不变色者为阴性，空白试剂对照不变色。结核分枝杆菌呈阳性，蟾蜍分枝杆菌呈阴性。
（四）临床意义
结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道和皮肤粘膜的损伤处等多种途径侵入机体，引起各组织器官的结核病，其中以肺结核最为常见。腹膜、淋巴结、皮肤，肾脏、脑膜、骨、关节等皆可发生结核。对人有致病性的主要是人型结核杆菌，其次为牛型结核杆菌。初染结核病容易发生淋巴。血流播散。当机体免疫力下降时，初染残存于巨噬细胞内的结核分枝杆菌可重新活动繁殖，导致疾病的发生，即所谓内源性感染；若由外来细菌引起发病者，称为外源性感染。
二、麻风分枝杆菌
（一）目的要求
了解麻风分枝杆菌的染色性与形态特征。
（二）器材与试剂
1．麻风病人的病理组织切片或渗出液涂片。
2．抗酸染色液。
（三）步骤和方法
1．麻风病人的病理组织切片或渗出液涂片的抗酸染色步骤、方法同结核分枝杆菌。
2．麻风分枝杆菌与结核分枝杆菌的镜下鉴别要点见表3-5-3。
表3-5-3 麻风分枝杆菌与结核分枝杆菌的形态学鉴别
鉴别点麻风分枝杆菌结核分枝杆菌
标本来源病变组织痰、尿、体腔液
涂片中菌数较多较多
菌体形态粗直两端尖细细长略弯曲
排列方式呈束状或柴棍状单个散在
3．结果观察
（1）麻风细胞：病变部位渗出液涂片中或病理切片中可见大量麻风分枝杆菌，存在于细胞内，这种细胞的胞浆呈泡沫状，称麻风细胞。。
（2）菌体的不完整变化：麻风分枝杆菌经抗酸染色后，菌体完整着色，均匀一致者称完整染色菌；但有时出现多形性，菌体断裂或缺损形成短杆状、哑铃状、球形等，称不完整染色
菌。此变化常出现于有效治疗之后，可作为考核治疗效果的一个重要指标。
4．报告方式在油镜下至少查看100个视野，并按以下标准报告：
一：100个视野中无麻风分枝杆菌。
十：在每个视野中可查到1个或少于1个麻风分枝杆菌。
2＋：在每个视野中均可见到麻风分枝杆菌。
3＋：每个视野中均见许多麻风分枝杆菌。‖
（四）临床意义
麻风分枝杆菌是麻风的病原体，麻凤是一种但性传染病，主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢的损害，晚期可侵犯深部组织和器官。麻风在世界各地均有流行。我国沿海各省也不少见。据近年的统计，麻风患病率已明显下降。人类是麻风杆菌的唯一宿主，是主要传染源。麻风可分为两型（瘤型、结核样型）和两类（界线类、未定类）。婴儿主要由密切接触受染，无先天性麻风。
常用培养基
l．改良罗一琴培养基
谷氨酸钠（纯度95％以上）7．2g KH2P0４14．０g
MsSO·7H２O 0．24g 柠檬酸镁0．6g
丙三醇12ml 马铃薯淀粉30g
20g／L孔雀绿水溶液20ml 新鲜鸡卵液1000ml
蒸馏水600ml
将盐类成分溶解于蒸馏水后，加马铃薯淀粉，混匀，置沸水浴内煮1h成糊状（不时摇动，防凝块）；待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液（包括卵白、卵黄并搅拌均匀）1000ml （约需卵30个）混匀，再加无菌的20g／L孔雀绿水溶液20m1，混匀后分装于无菌中试管（18mm×150mm）内，每管加培养基7m1，加塞后斜置血清凝固器内1~2层为宜，斜面高度占试管2／3，９０℃1．５h或85℃lh间歇灭菌两次，冷却后经37℃无菌试验24h培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力，管内如无凝结水，可加0．2ml 无菌生理盐水以防干燥，置4℃保存，一个月内使用。
2．妻一尼抗酸染色液
（1）染色剂：碱性复红乙醇贮存液（碱性复红8g，溶于95％乙醇10０ml中）10m1，加5％石炭酸水溶液90m1，混匀称石炭酸复红液。
（2）脱水剂：5％盐酸乙醇液（浓盐酸5ml加95％乙醇95ml混匀）即为贮存母液，使用时10倍稀释。
（3）复染剂：亚甲蓝0．3g加95％乙醇50ml待溶后，加蒸馏水至100ml混匀。即为贮存母液，使用时10倍稀释。
（姚淑娟）
实验八真菌学
真菌是不分根、茎、叶，不含叶绿素为特征的一大类真核细胞型微生物。种类很多，分布极广，其中有许多与人类日常生活有着密切联系。少数真菌可以感染人体形成真菌病。真菌引起的疾病是多种多样的，以皮肤、毛发和指甲等浅部疾患居多，但近年来，深部致病的真菌也日益重要。
一真菌形态结构的观察
真菌的形态有单细胞和多细胞两种类型。前者细胞呈圆形或椭圆形，结构较为简单，如新型隐球菌、白色念珠菌等：大多数真菌为后者，多呈丝状，其本结构分为菌丝和孢子。真菌的菌落也与一般细菌不同，掌握真菌的形态结构和菌落特点对菌种的分类鉴定有重要意义。
（一）目的要求
1．掌握单细胞和多细胞真菌的菌丝、孢子的形态特点。
2．掌握真菌不染色标本直接检查方法。
（二）器材和试剂
1示教片：新型隐球菌墨汁染色示教片。白色念珠菌乳酸酚棉蓝染色示教片。石膏样小孢子菌乳酸酚棉蓝染色示教片。红色癣菌乳酸酚棉蓝染色示教片。
2．标本：病人的皮肤、甲屑、毛发。，
3．试剂：100g／L KOH溶液。
4．其他：小镊子、盖玻片、载玻片、普通光学显微镜。
（三）步骤和方法
1．将新型（生）隐球菌墨汁染色示教片置高倍镜下观察，可见有很厚的荚膜包围在菌体的周围，透明发亮。有时可见到菌体发芽，茵体呈球形，大小不等。
2．将白色念珠菌（白色假丝酵母菌）乳酸酚棉蓝染色示教片置油镜下观察，可见白色念珠菌菌体呈卵圆形，较葡萄球茵大2～5倍。细胞出芽伸长而形成假菌丝，在假菌丝生长点上有芽生孢子及沿假菌丝顶端生长的大而圆的厚膜孢子。
3．将石膏样小抱子茵乳酸酚棉蓝染色示教片置高倍镜下观察，可见大分生孢子呈纺锤形，具有分隔，每隔为一个细胞。菌丝两侧可有无柄或短柄的少数棍棒状小分生孢子，有时可见厚膜孢子，菌丝呈球拍状、梳状或结节状。
4．将红色癣菌乳酸酚棉蓝染色示教片置高倍镜下观察，菌丝有隔，两恻可见梨形或棒状侧生小分生孢子，有的有较短的分生孢子柄，大分生孢子较少，壁薄，细长，表面光滑呈棒状。在陈旧培养基中可见厚膜孢子、关节孢子、球拍状菌丝。
5．真菌不染色标本直接检查法
（1）制片：用小镊子取少许甲屑、皮屑或病发，置于载玻片中央，滴1～2滴100g/LKOH溶
实验四厌氧菌 一、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌 （一）目的要求 1. 掌握破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的形态特点、培养特性和鉴别要点。 2. 熟悉破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的分离培养过程、鉴别的一般原则和常用方法。 3. 解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的外毒素毒性动物实验。 （二）器材和试剂 1．菌种破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌菌种及其形态示教片。 2．培养基疱肉培养基、血琼脂培养基、牛乳培养基、五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵管、牛心脑浸液肉汤与琼脂、脂酶培养基。卵黄琼脂、溴甲酚紫牛乳培养基。 3. 试剂革兰染色液（一套）、芽胞染色液（石炭酸复红、95％酒精、碱性美蓝）、焦性没食子酸、100g/L氢氧化钾、溴甲酚紫；产气荚膜梭菌抗血清、肉毒梭菌多价抗血清、索氏梭菌抗血清；2０g／L尿素L-色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。 4. 其他小白鼠、家兔、无菌注射器、无菌吸管、滴管、中、小试管、消毒纱布块；固体石蜡或凡士林、酒精灯、三角架、碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；剪刀、镊子、玻片、药勺、钯粒；厌氧袋、厌氧罐、离心机、水浴锅等。 （三）步骤和方法 1．破伤风棱菌 （1）形态观察观察破伤风梭菌示教片，其繁殖体型为革兰阳性细长杆菌，散在排列，芽胞型的芽胞呈正圆形，位于菌体顶端，直径大于菌体，使芽胞和菌体呈鼓槌状；该菌鞭毛为周身鞭毛。 （2）培养物观察破伤风梭菌在疱肉培养基中生长缓慢，厌氧培养2～7天后其生长现象为培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑，有少量气体。生成的甲基硫醇、H２S等使培养物变臭。 破伤风梭菌在血琼脂平板上形成圆形、扁平的菌落。菌落中心结实，周边疏松似―羽毛状‖。菌落周围有α溶血环，培养时间延长可变为β溶血环。 （3）生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴锅中加热。热煮沸10min，迅速冷却。以无菌吸管吸取破伤风梭菌纯培养物，分别滴加。于牛乳培养基与五糖发酵管中，接种毕，在液面上加一薄层熔化的石蜡。经37℃孵育24～48h，观察结果。结果破伤风梭菌五糖（葡乳麦甘蔗）均不分解，牛乳培养基无变化。‖ （4）破伤风梭菌芽胞染色法 ①原理芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上后又难以脱色的特点设计的。所以芽胞染色法都基于同一个原则，采用 着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。 ②方法：a.用破伤风梭菌培养物涂片，干燥，火焰固定；b.滴加石炭酸复红液于涂片上，用微火加热至染料冒蒸汽（切勿煮沸）维持3～5min，加热过程要随时添加染液，勿让标本干涸，待玻片冷却后，水洗；c.用95％酒精脱色30s～1min，水洗：④滴加碱性美蓝液复染30s～lmin，水洗。⑤干燥后，镜检。 ③结果：芽胞染呈红色，菌体染呈蓝色。 2. 产气荚膜梭菌
破伤风杆菌（TETANUS）IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法） 使用说明（96T/48T） [原理] 本试剂盒采用亲和素-生物素化破伤风纯化抗原预包被板ELISA 原理，检测人血清/血浆中存在的破伤风IgM 抗体，并配以酶标记抗人IgM单克隆抗体作为标记物。加入底物TMB显色后终止反应，在450nm波长测各孔O.D值，O.D值的大小与待检抗体含量成正比。生物素系统（biotin-avidin system）的稳固级联放大作用，使试剂的特异性、灵敏度、稳定性极大地提高是本试剂含有的独特优点。 [用途] 本试剂盒用于定性检测人血清/血浆中的破伤风（TETANUS）IgM抗体，用于百白破菌苗接种后的效果监测和新伤口感染的早期诊断。 适应范围： 疫苗接种后效能监测。 早期诊断。 [试剂盒组成] 1、生物素化抗原预包被板1块（8X12/4X12） 2、阴性对照1瓶（直接使用） 3、阳性对照1瓶（直接使用） 4、标本稀释液 1瓶（20/10 ml，直接使用） 5、酶结合物1瓶（12/5ml，直接使用）
6、30X浓缩洗液 1瓶（20/10ml，加蒸馏水1：30稀释使用） 7、显示剂A、B液各1瓶 8、终止液（2M H2SO4）1瓶 9、说明书1份 [操作步骤] 1、将试剂盒平衡至室温后取出反应板拆封。 2、标本稀释：用标本稀释液以1：101（5ul—500ul）稀释标本。于反应板中加已稀释待检标本及阴阳性对照（100ul） 各一孔，设空白对照一孔（加100ul标本稀释液）轻拍混匀。37℃温育30分钟。甩去孔内液体，用洗涤液洗板3次并在吸水纸上拍干。 3、加酶结合物：每孔2滴，混匀后置37℃温育30分钟。同上法洗涤3次并拍干。 4、显色：每孔加显色剂A、B各一滴，轻拍混匀（或震荡器混匀）后置37℃10分钟。 [结果判断] 1、目测：在白色背景下观察各孔显色情况，蓝色者为阳性，无色者为阴性。 2、酶标仪测定：每孔加终止液一滴，混匀后在450nm下测定各孔O.D值。 ①S/N=标本O.D值/ 阴性对照O.D值。 ②S/N≥2.1为阳性； ③ 1.5≤S/N<2.1为可疑标本; S/N<1.5为阴性。 ④阴性对照(NC)小于0.10时以0.10计, 大于0.1小于0.21时以实际O.D值计算;若大于0.21时,实验 可能出现了较大误差,需重复实验。 ⑤阳性对照(PC)值通常≥0.4,实验成立,否则需重做。 [注意事项] 1、微孔板须密封防潮，从冷藏环境中取出时，应置室温平衡至潮气尽干后方可开启使用，余者 封存置2-8℃。 2、滴加试剂前应将液体翻转数次混匀，滴加时保持瓶身垂直。 3、洗涤时每孔均须加满，防止孔内有游离酶不能洗净。 4、试剂置2-8℃存放，不能冻结，有效期10个月。 5、避免用溶血、混浊或脂血标本。 6、最好用新鲜标本，如需保存，可于2-8℃冷藏48小时或-20℃冻存4周（样本应避光）。
综述：破伤风梭菌 破伤风是一种历史较悠久的梭状芽孢杆菌感染，破伤风梭菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生毒素可引起一种急性特异性感染。破伤风杆菌及其毒素不能侵入正常的皮肤和粘膜，故破伤风一般都发生在伤后，一切开放性损伤都可能引发破伤风。 特征： 破伤风梭菌菌体细长，长4～8um，宽0.3～0.5um，周身鞭毛，芽孢呈圆形，位于菌体顶端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。繁殖体为革兰氏阳性，带上芽孢的菌体易转为革兰氏阴性。破伤风梭菌为专性厌氧菌，最适生长温度为37℃ph7.0～7.5，营养要求不高，在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徙扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。对蛋白质有微弱消化作用。本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽孢抵抗力强大。在土壤中可存活数十年，能耐煮沸40～50分钟。对青霉素敏感，硫胺类有抑菌作用。 分布 大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，是一种革兰氏染
色性厌氧性芽孢杆菌，经伤口感染引起疾病。于自然界中可由伤口侵入人体，发芽繁殖而致病，但破伤风梭菌是厌氧菌，在一般伤口中不能生长，伤口的厌氧环境是破伤风梭菌感染的重要条件。窄而深的伤口（如剌伤），有泥土或异物污染，或大面积创伤、烧伤、坏死组织多，局部组织缺血或同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，局部氧化还原电势降低。有利于破伤风杆菌生长。破伤风梭菌能产生强烈的外毒素，即破伤风痉挛毒素破伤风。 致病物质及致病机理： 破伤风梭菌感染易感伤口后，芽孢发芽成繁殖体，在局部繁殖并释放破伤风痉挛毒素及破伤风溶血素。前者作用于脊髓前角运动细胞，封闭了抑制性神经介质，导致全身肌肉强直性收缩出现角弓反张（破伤风特有的症状），是引起症状的主要毒素。后者则能引起局部组织坏死和心肌损害。 破伤风毒痉挛毒素是一种神经毒素，为蛋白质，由十余种氨基酸组成不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。单一和一条多肽链，破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。破伤风梭菌没有侵袭力，只在污染的局部组织中生长繁殖，一般不入血流。当局部产生破伤风痉挛毒素后，引起全身横纹肌痉挛。毒素在局部产生后，通过运动终板吸收，沿神经纤维间隙至脊髓前角神经细胞，上达脑干，也可经淋巴吸收，通过血流到达中枢神经。毒素能与神经组织中的神经工苷脂结合，封闭了脊髓抑制性突触末端，阻止释放抑制冲动的传递介质甘氨酸和Y氨基丁酸，从而破坏上下神经元之间的正常
?破伤风梭菌(c .tetani)是破伤风的病原菌。 ?存在于人和动物的肠道，由粪便污染土壤。当机体受到外伤时创口被污染，或分娩时用不洁器械剪断脐带等，本菌即可侵入局部创面发芽繁殖，释放毒素引起机体强直性痉挛、抽搐．可因窒息或呼吸衰竭死亡。如不及时防治，病死率很高。在发展中国家新生儿破伤风死亡率可高达90％。 ? ?以上原因均可造成有利于破伤风梭菌生长繁殖的厌氧条件。破伤风梭菌只能在厌氧的局部生长繁殖，细菌不能入血引起菌血症或败血症。在局部产生的外毒素吸收入血，形成毒血症而发病。新生儿脐带残端也具备上述厌氧条件．接生时如处理不当也易引起破伤风梭茵的感染，造成新生儿的破伤风，死亡率极高。 ? ? ? 2.致病物质 ?外毒素：破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)和破伤风溶血毒素(tetanolysin),前者为主要致病物质。该毒素对脊髓前角细胞和脑干神经细胞有高度的亲和力，由菌体释放的毒素被局部神经细胞吸收或经淋巴、血液到达中枢神经系统。毒性极强，对人的致死量小于1ug，仪次于肉毒毒素。其化学性质为蛋白质，免疫原性强，应用0.3％甲醛作用4周可脱毒制成类毒素，用于人工主动免疫。破伤风溶血毒素具有溶血作用，在性质、功能和免疫原性上与链球菌溶血素O相似，但在破伤风中的作用尚不清楚。 ? ?3．致病机制破伤风痉挛毒素是由质粒编码表达的，在菌体内为一条分子质量约150 kDa的多肽，分泌到菌体外即被细菌蛋白酶裂解为一条分子质量约50 kDa的轻链(A链)和一条100 kDa的重链(B链)，2条肽链之间由二硫键连接，如果没有连接则失去毒性。其中轻链为毒性部分，重链具有识别受体和转运A链的作用。重链通过其羧基端识别神经肌肉结点处运动神经元外胞质膜上的受体，与之结合后使毒素进入细胞及其由细胞膜形成的小泡中。小泡从外周神经末梢沿神经轴突逆行向上，到达运动神纤元细胞体，经过突触后膜进入传入神经末梢，到达脊髓前角运动神经元，再上行至脑干。然后通过B链N端的介导产生膜的转位使轻链进人胞质。 破伤风痉挛毒素也有可能通过血液和淋巴循环到达中枢神经系统。轻链为一种锌内肽酶(zinc endopeptidase)，能降解抑制性神经介质小泡膜表面蛋白的特异性肽键，改变其结构，从而阻止抑制性神经介质甘氨酸和γ-氨基丁酸的释放。正常情况下，当一侧机体屈肌的运动神经元受到刺激而兴奋时，同时还有冲动传递给抑制性神经元，使其释放抑制性介质甘氨酸和γ-氨基丁酸，以抑制同侧伸肌的运动神经元，因此，当屈肌收缩时而伸肌自然松弛，肢体屈伸动作十分协调。 ?此外，屈肌运动神经元还受到抑制性神经元的反馈调节，使屈肌运动神经元的兴奋性强弱受到控制，不致过高。而破伤风痉挛毒素能阻止抑制性神经介质的释放，干扰了抑制性神元的协调作用。使肌肉活动的兴奋与抑制失调，导致屈肌、伸肌同时发生强烈收缩，骨骼肌出现强直性痉挛。