第25卷第4期
2005年12月林 产 化 学 与 工 业Che m istry and Industry of Forest Products V o.l 25N o .4
D ec .2005
分批和分批补料培养合成低纤维素酶酶活力的木聚糖酶
收稿日期:2005-02-01
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30471361)
作者简介:勇强(1968-),男,江苏宜兴人,副教授,博士,硕士生导师,
主要从事生物质资源生物转化和制浆造纸生物技术的研究。YONG Q 勇强,陈牧,景宜,尤纪雪,余世袁
(南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)
摘 要: 研究了里氏木霉R ut C 30在分批培养和分批补料培养模式下合成低纤维素酶酶活
力的木聚糖酶及其在生物漂白上的应用。底物质量浓度为15g /L 的木聚糖分批培养合成木
聚糖酶,酶活力为152.09I U /mL 、酶产率为2112.4I U /(L h)、酶得率为10139.3I U (以每克
木聚糖计,下同)。底物质量浓度为17g /L 的木聚糖分批补料合成木聚糖酶,酶活力为
252.14I U /mL 、酶产率为3501.9I U /(L h)、酶得率为14831.8I U,产酶效果远优于分批培养模式。该木聚糖
酶用于草浆预漂白,在相同有效氯用量下,与对照浆相比可使白度提高2%~5%,SBD;在达到相同白度条件
下,木聚糖酶预处理的纸浆后续漂白有效氯用量可降低43%。
关键词: 低纤维素酶酶活力木聚糖酶;生物漂白;分批补料
中图分类号:TQ352;Q 93 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2005)04-0006-05
PRODUCT I ON OF CELLUL A SE P OOR XYL ANASE BY BATCH AND
FED BATCH FER M ENTAT I ON S
YONG Q iang ,C HEN M u ,JI N G Y ,i YOU Ji xue ,YU Sh i yuan
(College of Che m ical Engineering ,N anjing Forestry Un i ver sit y,N anjing 210037,China )
Abstrac t :P repara ti on o f cell u l ase poor xy lanase by T r ichoderma reesei Rut C 30i n batch and fed ba tch fe r mentations
and its app licati on on b i obleach i ng w ere i nv esti g ated .The xy l anase acti v ity ,x ylanase vo lu m etr i c produc tiv ity and
xy lanase y ield in batch fer m entati on were 152.09I U /mL,2112.4I U /(L h)and 10139.3I U /g xy l an ,respecti ve
ly ,when 15g /L xy l an w as e mp l oyed as ca rbon source .Co m pared to ba tch fer m enta ti on ,xy lanase for m ation in fed
batch cu lture ,i n wh ich 17g /L xy lan w as e m ployed as carbon source ,w asm ore e ffi c ient and t he xy lanase activity ,xy
lanase vo l u m e tric producti v ity and y ield w ere 252.14I U /mL ,3501.9I U /(L h)and 14831.8I U /g xy l an ,respec
ti ve l y .W hen straw pulp w as pretreated w it h t he xy l anase poor xy l anase fo llowed by a hypoch l or ite bleach i ng ,a pulp
br i ght ness of 2%-5%(SBD )h i ghe r than t hat of the untreated one unde r the same hypochlor ite dosage cou l d be
obta i ned ,or 43%of active ch l o ri ne consumpti on cou l d be saved unde r t he sa m e b ri ghtness .
K ey word s :ce llulase poor xy lanase ;b i obleach i ng ;fed batch
造纸生产中往往采用含氯漂剂对纸浆进行漂白以提高纸品的白度,漂白过程中产生的含有大量有机氯化物的废水对环境污染十分严重,已成为一大公害。针对传统含氯漂白的局限性,一些无氯或低氯漂白技术应运而生,即采用氧、臭氧、过氧化氢、酶制剂等与含氯漂剂组成一定漂序,以减少漂白过程中的氯用量,甚至完全实现无氯漂白[1]
,以达到清洁生产和可持续发展的目的。在以上各种环境友好的漂白新技术中,木聚糖酶漂白预处理技术在国外已实现了工业化应用,在国内虽然还没有应用,但随着经济的发展和环保压力的增加,该技术的工业化应用是我国造纸工业发展的必然趋势。
第4期勇强,等:分批和分批补料培养合成低纤维素酶酶活力的木聚糖酶7
木聚糖酶在生物漂白上应用是否经济可行的关键,一方面木聚糖酶中纤维素酶酶活力要低,以避免纤维素酶对纤维的降解而使纸浆得率和强度降低[2];另一方面酶制备成本要低,即木聚糖酶合成过程中酶活力和酶产率要高。作者研究了里氏木霉以木聚糖为碳源分批培养和分批补料制备低纤维素酶酶活力的木聚糖酶。
1 材料与方法
1.1 材料
菌种:里氏木霉(Tricho d er m a reesei)Rut C30,木聚糖酶生产菌株,于4 保存在马铃薯-琼脂斜面培养基上;木聚糖:木聚糖酶合成碳源和诱导物,由江苏康维生物有限公司提供;培养基:木聚糖酶制备培养基如下(g/L):葡萄糖1,磷酸二氢钾2,七水硫酸镁0.08,二水氯化钙0.4,七水硫酸亚铁0.005,一水硫酸锰0.0016,七水硫酸锌0.0014,木聚糖、硫酸铵、尿素均适量,碳氮比值8.0。
1.2 木聚糖酶的制备
取50mL培养液置于250mL带棉塞的三角瓶中,接种量10%(体积分数),于170r/m in、28~30 的恒温旋转振荡器上培养,培养液离心分离除去菌丝体和木聚糖残渣后得到粗酶液。
1.3 纸浆漂白预处理
称取一定量的麦草浆放入塑料袋中,加入适量的酶和1m ol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,调节酶用量每克纸浆5I U、浆浓5%和p H值5.6,置于恒温水浴中45 下处理60m in,处理后用布袋过滤,备用。空白组是纸浆不经木聚糖酶预处理,直接用于后续化学漂白。
1.4 纸浆漂白
纸浆漂白采用次氯酸盐一段漂,药品与浆料在塑料袋中充分混合后置于恒温水浴中处理。处理条件为:温度38 ,时间2h,浆浓5%。
1.5 分析方法
1.5.1 还原糖测定采用DNS法 木聚糖酶酶活力和羧甲基纤维素(C MC)酶酶活力按标准方法测定[3]。0.5m L适当稀释的酶液和1.0mL用0.05m o l/L柠檬酸缓冲液配制的1g/L的桦木木聚糖(购于Sig m a)悬浮液混合,于50 下反应30m i n,一个木聚糖酶酶活力单位定义为每分钟生成1 m o l木糖所需的酶量。C MC酶酶活力测定方法与木聚糖酶酶活力相同,但以C MC为底物。
1.5.2 培养液中木聚糖浓度及菌丝体浓度的测定 将培养液离心后得到的固体残渣水洗离心3次,定容至50mL,搅拌均匀后取25mL,用已恒重的G3玻砂漏斗过滤,恒重得到木聚糖和菌丝体质量m;另25mL置于250mL三角瓶中,加入25m L8%的硫酸,在121 条件下水解1h,中和水解液并测定其木糖质量浓度C(g/L),则培养液中木聚糖质量浓度C1为:C1=2 C/1.1;产酶液中菌体质量浓度C2为:C2=(m-0.05C1)/0.05。
1.5.3 纸浆白度的测定 纸浆白度按标准方法采用DN-3型白度仪测定[4]。
2 结果与讨论
2.1 分批培养制备低纤维素酶酶活力的木聚糖酶
里氏木霉以质量浓度15g/L的木聚糖为碳源和诱导物分批培养合成木聚糖酶过程中各参数随时间的变化如表1。
由表1可知,木聚糖酶酶活力、酶产率和酶得率在第三天时达到最高,分别为152.09I U/mL、2112.4I U/(L h)和10139.3I U(以每克木聚糖计,以下同)。在培养过程中,木聚糖酶酶活力、C MC 酶酶活力和菌体浓度随着木聚糖的消耗而提高,培养第二天,当木聚糖质量浓度降为8.29g/L时,菌体质量浓度达到最高值9.71g/L。之后随着培养基中易消化的木聚糖减少,一方面,菌体开始死亡自溶,胞内木聚糖酶释放出来;另一方面,部分菌体继续利用剩余的木聚糖合成酶,因此,产酶2d后尽管菌体浓度呈下降趋势,但酶活力表现为上升趋势。在产酶后期,随着胞内氨基氮的释放,培养基的p H值快
8 林 产 化 学 与 工 业第25卷速上升,高的p H 值一方面使培养条件偏离微生物的适宜环境,另一方面使酶大量失活,导致酶活力在产酶后期呈大幅下降趋势。
表1 里氏木霉分批培养合成低纤维素酶酶活力的木聚糖酶各参数变化规律
T ab le 1 T i m e course o f cell ulase poor xy lanase preparati on i n ba tch fer m enta tion by T.reesei
时间/d ti m e p H 值
pH val u e
木聚糖酶酶活力/(I U mL -1)xylanase activit y C M C 酶酶活力/(I U mL -1)CM C ase acti vity 菌体浓度/(g L -1)cell con cn .残留木聚糖/(g L -1)residua l of xy l an 酶活比值1)XA /CA 木聚糖酶产率/(I U L -1 h -1)xyl anase producti v i ty 木聚糖酶得率/I U xylanas e y i el d 0
4.80 0.000.000.401
5.00 0.0 0.0 0.01
4.8533.000.203.4510.35 16
5.01375.02200.02
5.8591.870.359.718.29262.51914.06124.73
7.70152.09 0.496.04 4.96310.42112.410139.3 4
8.33100.72 0.175.34 2.61592.51049.26714.758.5565.480.093.620.73727.6 545.74365.3
1)木聚糖酶酶活力/羧甲基纤维素酶酶活力;xylanase acti v i ty /CM Case activit y
木聚糖酶用于生物漂白时,要求其中的纤维素酶酶活力尽量低,通常用木聚糖酶酶活力与C MC 酶酶活力的比值表示。由表1可知,酶活比随着培养时间的延长而提高,产酶第三天,酶活比值提高到310.4,说明培养过程中木聚糖酶合成的相对速度快于纤维素酶合成的速度,同时此比值下的木聚糖酶适合于生物漂白过程[5]
。在产酶后期,尽管酶活力呈下降趋势,酶活比仍然呈上升趋势,产酶第五天,
酶活比值提高到727.6,原因是C MC 酶酶活力比木聚糖酶酶活力对pH 值升高更为敏感[6]。虽然产酶
第五天酶活比相对较高,但木聚糖酶酶产率和酶得率远低于产酶第三天,因此从降低木聚糖酶制备成本的角度出发,分批培养制备低纤维素酶酶活木聚糖酶培养时间以3d 为宜。
2.2 底物浓度对木聚糖酶合成的影响
不同浓度木聚糖对里氏木霉合成低纤维素酶酶活力的木聚糖酶的影响作用如图1
。
图1 不同木聚糖浓度下低纤维素酶酶活力的木聚糖酶的合成F ig .1 A cti v ity o f ce llulase poor xy lanase at d if feren t concentra ti ons of xy lan 里氏木霉以质量浓度5~25g /L 木聚糖为碳源分批培养
合成木聚糖酶,木聚糖酶酶活力和C M C 酶酶活力的比值均在
300以上,符合生物漂白对低纤维素酶酶活力的木聚糖酶的
要求。由图1可知,当碳源木聚糖质量浓度低于15g /L 时,
木聚糖酶酶活力和酶产率随着木聚糖浓度的增加而增加,同
时随着木聚糖浓度的提高,酶活力和酶产率增加的幅度逐渐
变小。当木聚糖质量浓度由5g /L 提高到10g /L 时,酶活力
从82.73I U /mL 显著提高到138.55I U /mL ,酶产率由
1149.0I U /(L h)提高到1924.3I U /(L h)。进一步提高底
物质量浓度到15g /L,酶活力和酶产率有所提高,但提高的幅
度不大,分别达152.09I U /mL 和2112.4I U /(L h)。但继续提高底物浓度,酶活力和酶产率反而呈下降趋势。其原因可
能是:在分批培养产酶过程中当培养基中的不溶性木聚糖浓
度很高时,体系的传质和传氧能力下降,同时高浓度的底物对菌体的生产也产生抑制作用,从而导致高底物浓度低酶活力和低酶产率的现象。
除了酶活力和酶产率,考察酶合成过程是否经济可行的另一个重要指标是酶得率。由图1可知,木聚糖酶得率随着底物浓度的提高而降低,当底物木聚糖质量浓度从5g /L 提高到25g /L 时,酶得率从16546.0I U 降到4212.8I U 。造成这种现象的原因是在低底物浓度下,菌体培养环境较好,对木聚糖利用完全,随着培养基中底物浓度的增加,一方面影响体系的传质和传氧,另一方面高浓度底物对菌体产生抑制作用,从而使菌体对木聚糖的利用效率下降。尽管低底物浓度下木聚糖酶得率最高,但由于酶活力和酶产率较低,因此不是最经济的。综合酶产率和酶得率指标,分批培养合成木聚糖酶,底物木聚糖质量浓度以10~15g /L 为宜。
第4期勇强,等:分批和分批补料培养合成低纤维素酶酶活力的木聚糖酶9
2.3 分批补料培养合成低纤维素酶酶活力的木聚糖酶
降低木聚糖酶制备成本的措施之一是设法提高木聚糖酶的酶产率和酶得率。通过提高产酶底物浓度,采用分批添加底物的手段以消除高底物浓度造成的传质、传氧障碍和对菌体的抑制作用,可以达到提高酶产率和酶得率的目的[7]
。产酶底物质量浓度为17g /L,底物分3批分别在培养0、1、2d 加入5、6、6g /L 木聚糖,培养过程中各参数随时间的变化规律见表2。
表2 分批补料培养模式下低纤维素酶酶活的木聚糖酶的合成
T able 2 C ell ulase poor xy lanase produc ti on in fed batch fer m entati on
时间/d
ti m e
木聚糖酶酶活力/(I U mL -1)xylanas e acti v i ty 木聚糖酶酶产率/(I U L -1 h -1)xylanase p roductivit y 木聚糖酶酶得率/I U xylanase y i eld 1
61.902579.212380.02
153.163190.813923.63252.143501.914831.8由表2知,在木聚糖酶合成过程中,将底物木聚糖分批加入培养液,给菌体提供一个良好的生长和产物合成的环境,取得了较好的结果。当底物总木聚糖质量浓度为17g /L,分批补料模式下木聚糖酶酶活力和酶产率分别为252.14I U /m L 和3501.9I U /(L h),远高于分批培养模式下木聚糖酶酶活力和酶产率(最高值分别为152.09I U /mL 和2112.4I U /(L h)),同时酶活力随着底物浓度的提高成比例地提高,而酶产率没有降低且有所提高。从图1可知,分批培养下木聚糖酶的合成,酶得率随着底物浓度的提高呈较大幅度的下降趋势,从图1的变化趋势看,当底物质量浓度为17g /L 的木聚糖分批培养时,酶得率应低于10139.0I U 。而由表2可知,在相同底物浓度下采取分批补料模式,酶得率达14831.8I U ,比分批培养模式提高了近1/3。因此,与分批培养合成木聚糖酶相比,分批补料模式合成木聚糖酶具有很大的优越性,
而且这种优越性在高浓度底物下更加突出。
图2 有效氯用量对低纤维素酶酶活力的
木聚糖酶预处理浆漂白的影响F ig .2 E ffec ts of active ch l or i ne dosage on bleach i ng o f cell ulase poor xy lanase trea ted pu l p
2.4 低纤维素酶酶活力的木聚糖酶的纸浆漂白预处理
麦草浆在浆浓5%、p H 值5.6、45 下木聚糖酶用量5I U
(以每克纸浆计)预处理60m i n ,然后采用次氯酸盐一段漂工艺进
行漂白,不同有效氯用量下的漂白结果如图2。
由图2可以看出,在相同的有效氯用量下,经过酶处理的漂
白浆白度均高于未经过酶处理的对照浆,纸浆经木聚糖酶预处理
后,与对照浆相比,可以使纸浆白度提高2%~5%,SBD 。以有
效氯用量7%为例,在7%有效氯用量下未经过酶处理的对照
浆白度是62.7%,SBD ,而酶处理浆白度提高到65.9%,SBD,比
对照浆提高了3.2个百分点。在化学漂白过程中,在较低氯用量下,纸浆白度随着氯用量的增加而提高,但在较高氯用量下,提高
氯用量对纸浆白度提高不大。当有效氯用量达到7%~8%时,通过提高氯用量来提高纸浆白度的方法已不可行。因此采用木
聚糖酶预漂白技术可以进一步提高纸浆白度,为生产高档纸制品打下了基础。
由图2可知,在7%有效氯用量下纸浆白度为62.7%,SBD,采用木聚糖酶预处理后,只需4%就可以达到白度的要求,可以降低有效氯用量43%,从而大大降低了漂白的污染负荷。
3 结论
3.1 分批培养合成木聚糖酶,低底物浓度下木聚糖酶酶活力、酶产率随浓度的增加而提高,高底物浓度下则相反。分批培养合成木聚糖酶的最适底物质量浓度为15g /L ,培养3d 木聚糖酶酶活力为152.09I U /m L 、酶产率为2112.4I U /(L h)、酶得率为10139.3I U (以每克木聚糖计)和酶活比值为
10
林 产 化 学 与 工 业第25卷310.4。
3.2 分批补料合成木聚糖酶,可以消除高底物浓度造成的传质、传氧障碍和底物对菌体的抑制作用,有利于木聚糖酶的合成。以17g/L的木聚糖为底物合成木聚糖酶,采用3次补料,培养3d木聚糖酶酶活力为252.14I U/mL、酶产率为3501.9I U/(L h)和酶得率为14831.8I U,产酶效果远优于分批培养合成木聚糖酶。
3.3 在相同有效氯用量下的纸浆漂白,经低纤维素酶酶活力的木聚糖酶预处理后的纸浆白度比对照浆提高2%~5%,SBD;在达到相同白度条件下,经木聚糖酶预处理的纸浆后续漂白有效氯用量可降低43%。
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大型精密仪器 准确分析结果
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室仪器分析中心拥有如下大型精密仪器及装置,可对林
化产品及其它化工产品的结构、性质进行定性、定量
分析。
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美国A g il ent气相色谱-质谱联用仪
美国P-E公司AA300原子吸收光谱仪
英国M alvern公司M aste rsize r2000激光粒度仪
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2萃取装置
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挂靠在中国林业科学研究院林产化学工业研究所的
国家林业局林化产品质量监督检验站,是国家林业局授
权的法定检验机构,具有第三方公正地位。可对如下产
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