第33卷第2期2014年 4月 大豆科学SOYBEAN SCIENCE Vol．33No．2Apr． 2014 大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选 刘庆莉1，王金生1，刘丽君1，林蔚刚1，王红蕾2，张俐俐3，吴俊江 1 （1．黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院信息中心，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086） 摘要：为筛选出适宜根瘤菌吸附且能促进大豆生长、提高产量的优质载体，并且在优质载体的条件下，筛选出大豆 根瘤菌液的最佳使用浓度，通过3种载体吸附不同浓度根瘤菌液拌种大豆盆栽播种后，对大豆的生物量、结瘤及产量的对比发现：不同载体介入、大豆接入根瘤菌后均对大豆的生物量及结瘤产生一定的促进作用。根瘤菌以草炭和蛭石为载体，更有利于促使大豆植株生长，积累更多的干物质；草炭的促进结瘤作用持续效果时间较长，液体的持续效果时间最短，而蛭石的持续效果时间相对比较居中；以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥其提高产量的作用，以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥其提高产量的作用。结合生产成本来看， 草炭土更适宜作为自主研发根瘤菌剂的载体，同时推荐根瘤菌使用浓度为1．4?108 菌细胞 ·mL －1。关键词：大豆根瘤菌；结瘤；载体 中图分类号：S565．1文献标识码：A 文章编号：1000- 9841（2014）02-0207-04收稿日期：2013-10-11基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD14B06）；现代农业产业技术体系（CAＲS-004）；黑龙江省自然科学基金（C201104）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2013ＲFXYJ043）。 第一作者简介：刘庆莉（1971-），女，技师，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：liuqingli1971@126．com 。通讯作者：吴俊江（1970-），男，博士， 研究员，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：nkywujj@163．com 。Chosen of Soybean Ｒhizobia Carrier and Screening of the Best Concentration LIU Qing-li 1，WANG Jin-sheng 1，LIU Li-jun 1，LIN Wei-gang 1，WANG Hong-lei 2，ZHANG Li-li 3，WU Jun-jiang 1 （1．Soybean Ｒesearch Institute ，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；2．Information Center of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；3．Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ） Abstract ：In order to screen the carrier that was more appropriate for the absorption of rhizobia ，improving yield and quality of inoculated soybean ，and screen the best soybean rhizobia bacterial concentration at levels of quality carrier ，three carriers ab-sorbed different soybean rhizobia bacterial concentration with seed dressing were performed according to the biomass ，nodular rate and yields of soybean plant by soil pot experiments．The results showed that different carriers and inoculating soybean rhi-zobia could improve the biomass and nodular rate of soybean plant．Peat and vermiculite were used as carriers of rhizobia could remarkably promote the growth of soybean plant and enhance dry matter accumulation ；thus the lasting effect of nodular was the longest ，followed by vermiculite and liquid．Low level bacterial concentration could remarkably increased soybean yield and quality with peat and vermiculite as carriers ，however the opposite when used liquid as carriers．In conclusion ，in view of the cost ，peat was more appropriate for soybean rhizobia ，and the best bacterial concentration was 1．4?108 cells ·mL －1．Key words ：Soybean rhizobia ；Nodulation ；Carrier 施用根瘤菌菌剂能促进大豆结瘤， 有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力，同时，由于根瘤菌剂耐污染能力强［1］ ，还可以减少因长期使用化肥对 环境的破坏 ［2-3］ ，对无公害大豆生产以及降低农民 投人， 保护环境等具有十分重要的作用［4-5］ 。因此 引起了人们的极大兴趣和广泛关注，已成为豆科植 物增产的主要研究方向。 近年来随着新技术特别是分子生物学技术的发展，各种高效菌种不断被选育或改造，制备菌剂的工艺、保藏菌剂的方法也不断完善和发展，配制成的菌剂的效果越来越好，在农业生产中得到了广泛利用。与此同时，诸如发酵水平低、保质期短和 技术不成熟、质量不过关等问题限制了根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用。其中，菌种质量的高低一直是影响其应用效果的一个突出问题；载体也是大豆根瘤菌肥料质量控制的一个关键因素 ［6］ 。作 为根瘤菌的载体很多， 如草炭、蛭石、珍珠岩、煤炭、草炭、膨润土和高岭土等。草炭、蛭石由于其营养与pH 适中，表面积比较大和吸附性好，有利于根瘤菌的存活及菌剂保存，是理想的载体 ［7-9］ 。另外，草 炭和蛭石等资源丰富，价格低廉，适合于在根瘤菌剂生产中应用推广，已成为当代根瘤菌类肥料的主要类型。 本文的研究目的是筛选出适宜根瘤菌吸附且接种大豆能促进大豆生长、提高产量的优质载体，
生物工程上游技术实验综合实验设计 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 生命科学学院 生工121 指导老师: 田长恩、周玉萍 摘要 本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实
验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词 筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳 引言 在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，摇菌培养观察菌株表达形态。 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。 三、使用仪器、材料 1、材料：实验九准备好的菌株。 2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、主要试剂：10×PCR buffer 、dNTP mixture 、前向引物(P1) 、反向引物r(P2) 、 rTaq 酶、灭菌蒸馏水、LB液体培养基： 四、实验步骤 1、转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌 落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。 2、菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的 底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。反应体系如下: DNA template buffer （用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹） 10×PCR buffer 6μL
自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究 引言 氮元素是农作物生长必不可少的一种元素，而它作为农肥的主要成分之一，能提高农作物产量，使作物在贫瘠的土壤上也能获得丰硕的成果。然而，工业固氮的成功使得人们忽略了原本更加天然的固氮方式-使用固氮菌。在全球人口呈现爆炸上升趋势的同时，人们需要。农业生产提供大量的粮食以满足温饱，这就导致工业固氮产业的蓬勃发展。但谁也没想到大量使用氮肥正威胁着人类赖以生存的地球环境：高浓度的氮氧化物是产生颗粒物和地面大气臭氧的重要原因。红潮等的多次出现，杀死数以万计的鱼类，都是由于许多农作土壤也呈氮肥饱和趋势，多余的活性氮肥都被排进湖海之中，最终导致富营养化。 为了达到科学而且环保的目的，只有利用固氮生物进行绿色氮肥的生产，这样不仅可以节省生产氮肥的成本而且还不会造成活性氮流失事实上，许多试验都证明在某些环境状态下，接种的固氮菌对植物田有很大的帮助作用，这是由于固氮菌能在常温常压条件下，通过其体内固氮酶的作用，把空气中的氮固定下来形成氨，进一步变成植物可利用的氨素，从而让土壤中固定的氮元素增加，本实验主要是对自生固氮菌的筛选以及其生物学特征的研究。 1.材料和方法 1.1无氮培养基（富集培养）配方： 葡萄糖10克磷酸二氢钾0.2克硫酸镁0.2克 硫酸钙0.2克氯化钠0.2克碳酸钙 5.0克 琼脂20克蒸馏水1000mL PH 6,5—7..0 瓦克斯曼77号培养基（分离培养） 葡萄糖10克磷酸二氢钾0.5克MgSO4.7H2O 0.2克 1%MnSO4.4H2O溶液2滴1%FeCl3溶液2滴 蒸馏水1000mL 琼脂20克PH 7.0—7.2 1.2自生固氮菌的生态分布 1.2.1土样采集：选定肥沃菜园土采集土样时，先铲去1-4厘米的部分，去5-10厘米深层土样，记录采集土样的时间地点和日期，带回实验室备用。 1.2.2土样备用：将采集的土样放入28摄氏度恒温箱中，不仅可以活化菌，而且还可以干燥土壤，便于土样播撒。 1.2.3自生固氮菌的分离：配制无氮培养基，并将其进行灭菌，冷却至适当温度，倒入灭过菌的培养基中，待凝后地面朝上备用（防止水汽污染）. 将恒温箱中的土样取出，将欲分离的土样均匀地撒在无菌的无氮培养基平板上，每块平板分别撒0.25克，共撒三块平板。在培养基上表明土样号，分离日期，将培养皿倒置。放入28—30摄氏度下培养4-7天。 1.2.4当土粒周围长出浑浊，半透明的胶状菌落时，对菌落特征进行观察，计数和编号。 1.3自生固氮菌的纯化： 1.3.1将融化的改良瓦克斯曼77号培养基倒入无菌平板中，凝固后将平板放入65~70摄氏度的烤箱中烘烤15~20min，以除去平板表面的水分。将土样或加富后的土粒样品用无菌水分别稀释至0.1，0.001，0.0001稀释度，并将各稀释度的菌落0.1mL加在平板上，用无菌刮铲涂匀后，放在28~30摄氏度恒温箱中培养7天，经过一周后长出的菌落既为好气性自生固氮菌。 1.3.2挑菌培养并保存
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
实验六克隆的筛选和快速鉴定 一、目的 掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。 二、原理 在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。 或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。 三、试剂与仪器 （一）试剂 1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml 20% SDS 10ml 250mmol/L EDTA 1.6ml 蔗糖27.2g 1.2%溴酚蓝 1.67ml 加ddH2O至200ml 2．10mg/ml 溴乙啶 3．TBE电泳缓冲液（5×） 4．Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 6．dNTP 7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 （二）仪器 1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip 4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机 7．紫外分析仪8．恒温水浴 四、操作步骤 （一）快速细胞破碎法测定 1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。 2 3．待转化的细菌菌落长到2mm时
根瘤菌与豆科植物及其应用 摘要：自贝叶林克1888年首次从豆科植物根瘤中分离获得根瘤菌以来，国内外的许多学者都为揭开这一大自然的奥秘进行着孜孜不倦的研究，成为生命科学最为活跃的领域之一。人们从生物学，生态学，生理生化，分类和遗传等方面对根瘤菌进行了广泛研究，在根瘤菌和根瘤的形态结构，固氮酶的结构和功能，固氮机理和作用调件，根瘤菌在细菌分类学中的地位直到固氮基因，结瘤基因，固氮生态等应用方面都有着较快发展，20世纪90年代共生固氮体系已进入分子水平，研究转入根瘤菌与宿主豆目植物植物的相互识别和信息传递以及根瘤菌群体感应等方面。 关键词：根瘤菌生物固氮根瘤菌应用 一．根瘤菌的生物学特征 根瘤菌：根瘤菌主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌属和慢生根瘤菌属；两属都属于根瘤菌目。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈和生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。 根瘤菌的形态特征：根瘤菌是短杆状细菌，因生活环境和发育阶段的不同，在形态上有显著变化.根瘤菌在固体培养基上和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛能运动，革兰氏染色阴性，无芽孢，培养较久
菌体粗大，染色不均。 生存习性：根瘤菌与植物的共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。 根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。 类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 二．根瘤菌与豆科植物 根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group
固氮菌筛选及鉴定 实验原理 农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。 目的要求 1．初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法。 2．初步学会制作临时涂片的方法。 材料用具 农田的表层土壤(土壤溶液的pH不低于6.5)。 无菌研钵，无菌玻璃棒，接种环，天平，存放有载玻片的酒精缸，盖玻片，显微镜，酒精灯，火柴，镊子，恒温箱，量筒，玻璃铅笔。 灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，结晶紫染液，无菌水。 方法步骤 一、接种 1．接种前，将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，放在37℃的恒温箱中一两天。随后，选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用。 2．取10g土壤，放在无菌研钵中，注入5mL无菌水，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用。 3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌。略微打开培养皿盖，将接种环放在培养基边缘处冷却。然后，用接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上，共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰，以免烧伤)。 4．接种后，轻轻地盖上培养皿盖，将培养皿放在实验桌上，并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期。 二、培养
将接过种的培养皿放入恒温箱内，在28～30℃的温度下培养3～4d。 三、观察 3～4d后，取出培养皿，仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液。黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，表明含有自生固氮菌。 四、镜检 1．制作临时涂片 (1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片，将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤，以便除去上面的酒精。将载玻片放在实验桌上，待载玻片冷却后，在载玻片的中央滴一滴无菌水。 (2)在火焰旁，按照接种的要求，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液，将黏液涂在载玻片上的水滴中，加1滴结晶紫染液，混合均匀，染色1min。 (3)另取一片载玻片作推片。将推片自液滴左侧向右侧移动，使液滴均匀地附着在两片之间。然后，将推片自右向左平稳地推移(两片之间呈30～45°夹角)，推出一层均匀的菌膜。 2．干燥 让临时涂片自然干燥(自生固氮菌的临时涂片不用加热固定，以免破坏荚膜)。 3．在显微镜下观察 依次通过低倍镜和高倍镜观察临时涂片，可以看到染成紫色的自生固氮菌。 结论 通过显微镜能够看到几种自生固氮菌？它们在形态上各有什么特点？将得出的结论写在《实验报告册》上。 讨论 1．为什么盛放无氮培养基的培养皿应当是灭过菌的？ 2．假如黏液中有三种自生固氮菌，你能不能想出一种办法，将这三种细菌分离开来？
固氮菌、解磷菌的分离筛选 一、目的要求: 1、掌握选择培养基的筛选原理。 2、掌握固氮菌、解磷菌的分离方法。 3、学习平板划线分离法。 二、实验原理： 选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理化学抗性而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。固氮菌可以利用空气中的氮作为氮源进行自身代谢，根据这一原理可以利用无氮培养基将固氮菌从混合菌中分离出来。解磷菌可以在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体培养基产生溶磷圈，根据这一特性可以分离出解磷菌。同样，可以根据解钾菌的生理特性选择合适的培养基将其分离出来。 在本实验中，分离固氮菌我们采用阿须贝氏（Ashby）培养基，分离解磷菌采用无机磷培养基。 选择培养基的配方如下 Ashby培养基： 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2 g 氯化钠(NaCl) 0.2 g 碳酸钙(CaCO3) 5.0 g 甘露醇(C6H14O6) 10.0 g 硫酸钙(CaSO4·2H2O) 0.1 g 琼脂 18.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 6.8～7.0 无机磷培养基： 葡萄糖 10.0 g (NH?)?SO? 0.5 g NaCl 0.3 g KCl 0.3 g MgSO??7H?O 0.3 g FeSO??7H?O 0.03 g MnSO?? 4H?O 0.03 g Ca?(PO?)? 10 g 琼脂 18 g 蒸馏水 1000 ml 三、实验材料: 1、试剂及样品：Ashby培养基、无机磷培养基、无菌水、土壤样品（自带）。 2、仪器及其它用具：培养皿、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、高压蒸汽灭菌锅、 生化培养箱、超净工作台、接种环、酒精灯、PH试纸等。
信息检索信息搜索、鉴别和筛选 一提到网络搜索，大家马上会想到谷歌和百度。当然，一遇到问题人们可能最先想到的就是这两大搜索引擎。但是呢，好的信息搜索并不只有这两个，每一种搜索引擎都有各自的利弊，选不对搜索引擎，就像选了不合脚的鞋一样，能走路，但艰辛痛苦，也跑不快走不远。使用搜索引擎首先要了解各种搜索引擎特点，否则你可能浪费大量时间。这次搜索，你应该使用百度还是Yahoo？Google还是百度？分析你的需求，选根据需求找拥有相应功能优势的搜索引擎。这里介绍一些： 1.方向着手 （1）从行业入手查找，比较好用的是“百度产品大全”（点击首页“更多”选项即可）：行业报告——各行业官方报告、评定、专家解读，行业与单个品牌市场综述、分析，行业与单个品牌数据、过往新闻。当然这个不乏广告成分，所以需要鉴别，当心受骗。 （2）寻找特定领域的人了解情况，寻找合适采访对象，如专家学者、老一辈，想熟悉某个领域或了解某个城市、历史、词条……这些比较细致的东西，可以用“百度百科”，网友们集体贡献的智慧是无穷的，而且网友的料也是无穷的，你往往能有意外收获。
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高效大豆根瘤菌的筛选 作者：张欣，李玉文转贴自：本站原创 (1．东北林业大学林学院；2．黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨150086) 摘要：将选取的10株大豆根瘤菌菌株(HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN10 05，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010)与在黑龙江省大面积栽培的5 个大豆品种（垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号）进行最佳共生匹配双瓶筛选试验，测定了大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标并进行统计分析，从中筛选出共生固氮结瘤能力强的优良菌株HLJN1001和HLJN 1003。 关键词：大豆根瘤菌；大豆品种；共生匹配；筛选 中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2011)10—0125—03 根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部，形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。但根瘤菌与豆科植物独立存在时，不能利用大气中的N2，而当根瘤菌侵入豆科植物的根细胞并在其中迅速增殖后，可产生类菌体，并在根瘤内出现豆血红蛋白，同时具备类菌体和豆血红蛋白的根瘤便具有固氮能力。研究表明，不同的根瘤菌与大豆品种间的共生固氮能力存在着较大的差异［1,2］ 。因此，筛选与豆科作物品种匹配、固氮能力好、竞争结瘤能力强的优良菌株，是提高根瘤菌应用效果的重要途径［3］。现选取10株大豆根瘤菌菌株，与5个在黑龙江省大面积栽培的大豆品种进行共生匹配性研究，从中筛选出优良菌株，为大豆育种材料的选择和共生固氮作用的发挥提供依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株 HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，
学号：K071041404 湖北民族学院科技学院 本科毕业论文 题目: 一株耐硒微生物的筛选与鉴定 姓名：黄益 班级：K071041404 专业：生物工程 指导教师：唐巧玉 中国·恩施 二零一四年五月
Stu.ID:K071041404 BACHELOR'S THESIS OF HUBEI UNIVERSITY FOR NATIONALITIES Screening and identification of selenium-resistant strain of microorganisms Professional: Biological Engineering Name：Huang Yi Academic Advisor：Tang Qiaoyu Enshi · China May , 2014
学术声明 1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2、本论文中除引文外，所有试验、数据和有关材料均是真实的。 3、本论文中除注明作者和来源的引文外，不包含其他人、其他机构已经发表或撰写过的研究成果。 4、其他同志对本研究所做的贡献已在论文中做了声明并表示了谢意。 5、本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 年月日 导师审核声明 本人郑重声明：该生所呈交的学位论文，是在本人的指导下独立进行研究工作所取得的成果。其中文字、图、表及其它相关内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。 导师签名： 年月日
一株耐硒微生物的筛选与鉴定 黄益 （湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施，445000） 摘要:本文以恩施富硒土壤中的微生物为研究对象。使用无菌磷酸盐缓冲液悬浮后再进行其他处理结合平板划线涂布培养分离出耐硒菌株23个。用硒浓度作为变量，利用控制变量法筛选出最耐硒菌株，进行革兰氏染色观察其颜色作初步鉴定，并对其进行生理生化鉴定，初步确定菌种类型。 通过上述初步鉴定实验得到的结论，参照《伯杰细菌鉴定手册》初步判断得到的最耐硒菌种为土壤杆菌属。 关键词：硒；微生物；筛选；鉴定；
自生固氮菌的分离鉴定 杨从发1，王淑军1，陈静1，许兴友2(1.淮海工学院食品工程系，江苏连云港，222005) (2.淮海工学院化学工程系，江苏连云港，222005) 淮海工学院学报，1999，8（2） 摘要：从非豆科作物根际土壤中分离筛选得到213个在无氮培养基上能良好生长的菌株，通过酶活测定，从中筛选得到18株固氮能力较强的菌株，并对其中酶活最高的4株菌株进行了鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。利用它们可望制成适合于不同农作物生长的生物复合肥。 关键词：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料 0引言 微生物肥料的一些作用和生态效益是化学肥料所不具备的[1]，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生长和抑制有害微生物的活动，从而达到增产的目的[2]。此外，生产微生物肥料投资少，可利用农副产品就地取材。因而，微生物肥料的生产吸引了许多研究者的兴趣。本文报道从水稻、小麦、玉米和蔬菜等非豆科作物根际土壤中分离得到18株固氮能力较高的自生固氮菌，并对其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株进行了分类鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。 1材料和方法 1.1菌种 采集水稻、小麦、玉米和蔬菜等农作物的根际土壤土样56个，从中分离获得213株在无氮培养基上能良好生长的菌株。 1.2分离培养基及分离方法 1.2.1富集培养基 蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙1g，质量分数为10%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各1mL，水1000mL，pH为6.5～7.0，在250mL三角瓶中，每瓶分装30mL，灭菌备用。 1.2.2富集培养方法 取3～5g土样用50mL水制成混浊液，吸取5mL悬浮液装入盛有30mL富集培养液的250mL三角瓶中，100rpm，28℃，培养3～5天后，换新鲜培养基继续培养，重复4～5次后，稀释分离。 1.2.3平板分离培养基 在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。 1.2.4分离方法 取富集培养后的培养液，稀释涂布平板分离培养基。28℃培养2天后，将在稀释度较大的平板上，生长较大的菌落移入斜面。培养后，保藏备用。 1.3固氮酶活性测定 1.3.1气相色谱法 参考文献[3]的方法，略加改变，将2mL乙炔气体冲入试管斜面内，塞上无菌橡皮塞，28℃，培养24h 后，用气相色谱仪测量固氮酶的活性，每种取4～5个重复，进样量100μL，按以下公式进行计算酶活。 EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t) (μmol/h(斜面)) Se：乙烯峰面积;T：开氏绝对温度(T=273.13K) Pe：实验条件下的大气压强(Pa); Sb：乙炔峰面积;Te：实验条件下的温度(K); P：绝对大气压强(P=101324.72Pa); t=培养时间(t=24h)
利用不同的方法筛选和鉴定转化子 摘要:通过使用不同的方法，从大肠杆菌中筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子，之后用菌落PCR对其中的重组子进行进一步鉴定，最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFP。实验结果表明挑选出来的菌株并没有表达出GFP，需要挑选其他菌落继续实验。 关键词:蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋白质检测 前言 我们采用的是目前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组，作为载体的质粒，我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒，前者有利于基因顺利导入到受体细胞，后者方便我们对转化产物进行筛选；对于受体细胞，我们所选择使用的大肠杆菌，具有遗传背景清楚，结构简单，表达效率高，容易获取等优点，已经建立起一套完善成熟的表达系统，是目前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统之一。 GFP自从发现以来，已经获得了广泛充足的应用，是生物领域的重要材料绿。绿色荧光蛋白本身无毒，且不需要其他辅酶或者反应底物，在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光，而且有较好的稳定性，当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时，该蛋白质既能保持原有活性，发光能力也不受影响，这意味着我们可以将GFP与我们想要了解的蛋白质相接合在一起，将GFP作为荧光标签，对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和观察，因为这种特性，绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点，已经在生物研究中获得广泛的应用。 我们已经通过一系列的实验操作，获取GFP基因，用PCR技术将其扩增并连接到载体质粒pMD19-T Vector上，用CaCl2法将其转入到大肠杆菌中，经过本次实验的筛选和鉴定，构成了完整的转基因操作流程，将我们的课堂学习和实际操作结合起来，从而对转基因技术有一个最直接的认识。尽管在当下中国，转基因技术备受争议，但是每一名生物专业的学生，都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就，并看到其广泛的应用前景和巨大的市场潜力，同时将所学习到的关于转基因知识科普出去，让每一个公民都能科学、正确地认识转基因，理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论中去，推进我国生物科学技术的发展。
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:
1.1实验总流程 1土壤取样：
2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基
肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。
（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与