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食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗
1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆
2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換
氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆
2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL
之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅
菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其
他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍
或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或
其他適用者。
2.2.18 旋渦混合器（Vortex mixer）。
2.2.19 顯微鏡〆能放大至1000倍以上之一般光學顯微鏡。
2.2.20 載玻片及蓋玻片〆適用於染色及鏡檢用。
2.2.21 研缽、杵。
2.2.22 藥勺、剪刀、小刀、鑷子〆可滅菌。
2.2.23 濾紙及褐色試藥瓶。
2.2.24 無菌濾膜〆孔徑0.45 μm或以下之親水性醋酸纖維膜。
2.2.25 杜蘭發酵管（Durham fermentation tube）〆外徑9 ×22 mm或其他適用者。
2.2.26 試藥〆氯化鈉、硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）、膽鹽No. 3（bile salts No. 3）、中性
紅（neutral red）、結晶紫（crystal violet）、檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate）、去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate）、硫代硫酸鈉（sodium thiosulfate）、草酸銨（ammonium oxalate）、碘化鉀、碘、沙黃O（safranin O）、對-二甲胺基苯甲醛（p-dimethyl aminobenzaldehyde）、四甲基對位苯二胺鹽酸鹽（N,N,N',N'-tetramethyl -ρ-phenylenediamine?2HCl）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）、硝基苯哌喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）、亮綠（brilliant green）、酚紅（phenol red）、溴甲酚紫（bromcresol purple）、溴麝香草藍（bromthymol blue）、肌酸（creatine）、甲基紅（methyl red）、α-萘酚（α-naphthol）、氫氧化鉀、95%乙醇、無水乙醇、戊醇（amyl alcohol）或異戊醇（isoamyl alcohol）、乳糖、蔗糖、半乳糖醇（dulcitol）、核糖醇（adonitol）、棉子糖（raffinose）、山梨醇（sorbitol）、阿拉伯糖醇（D-arabitol）、氰化鉀、氫氧化鈉、L-離胺酸（L-lysine）、L-鳥胺酸（L-ornithine）、L-精胺酸（L-arginine）、礦物油或液態石蠟油（paraffin oil）及鹽酸等均採用化學試藥級。
2.2.27 試劑〆
2.2.27.1 無菌蒸餾水〆
蒸餾水900 mL、90 mL、9 mL，分裝於增菌容器或試管中，以121℃滅菌15分鐘。
2.2.27.2 0.85%生理食鹽水〆
取氯化鈉8.5 g溶於1000 mL蒸餾水中，分裝於試管內，以121℃滅菌15分鐘。
2.2.27.3 柯瓦克氏試劑（Kovacs’ reagent）〆
取對-二甲胺基苯甲醛5 g溶於戊醇或異戊醇75 mL中，再徐徐加入鹽酸25 mL，混合均勻後應呈黃色並須保存於4℃冰箱中。
2.2.27.4 甲基紅指示劑（Methyl red indicator）〆
取甲基紅0.1 g溶於95%乙醇300 mL後，再加蒸餾水使成500 mL。
2.2.27.5 歐普氏試劑（Voges-Proskauer test reagents, VP reagents）〆
溶液A〆取α-萘酚5 g溶於無水乙醇100 mL中。
溶液B〆取氫氧化鉀40 g溶於蒸餾水中，並使成100 mL。
2.2.27.6 0.5%氰化鉀溶液（0.5% potassium cyanide solution）〆
取氰化鉀0.5 g溶於無菌蒸餾水100 mL中（氰化鉀為劇毒物質，本操作務必在抽氣櫃內進行）。
2.2.27.7 礦物油或液態石蠟油〆
取礦物油或液態石蠟油20～50 mL，裝入有蓋容器中約1/2滿，以121℃滅菌30分鐘。
2.2.27.8 革蘭氏染色液（Gram stain solution）〆
2.2.27.8.1 哈克氏（Hucker’s）結晶紫液（初染劑）〆
溶液A〆取結晶紫2 g溶於95%乙醇20 mL中。
溶液B〆取草酸銨0.8 g溶於蒸餾水80 mL中。
將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。
2.2.27.8.2 革蘭氏碘液（媒染劑）〆
取碘化鉀2 g及碘1 g置於研砵中，經研磨5～10秒鐘後，加蒸餾水1 mL研磨，次加蒸餾水5 mL研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研砵及杵後，併入洗液，加蒸餾水使成300 mL。
2.2.27.8.3 哈克氏複染液（複染劑）〆
取沙黃O 2.5 g溶於95%乙醇100 mL中，供作複染原液。使用時，取原液10 mL加蒸餾水
90 mL，作為複染液。
註〆革蘭氏染色液因放久可能失效，因此若購買成品時，要注意其保存期限，若自行配製者應檢查其染色效果。
2.2.27.9 氧化酶試劑（Oxidase reagent）〆
取四甲基對位苯二胺鹽酸鹽1 g溶於蒸餾水100 mL後，貯存於褐色瓶，並置入冰箱中，使用期限以不超過1星期為宜。
2.2.27.10 1 M磷酸二氫鈉溶液〆
取磷酸二氫鈉6.9 g溶於蒸餾水45 mL中，徐徐注入30%氫氧化鈉溶液約3 mL，調整pH值為7.0，續加入蒸餾水使成50 mL，貯存於4℃冰箱中備用。
2.2.27.11 硝基苯哌喃半乳糖試劑（ONPG reagent）〆
取硝基苯哌喃半乳糖80 mg溶於37℃蒸餾水15 mL中，再加入1 M磷酸二氫鈉溶液5 mL，即為0.0133 M硝基苯哌喃半乳糖試劑，貯存於4℃冰箱中，使用時須加溫至
37℃。
2.2.28 培養基〆
2.2.28.1 蛋白腖緩衝液（Buffered peptone water, BPW）
蛋白腖（peptone）10 g
氯化鈉（NaCl） 5 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4）3.5 g
磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.5 g
蒸餾水1000 mL
攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ±0.2。
2.2.28.2 加鹽硫酸月桂酸胰化蛋白培養液（Lauryl tryptose broth with 2% NaCl, 2% NaCl-LST）
胰化蛋白（tryptose）20 g
乳糖（lactose） 5 g
磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75 g
氯化鈉（NaCl）20 g
硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）0.1 g
蒸餾水1000 mL
加熱溶解後，分取10 mL注入裝有杜蘭發酵管之試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終
pH值為6.8 ±0.2。
2.2.28.3 紫紅膽鹽葡萄糖培養基（Violet red bile glucose agar, VRBG）
酵母抽出液（yeast extract） 3 g
蛋白腖（peptone）7 g
氯化鈉（NaCl） 5 g
膽鹽No. 3（bile salts No. 3） 1.5 g
乳糖（lactose）10 g
中性紅（neutral red）0.03 g
結晶紫（crystal violet）0.002 g
洋菜（agar）15 g
葡萄糖（glucose） 10 g
蒸餾水1000 mL
加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度。於45～50℃水浴中冷卻，最終pH值為7.4 ±
0.2。每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。配製後之培養基應放置於2
～8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。
2.2.28.4 阪崎腸桿菌培養基（Enterobacter sakazakii agar, ESA）
胰化蛋白腖（tryptone）15 g
大豆蛋白腖（soya peptone） 5.0 g
氯化鈉（NaCl） 5.0 g
檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate） 1.0 g
去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate） 1.0 g
硫代硫酸鈉（Na2S2O3〃5H2O） 1.0 g
5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷
（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）0.1 g
洋菜（agar）15 g
蒸餾水1000 mL
攪拌加熱溶解後，以121℃，滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ±0.2。冷卻至50℃，每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。
2.2.28.5 腸內細菌科增菌培養液（Enterobacteriaceae enrichment broth, EE broth）
蛋白腖（peptone）10 g
葡萄糖（glucose） 5 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4）8 g
磷酸二氫鉀（KH2PO4）2 g
牛膽鹽（ox-gall）20 g
亮綠（brilliant green）0.015 g
蒸餾水1000 mL
加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度，最終pH值為7.2 ±0.2。取90 mL注入約125 mL已滅菌之附蓋三角錐瓶或廣口瓶中，配置後之培養液應放置於2～8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。
2.2.28.6 胰化酪蛋白大豆培養基（Trypticase soy agar, TSA）
胰化酪蛋白腖（trypticase peptone）15.0 g
植物蛋白腖（phytone peptone） 5.0 g
氯化鈉（NaCl） 5.0 g
洋菜（agar）15 g
蒸餾水1000 mL
平板培養基配製方法〆攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ±
0.2。冷卻至50℃，每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用々斜面培養基配
製方法〆加熱溶解後，分取約5 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ±
0.2。滅菌後作成斜面培養基，斜面長度約4～5 cm，斜面底部之深度約2～3 cm。
2.2.28.7 尿素培養液（Urea broth）
尿素（urea）20 g
酵母抽出物（yeast extract）0.1 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4）9.1 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.5 g
酚紅（phenol red）0.01 g
蒸餾水1000 mL
溶解後，經孔徑0.45 μm濾膜過濾後，分取1.5～3 mL濾液，注入已滅菌之試管中，最終pH值為6.8 ±0.2。
2.2.28.8 運動性試驗培養基（Motility test medium）
牛肉抽出物（beef extract） 3 g
蛋白腖（peptone）10 g
氯化鈉（NaCl） 5 g
洋菜（agar）4 g
蒸餾水1000 mL
加熱溶解後，分取約8 mL注入附有螺旋蓋試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH 值為7.4 ±0.2。
2.2.28.9 氰化鉀培養液（Potassium cyanide broth）
聚蛋白腖（polypeptone） 3 g
氯化鈉（NaCl） 5 g
磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.225 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4）5.64 g
蒸餾水1000 mL
溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.6 ±0.2。冷卻後於抽氣櫃內以吸管輔助器配合無菌操作，加入0.5%氰化鉀溶液15 mL，混合均勻，分取1～1.5 mL注入已滅菌之試管中，貯存於冰箱備用，貯存期限不得超過兩週（操作氰化鉀溶液時，需戴手套且不可用口吸取）。
2.2.28.10胰化蛋白腖培養液（Tryptone broth）
胰化蛋白腖（tryptone）或胰化酪蛋白腖（trypticase）10 g
蒸餾水1000 mL
溶解後，分取約5 mL注入試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9 ±0.2。
2.2.28.11 MR-VP培養液（MR-VP broth）
蛋白腖緩衝液粉末（buffered peptone-water powder）7 g
葡萄糖（glucose） 5 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4） 5 g
蒸餾水1000 mL
溶解後，分取約10 mL注入試管中，以118～121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9 ±
0.2。
2.2.28.12 溴甲酚紫培養液（Bromcresol purple broth）
蛋白腖（peptone）10 g
牛肉抽出物（beef extract） 3 g
氯化鈉（NaCl） 5 g
溴甲酚紫（bromcresol purple）0.04 g
蒸餾水1000 mL
溶解後，分取約2.5 mL注入試管內，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.0 ±0.2。
冷卻後，每管加入經0.2 μm孔徑濾膜過濾除菌之50%（w/v）蔗糖溶液0.278 ±0.002 mL，
使培養液中該糖之最終濃度為5%（w/v）。含半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、山梨醇及阿
拉伯糖醇之溴甲酚紫培養液配製方法亦同。
2.2.28.13 脫羧酶基礎培養液（Decarboxylase basal medium）
蛋白腖（peptone）5 g
酵母抽出物（yeast extract） 3 g
葡萄糖（glucose） 1 g
溴甲酚紫（bromcresol purple）0.02 g
蒸餾水1000 mL
加熱攪拌溶解後，取L-離胺酸5 g溶解於上述之培養液中，混合均勻，分取適量注入試管內，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為6.5 ± 0.2，使成離胺酸脫羧酶培養液。含L-
精胺酸及L-鳥胺酸之脫羧酶培養液配製方法亦同。對照組之配製，除脫羧酶基礎培養液
外，不需添加任何物質。
2.2.28.14辛蒙斯檸檬酸鹽培養基（Simmons citrate agar）
氯化鈉（NaCl） 5 g
檸檬酸鈉（Na3C6H5O7） 2 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4）1 g
磷酸二氫銨（NH4H2PO4） 1 g
硫酸鎂（MgSO4） 0.2 g
溴麝香草藍（bromthymol blue）0.08 g
洋菜（agar）15 g
蒸餾水1000 mL
加熱溶解後，分取約5 mL注入試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8 ±0.2。
滅菌後作成斜面培養基，此斜面長度約4～5 cm，斜面底部深度約2～3 cm。
2.3 檢液之調製〆
2.3.1 奶粉檢體（包括嬰兒配方奶粉、特殊營養配方奶粉、幼童專用奶粉及成人奶粉）〆用振搖方
式，使充分均勻混合後，以已滅菌之藥勺或其他方便使用之用具，取100 g、10 g及1 g，分
別加入內含預熱至45℃之無菌蒸餾水900 mL、90 mL及9 mL之2 L、250 mL及125 mL三角
錐瓶中（三重複）。以上三角錐瓶得以其他耐濕熱滅菌之塑膠材質容器或玻璃試管替代，唯
檢液體積以不超過容器總容量二分之一為原則。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10
倍稀釋檢液，於35℃培養18～24小時，供作檢液。因檢液於增菌培養過程可能產氣，故不
可緊鎖螺旋瓶蓋（或試管蓋），宜維持鬆動但不脫落狀態。
2.3.2 液態食品檢體〆充分均勻混合後，取100 mL、10 mL及1 mL，分別加入內含900 mL、90 mL
及9 mL已滅菌之蛋白腖緩衝液。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，於
35℃培養18～24小時，供作檢液。
2.3.3 環境檢體或塗抹物檢體〆
2.3.3.1 環境檢體〆取1 g置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，於44℃培養18～24小
時，供作檢液。
2.3.3.2 塗抺物檢體〆將塗抹棒之頭部置於已滅菌試管內，以無菌操作折（剪）斷塗抹物木柄，
添加蛋白腖緩衝液5 mL後，將試管蓋旋緊，於10秒內來回叩擊手心使其劇烈振盪（振
盪幅度需達15公分）50次，或以旋渦混合器充分振盪至塗抹物頭部之棉絮鬆開。取溶出
液1 mL置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，於44℃培養18～24小時，供作檢
液。
或將塗抹棒之頭部置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，以無菌操作折（剪）斷塗抹物木柄，於44℃培養18～24小時，供作檢液。
2.4 鑑別試驗〆
2.4.1 選擇性增菌培養〆吸取2.3節之檢液10 mL，加入內盛有腸內細菌科增菌培養液90 mL之160
mL稀釋瓶中。混合均勻後於35℃培養18～24小時。
2.4.2 分離培養〆
2.4.2.1 方法一〆自2.4.1節之腸內細菌科增菌培養液中取一接種環量，在VRBG及ESA培養基表
面劃線後（二重複），於35℃培養18～24小時，觀察所形成菌落之形態。阪崎腸桿菌在
VRBG培養基上的典型菌落為外緣規則平整，呈淡粉紅色或紫紅色，外緣通常伴有紫紅
色之膽酸（bile acids）類物質沉殿環生成々阪崎腸桿菌在ESA培養基上的典型菌落為外
緣規則平整，呈綠色。自VRBG及ESA培養基上鉤取可疑菌落，劃線於TSA平板培養基，
於35℃培養18～24小時後，進行下列初步生化試驗。
2.4.2.2 方法二〆自2.4.1節之腸內細菌科增菌培養液中吸取1 mL量，加入內盛有生理食鹽水9 mL
之試管中，進行系列稀釋，使增菌培養液稀釋至原來的10-4～10-6倍。每一管（含未稀釋
之培養液）分別以無菌吸管吸取0.1 mL量，以曲玻棒均勻塗於VRBG及ESA培養基上，
於35℃培養18～24小時。自VRBG及ESA培養基上鉤取可疑菌落，劃線於TSA平板培
養基，於35℃培養18～24小時後，進行下列初步生化試驗。
2.4.3 混合菌株（Mixed culture）之純化〆將VRBG及ESA培養基上之未純化菌株，以四區劃法，
劃於VRBG或ESA培養基，於35℃培養18～24小時後，鉤取典型菌落，劃線於TSA平
板培養基，於35℃培養18～24小時後，進行下列初步生化試驗。
2.5 鑑定試驗〆
2.5.1 初步生化試驗〆
2.5.1.1 氧化酶試驗（Oxidase test）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，塗抹於含有氧化酶試劑之濾紙
表面。10～15秒後變為深紫色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為氧化酶負反應。
2.5.1.2 黃色色素產生試驗（Yellow pigment production test）〆以無菌接種針挑取TSA平板培養基
上可疑菌株至少5株，分別劃於TSA斜面培養基上，以25℃培養48～72小時，觀察菌株
產生色素之情形。有黃色色素產生者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。
2.5.1.3 尿素酶試驗（Urease test）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，接種於尿素培養液內，於35℃
培養24 ± 2小時。由於未接種之尿素培養液偶爾會轉變為紫紅色，故試驗時應包括未接
種之培養液作為對照用。培養液由橘紅色轉變為紫紅色者為正反應，顏色不變者為負反
應，阪崎腸桿菌為負反應。
2.5.1.4 運動性試驗（Motility test）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，穿刺接種於運動性試驗培養基
之表面中央點至深度0.5吋處。於35℃培養24小時後開始觀察直至48 ±2小時。當測試
菌沿穿刺線呈放射線狀生長者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。
2.5.1.5 革蘭氏染色（Gram stain）〆以無菌接種針挑取可疑菌株，劃於TSA斜面培養基上，於35
℃培養24 ±2小時，依下列步驟進行革蘭氏染色後鏡檢。
(１) 鉤取菌體，於載玻片上製成薄抹片，風乾或微熱固定。
(２) 初染〆將已固定之抹片，用哈克氏結晶紫液染1分鐘後水洗，水洗時間應不超過5秒鐘。
(３) 媒染〆加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。
(４) 脫色〆以95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再以水洗，此步驟需時甚短，僅數秒即可，惟視抹片之厚薄而定。
(５) 複染〆用哈克氏複染液複染30秒鐘，水洗。
(６) 自然風乾。
(７) 鏡檢〆呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏陰性菌。阪崎腸桿菌為革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢之桿狀菌。
經上述試驗，判定為可疑阪崎腸桿菌者，自TSA培養基鉤菌，進行下列生化試驗確認。
2.5.2 生化試驗〆
2.5.2.1 硝基苯哌喃半乳糖苷試驗（ONPG test）〆鉤菌並置於含有已滅菌之0.85%生理食鹽水0.2 mL
之試管中，作成濃懸浮液後，再加入一片浸過硝基苯哌喃半乳糖苷試劑之紙錠，並輕輕
搖動後，於35℃培養6～24小時，紙錠變成黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿
菌為正反應。
2.5.2.2 氰化鉀試驗（KCN test）〆鉤菌接種於氰化鉀培養液，以橡皮塞塞緊試管口，於35℃培養
24小時後開始觀察直至48 ±2小時。培養液由清澈變為混濁者為正反應，否則為負反應，
阪崎腸桿菌為正反應。
2.5.2.3 吲哚試驗（Indole test）〆鉤菌接種於胰化蛋白腖培養液中，於35℃培養48 ± 2小時後，
加入柯瓦克氏試劑0.2～0.3 mL，輕輕搖動後靜置約10分鐘，上層呈紅色者為正反應，否
則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為負反應。
2.5.2.4 歐普氏試驗（VP test）〆鉤菌接種於MR-VP培養液中，於35℃培養48 ±2小時後，取培
養液1 mL至另一已滅菌之試管中，加入歐普氏試劑溶液A約0.6 mL及歐普氏試劑溶液B
約0.2 mL後，再加入少許肌酸，振搖均勻，經2～4小時後觀察結果，呈現粉紅色至鮮紅
者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為正反應。
2.5.2.5 甲基紅試驗（Methyl red test）〆將2.5.2.4節剩餘之MR-VP培養液於35℃再培養48 ±2
小時後，取培養液5 mL至另一已滅菌試管中，加入甲基紅指示劑5～6滴，輕輕搖勻，
呈紅色者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為負反應。
2.5.2.6 檸檬酸鹽利用試驗（Citrate utilization test）〆鉤菌接種於辛蒙斯檸檬酸鹽斜面培養基，須
在斜面上作劃線及穿刺培養，於35℃培養96 ±2小時。斜面上有菌體生長且培養基顏色
由綠色變為藍色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。
2.5.2.7 精胺酸二水解酶試驗（Arginine dihydrolase test）〆鉤菌分別接種於精胺酸脫羧酶培養液及
脫羧酶基礎培養液中，接種後分別注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1～2
cm，需鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。精胺酸脫羧酶培養液呈紫色，且脫
羧酶基礎培養液呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為精胺酸二水解酶正反
應。
2.5.2.8 離胺酸脫羧酶試驗（Lysine decarboxylase test）〆鉤菌分別接種於離胺酸脫羧酶培養液及脫
羧酶基礎培養液中，接種後注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1～2 cm，需鬆
蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。離胺酸脫羧酶培養液呈紫色且脫羧酶基礎培
養基呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為負反應。
2.5.2.9 鳥胺酸脫羧酶試驗（Ornithine decarboxylase test）〆鉤菌分別接種於鳥胺酸脫羧酶培養液及
脫羧酶基礎培養液中，接種後注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1～2 cm，需
鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。鳥胺酸脫羧酶培養液呈紫色，且脫羧酶基
礎培養液呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。
2.5.2.10 發酵試驗（Fermentation test）〆鉤菌接種於分別含有蔗糖、半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、
山梨醇及阿拉伯糖醇等糖類之溴甲酚紫培養液中，於35℃培養2～5天，每隔24小時觀
察其發酵情形。培養液顏色由紫色轉變為黃色，產酸者為正反應。
2.6 判定〆阪崎腸桿菌陽性者，應符合表一及表二所列之結果。
表一、E. sakazakii、E. cloacae、E. aerogenes、E. agglomerans及E. gergoviae之生化反應(1)
(１) ＋表示所有菌株在1～2天內為正反應々[＋] 表示大部分（89%以上）在1～4天內為正反應々d表示依菌株而異（通常11～80 %為正反應）々－表示所有菌株培養7天後皆為負反
應々ND表示無可引用之資料。
表二、E. sakazakii、E. cloacae、E. aerogenes、E. agglomerans及E. gergoviae之發酵試驗(1)
(１) ＋表示90～100%為正反應々(＋) 表示75～89%為正反應々V 表示25～74%為正反應々(－) 表示10～24%為正反應々－表示0～9%為正反應。
2.7 最確數計算〆由2.6節判定為阪崎腸桿菌陽性者之各階瓶（管）數，利用接種量為每瓶（管）0.1,
0.01, 0.001（g或mL）之三階三瓶（管）最確數表（如附表），推算出阪崎腸桿菌之最確數（MPN/g
或MPN/mL）。
附表最確數表
說明〆
經腸內細菌科增菌培養液增菌培養，劃線至VRBG及ESA培養基，並挑選可疑菌落進行鑑定試驗，確認含有阪崎腸桿菌之試瓶（管）數若為3-3-2，對照MPN數為1100，則〆
(１) 若接種量為每瓶（管）含檢體0.1, 0.01, 0.001（g或mL），則該檢體阪崎腸桿菌之最確數為1100（MPN/g或MPN/mL）。
(２) 若接種量為每瓶（管）含檢體100, 10, 1（g或mL），則該檢體阪崎腸桿菌之最確數應為1100÷1000＝1.1（MPN/g或MPN/mL）。
2.8 可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或生化試驗鑑定系統，惟檢驗結果有爭議
時，應以傳統方法為準。
附件 食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗 1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。 2 檢驗方法〆 2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換 氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 2.2 器具及材料〆 2.2.1 乾熱滅菌器。 2.2.2 高壓滅菌釜。 2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。 2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。 2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。 2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL 之刻度。 2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。 2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅 菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。 2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其 他缺點。 2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍 或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。 2.2.11 pH測定儀。 2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。 2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。 2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
食品微生物检验技术课程文献综述 题目: 常见致病菌导致的食物中毒及其检测姓名: 木日西提江 学院: 新疆农业大学食品科学与药学学院专业: 食品科学 班级: 071班 学号: 074031156 指导教师: 王伟 2010年12 月7 日
常见致病菌导致的食物中毒及其检测 摘要:食品安全与食源性疾病已成为一个全球性的重大公共卫生问题，而食物中毒作为最典型的一大类食源性疾病更得到了世界各国政府的广泛关注与重视。凡是导致机体正常生理功能破坏，引发机体病理改变甚至死亡的物质被称为毒物。毒物随食物或毒物被当作食物进入人体引起的中毒被称为食物中毒。本文以常见致病菌导致的食物中毒为出发点，对常见食物中毒分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性三大类，叙述其中毒原理及常见症状，描述食物中毒的发病原理，发病症状，检验方法（包括快速检验）。并详细描述微生物的快速检测。 关键字致病菌沙门氏菌检验快速检验 正文 食物中毒是指吃了不洁或有毒食物而导致的疾病。通常在吃了有问题的食物1至72小时内发病，病情严重者可以致命。食物中毒一般分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性（包括细菌性和真菌性食物中毒）。 一、化学性食物中毒 化学性食物中毒是指误食有毒化学物质，如鼠药、农药、亚硝酸盐等，或食入被其污染的食物而引起的中毒。发病率和病死率均比较高。中毒症状急性中毒有心悸，面颈、四肢肌肉颤动，有手抖甚至不能站立，头晕，乏力，原有心律失常的患者更容易发生反应，心动过速，室性早搏，心电图示S-T段压低与T波倒置。其中常见的化学性食物中毒有： （一）毒鼠强中毒：毒鼠强毒性极大，对人致死量5—12毫克。一般在误食10－30分钟后出现中毒症状。轻度中毒表现头痛、头晕、乏力、恶心、呕吐、口唇麻木、酒醉感。重度中毒表现突然晕倒，癫痫样大发作，发作时全身抽搐、口吐白沫、小便失禁、意识丧失。 （二）亚硝酸盐中毒：俗称“工业用盐”。摄入亚硝酸盐0.2-0.5克就可以引起食物中毒，3克可导致死亡。发病急，中毒表现为口唇、舌尖、指尖青紫等缺氧症状，重者眼结膜、面部及全身皮肤青紫。自觉症状有头晕、头痛、无力、心率快等。急救处理：催吐、洗胃和导泻以消除毒物；应用氧化型亚甲蓝（美蓝）、
PITC/JJ01-WJ-0005/1-1 食品中阪崎肠杆菌原始记录 样品编号：样品名称： 样品状态：□定型包装□散装□液态□固态 收样日期：检验日期： 检验项目/方法：阪崎杆菌GB 4789.40-2010 仪器设备：恒温箱（36℃）PITC-411WJ-148 恒温箱（44.5℃）PITC-403WJ-140 恒温箱（30℃）PITC-221WJ-104 恒温箱（26℃）PITC-221WJ-104 ATB微生物鉴定仪PITC-171 步骤过程结果 前增菌 阳对：□NG □G 取检g/mL加入 900mL以预热44℃的缓 冲蛋白胨水增菌液中混 匀℃培养h 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G 样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 增菌 阳对：□NG □G 移取1mL处理液转种于 10mL mLST-Vm肉汤 ℃培养h 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G 样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 分离分别划线接种2个阪崎 显色平板 ℃培养h 阳对：□NG □G 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落特征按照产品 说明进行判定。 样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 挑取1~5个可疑菌落划线接种于TSA平板 ℃培养h 阳对：□NG □G 空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落为黄色菌落。样品-2：□NG □G 样品-3：□NG □G 样品-4：□NG □G 样品-5：□NG □G 生化鉴定 结果报告（每100g或每100 mL）样品-1样品-2样品-3样品-4样品-5 □ND □D□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D 注：G生长 NG不生长 D检出 ND 未检出 检验者：校核者：完成日期：
食品微生物检验技术复 习题 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
名词解释 样品（sample）是指从某一总体中抽出的一部分。 食品采样（sampling）是指从较大批量食品中抽取能较好地代表其总体样品的方法。 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。 V-P试验：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 生理生化试验：微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 硫化氢（H2S）试验：有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 增殖培养基: 在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。 外源性污染：食品在生产加工、运输、贮藏、销售食品过程中不遵守操作规程或不按卫生要求使食品发生污染称为外源性污染，也称为第二次污染． 环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。 微生物性食物中毒：食用被微生物或微生物毒素污染的食品而引起的中毒称为微生物性食物中毒。 无菌接种操作：培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具在无菌条件下接种含菌材料于培养基上，这过程叫做无菌接种操作。 菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。 细菌总数：指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。 大肠菌群：系指一群在37度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。 淀粉水解试验：某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 糖酵解试验：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。甲基红（Methyl Red）试验：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至以下，使甲基红指示剂变红。 靛基质（Imdole）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。尿素酶（Urease）试验：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。氧化酶（Oxidase）试验：氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验：试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。选择培养基:在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。鉴别培养基: 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。 无菌技术:指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。玻片凝集法：是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。试管凝集法：是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。 沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。大肠菌群MPN：大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。 大肠菌群值：大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。内源性污染：凡由动物体在生活过程中，由于本身带染的微生物而造成食品的污染者，称为内源性污染，也称第一次污染．食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程．
食品微生物检验的内容及检测技术 食品安全检验过程的主要内容 食品微生物的检验。食物在生产过程中以及放置过程中会受到环境中微生物的损坏或影响，在部分研究中，将食品中细菌数量对食品的损坏程度作为食品安全检测的首 要内容。在食品微生物的检验过程中，我们主要对人体有害微生物进行检验，其中在食品安全检验过程中，因为食品中有多种微生物共存现象，所以在检验前，微生物检验员要把不同的菌体进行分离，这样才能更加清楚的了解各种微生物的数量及菌体的分布情况，包括生产型食品微生物，如醋酸杆菌，酵母菌等和使食物变质的微生物，如霉菌、细菌等和食源性病原微生物如溶血性大肠杆菌，肉毒杆菌等。对食品原辅料微生物的控制和产成品微生物的检验是保证食品安 全的重要途径。 针对食品致病菌的相关检验。不同的致病菌会对人们的身体健康有不同程度的危害，像我们在生活中经常吃到的大米，有些不法商家将发霉的大米加工后再次放入市场进行二次销售，虽然经加工后，在外表上和普通大米没啥两样，但这种大米中含有黄曲霉这一致病菌，据可靠信息表明，黄曲霉的危害性十分巨大，如果人们长时间吃这样的大米，出
现癌症的风险要比常人高出很多倍，由此可见，食品中致病菌的检验是保证我们能吃到放心食品十分关键的微生物检 测技术，所以我们在致病菌的检验上对不同种类的致病菌进行定量严格检验。如乳制品和肉制品的致病菌主要是黄曲霉菌和大肠杆菌，而蛋制品中则容易出现染沙门菌、大肠菌群、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，罐头食品容易出现肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌。 食品微生物检验中的主要特点 对食品检测要求相对较高。在食品微生物的一系列检验中，由于食品中涉及的微生物种类较多，因此加大了食品微生物检验的难度。国家标准或行业标准对不同食品中微生物的含量特别是致病菌的含量有明确的要求。在食品的运输过程中，食品致病菌以及其他微生物对相应的食品有一定的污染，随着微生物种类的增多，检测人员需要对食品受致病菌影响的程度、食品保质期以及其他相关的标准进行测量，难度会随着微生物种类的增多而复杂。所以在微生物检验上我们对每一阶段的食品安全检测都要重视，在各个微生物的测量上，相关的检测技术要求就有所提高。 食品微生物检验效率。随着食品市场的商品流通提高，人们对食品需求不断增加，而食品安全问题却在日益严重，为了保障人们在能够及时满足食品种类和数量要求的同时，进一步促进食品安全的保障措施落实，必须加强食品安
《食品微生物检验技术》期末考试卷 适用班级：考试方式：闭卷 班级学号姓名 一、名词解释： 1.细菌：是一类细胞细而短（细胞直径约0.5μm，长度约0.5～5μm）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。 2.菌落：固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落（colony）。 3.放线菌：是一类呈菌丝状生长、主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。 4.菌丝体：许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 5.生长因子：通常是指那些微生物生长所必需而且需要量很小的，但微生物自身不能合成的，必须在培养基中加入的有机营养物。 6.培养基：根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质称为培养基。 7.消毒：是指利用某些理化方法杀死物体表面或内部所有对人体或动植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。 8.菌株：又称品系（在病毒中则称毒株或株），表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。 9.诱变育种：是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，再从中筛选出少数符合育种目的的突变株。 10.干酪：是在乳中（也可用脱脂奶油或稀奶油）加入适量的乳酸菌发酵剂和凝乳酶，使蛋白质（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，将凝块压成块状而制成的产品。
11.食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程 12.发酵乳制品：是指良好的原料乳经过杀菌作用接种特定的微生物（主要是乳酸菌）进行发酵，产生具有特殊风味的食品，称为发酵乳制品。 13.栅栏技术：已知的防腐方法根据其防腐原理归结为高温处理，低温冷藏或冻结，降低水分活性，酸化，降低氧化还原值和添加防腐剂等几种，即可归结为少数几个因子。把这些起控制作用的因子，称作栅栏因子。栅栏因子共同防腐作用的内在统一，称作栅栏技术。 14.食物中毒：是指人体因食用了含有害微生物、微生物毒素或化学性有害物质的食物而出现的非传染性的中毒。 15.双歧因子：一种能促进双歧杆菌生长，不被人体吸收利用的天然或人工合成的物质。 二、填空题： 1.原核微生物中常见的类群有细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、螺旋体、衣原体、立克次体等。 2.肽聚糖是原核微生物细胞壁所特有的成分，是由N- 乙酰葡萄糖胺（NAG）、N- 乙酰胞壁酸（NAM）和短肽聚合而成的网状结构的大分子化合物。 3.放线菌的菌丝由于形态与功能不同分成三类：基内菌丝、气生菌丝、孢子丝。 4.在自然界中霉菌主要是形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖，无性孢子有孢子囊孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子和芽孢子。有性孢子常见的有卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子。 5.微生物生长所需的营养物质应该包含组成细胞的各种化学元素。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可分成碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类。 6.配制培养基的基本原则：根据不同微生物对营养的要求、根据营养物质的浓度及配比、适当的pH 、培养基中原料的选择。 7.高压蒸汽灭菌法一般采用0.1 MPa 的压力、121摄氏度处理20min。 8.目前根据发酵乳制品的生产过程、发酵剂的种类、产品的特征及其他特性的不同大致
食品微生物检验方法（FDA与ISO对比） 内容提要： ●菌落总数检测 ●大肠菌群及大肠杆菌检测 ●金黄色葡萄球菌检测 ●沙门氏菌检测 ●单核细胞增生李斯特氏菌检测 菌落总数测定——菌落总数的概念 ●菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。 菌落总数测定——卫生学意义 ●判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 ●及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。 ●通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 FDA BAM 菌落总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 ℃48 ±2h 菌落计数 FDA BAM 菌落计数方法 ●选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d ●所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。EAPC：estimated aerobic plate count ●所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。 ●所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml （g）为＞65*100* 1/d。 ●无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。 ●最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测 EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明 一、编制的目的和意义 阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazaii）是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，属条件性致病菌。自1961年，英国首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。因此，对阪崎肠杆菌活菌建立快速、特异、灵敏的检测标准对于该菌的早期发现及传播的有效控制至关重要。 目前阪崎肠杆菌的检测方法较多，主要有传统培养方法和分子生物学方法。我国目前采用传统的细菌学方法，检测时间需要一周左右，费时费力；分子生物学方法虽然快速，灵敏，但不能区分死菌与活菌，而死菌DNA的存在容易导致假阳性问题。本研究以阪崎肠杆菌16S rDNA保守序列为靶基因设计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分阪崎肠杆菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结
果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测阪崎肠杆菌的灵敏度在1.0×102 cfu/mL左右，从样品处理、预增菌、PCR扩增、凝胶电泳只需要48h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中阪崎肠杆菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。 二、任务来源及编制原则和依据 1、任务来源 根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发…2017?104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中阪崎肠杆菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210482）的起草、制定工作。 2、编制原则 符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。 3、编制依据 主要依据以下标准：GB 4789.40-2016 食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验；GB 19489 实验室生物安全通
食品微生物之檢驗方法－肉毒桿菌之檢驗 101年5月16日署授食字第1011901882號公告第一部份：肉毒桿菌及其毒素之檢驗 1. 適用範圍：本方法適用於食品中肉毒桿菌及其毒素之檢驗。 2. 實驗室生物安全措施： 2.1. 生物危害標幟應懸掛於實驗室入口處，並管制人員進入，以及將該實驗區之人數維持至最低需求。 2.2. 備有治療用肉毒桿菌抗毒素之醫療院所緊急連絡電話號碼應張貼在明顯處。 2.3. 實驗操作應在生物安全操作櫃進行。 2.4. 應有洗眼用噴水器及腳踏或自動式洗手設備。 2.5. 絕不可以用口吸取任何檢體，應以機械式吸管輔助器操作。 2.6. 工作前、後應以1%次氯酸溶液擦拭工作檯。 2.7. 實驗後，工作人員應將所使用過之器材及廢棄物，立即滅菌處理。 3. 檢驗方法：檢體經前處理後，經增菌，續以選擇性培養基培養，配合肉毒桿菌毒素檢測與型別鑑定之方法。 3.1. 工作環境：工作平檯須寬敞、潔淨、光線良好，操作平檯光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵 及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 3.2. 器具及材料： 3.2.1. 生物安全操作櫃（Biological safety cabinet, BSC）：第二等級（class II）（含）以上者。 3.2.2. 高壓滅菌釜。 3.2.3. 乾熱滅菌器。 3.2. 4. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。 3.2.5. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1℃以內者。 3.2.6. 天平：可稱量到2000 g 者，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g 者，靈敏度為5 mg。 3.2.7. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 3.2.8. 加熱板（Hot plate）。
一、定义 通过一定的实验方法测定食品中的微生物，特别是致病微生物的数量、种类、性质，从而判断食品的卫生质量，保证消费者的身体健康。 二、食品微生物检验的内容 卫生指标菌检验 菌落总数测定 细菌检验 大肠菌群数测定 致病菌检验 霉菌、酵母菌数测定 真菌检验 产毒霉菌检验 霉菌毒素测定 三、食品微生物检验的特点 1、具有法规性 2、检验的范围广 3、杂菌含量多，要检验的菌少。 （1）需要增菌（2）抑制杂菌 4、检验结果具有数量界限 5、需要采样后尽快检验，快出结果 四、意义： 检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成经济损失。 五、食品卫生细菌常规检验项目 卫生指标菌 菌落总数测定 大肠菌群测定 沙门氏菌检验 u 致病菌 志贺氏菌检验 金黄色葡萄球菌检验 溶血性链球菌检验 六、细菌污染食品的途径 1、食品加工原料的污染 2、产、储、运、销过程中的细菌污染 3、从业人员的污染 4、食品加工过程中的污染 第一章 食品微生物检验中的生理生化实验 设计生化实验的原则：在实验中加入某些化学物质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入<的化学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。 一、过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理 1、2H 2O 2 过氧化氢酶 2H 2O+O 2 阳性 2、过氧化物酶： RH 2+H 2O 2 过氧化物酶 R+2H 2O 阳性：细菌变为黑褐色； 阴性： 不变色。 阳性 阴性 二、细胞色素氧化酶实验原理 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。 三、氰化钾实验 阳性： 不抑菌，变混浊 阴性：抑菌 无 蓝 四、硝酸盐还原实验原理 KNO 3 还原酶 KNO 2KNO 2 +对氨基苯磺酸+ a -萘胺 红色化合物（立刻或数分钟内）红色 无色 五、糖发酵实验 分解糖产酸，PH 值下降，使 培养基的 酸碱指示剂发生变化。 阳性：产酸产气 六、氧化发酵实验（O/F 实验 有些微生物分解葡萄糖 必须有氧参加，此种细菌菌称为氧化型； 阳 阴 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。 灭菌琼脂（厌氧） 七、甲基红实验（MR 实验）和V-P 实验 1、MR 实验原理：一些细菌分解葡萄糖产 生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH 值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应 2、V-P 实验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（实验结果同MR 实验） 阴 八 、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验） 一些微生物可以以铵盐作为唯一 的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳 源，在柠檬酸盐培养基上生长，分 解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基 变成碱性，酸碱指示剂变色 九、丙二酸钠实验 一些微生物可以以丙二酸钠 作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 十、马尿酸盐实验 一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。 十一、明胶液化实验 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。 十二、苯丙氨酸脱氨酶实验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶， 可以脱氨 生成苯丙酮酸， 其与FeCl 3反应产生绿色 。 十三、氨基酸脱羧酶实验 一些细菌可以产生氨基酸 脱羧酶使氨基酸脱酸，产生胺类物质，使培养基
习题库 项目一食品中的微生物及其检验 一、名词解释 1、微生物： 2、食品微生物检验： 3、食品变质： 4、腐败： 5、酸败： 6、菌落总数： 7、大肠菌群： 8、MPN： 二、填空题 1、食品中的微生物的主要来源是、和。 2、引起食品腐败变质的原因主要有、、和 等方面，其中，最普遍、最主要的因素是。 3、分解蛋白质的微生物以为主，其次是和。 4、分解糖类的微生物以为主，其次是和。 5、分解脂肪的微生物以为主，其次是和。 6、国家食品卫生标准一般包括三个方面的内容：、 和。 7、微生物指标一般分为、和三项。 8、食品微生物检验包括和两个方面。 三、选择题 1、下列描述的微生物特征中，不是所有微生物共同特征的是（） A.个体微小 B.分布广泛 C.种类繁多 D.可无致病性 E.只能在活细胞内生长繁殖 2、土壤中，数量和种类最多的微生物是（）
A、细菌 B、霉菌 C、酵母菌 D、放线菌 3、我国城市饮用水卫生标准规定（） A、每1000ml水中大肠杆菌＜3个 B、每1000ml水中大肠杆菌＜30个 C、每100ml水中大肠杆菌＜3个 D、每100ml水中大肠杆菌＜30个 E、每500ml水中大肠杆菌＜3个 4、我国城市饮用水卫生标准规定（ E ） A、每ml水中细菌总数＜1000个 B、每ml水中细菌总数＜10个 C、每100ml水中细菌总数＜10个 D、每500ml水中细菌总数＜10个 E、每ml水中细菌总数＜100个 四、判断题 1、菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。（） 2、MPN是指可能产气的数量。（） 3、食品中病原微生物的检验，可以检验出少量的病原微生物（） 五、问答题 1、食品微生物检验的特点有哪些？ 2、食品微生物检验的任务是什么？ 3、食品微生物检验的内容主要包括哪些方面？每一个方面的检验项目是什么？ 4、食品质量的评价指标有哪些？并具体解释之。 5、食品微生物检验的意义是什么？ 6、食品中细菌总数检验的意义是什么？ 7、食品中大肠菌群检验的意义是什么？ 项目二食品微生物检验的基本条件与设备 一、名词解释 1、分辨力：
农产品质量检测专业及绿色食品生产与经营专业2015级《食品微生物检测技术》课 程期末考试卷（A卷） 是，观察真菌采取的制片方法是。 4．微生物生长需要的营养要素有、、、、生长因子和能源。 5．根据细菌的生长曲线，可将细菌的生长分为、、、四个时期，作为研究材料应取的细菌最合适。 6．一般培养基的制备主要程序可分为：称量、、调节pH、过滤、、加塞包扎、和无菌检查等步骤。 7．无菌室的熏蒸消毒，主要采用熏蒸消毒法，测定无菌室无菌程度一般采用法。
三、单项选择题（总分20分，每题1分，将答案写在下面） 1——5 ： 6——10： 11——15： 16——20： 1.紫外线的杀菌机理可能是（） A.紫外线的高热作用 B.紫外线的辐射作用 C.紫外线凝固细菌蛋白质 D.紫外线干扰细菌DNA复制与转录 2.革兰氏染色的关键操作步骤是（） A.结晶紫染色 B.碘液固定 C.酒精脱色 D.复染 ） C.用65％的酒精棉球擦容器口周围 D.用酒精灯烤容器口周围 9.某微生物在有氧和无氧时均可以生长并可以利用氧，它属于（）。 A.微好氧菌 B. 好氧菌 C. 厌氧菌 D. 兼性厌氧菌 10.一般培养基高压蒸汽灭菌的条件是：（） A.121℃/15-30min B.115℃/15-30min C.130℃/15-30min D.65℃/15-30min 11.采用湿热高压蒸汽灭菌，（）是影响灭菌质量的关键。
A.灭菌时间 B. 压力表的指针 C.视锅内装量 D. 排除冷空气 12.根据食品卫生要求，或对样品污染程度的估计，一般选择2—3个适宜稀释度做10倍递增稀释液，每个稀释度作( )平皿， A.4个 B.3个 C.2个 D.1个 13.依据GB/T 4789.2-2010，菌落数测定结果1:100（第一稀释度）菌落数分别为204,213； 1:1000（第二稀释度）菌落数分别为19,18。结果菌落总数报告为（）。 A.2.0×104 B.2.1×104 C.1.9×104 D.4.0×104 14.霉菌及酵母菌的培养温度是( )。 直径 20.在微生物检测中最常见的是细胞生物，其中最多的是（）。 A.病毒 B.真菌 C.霉菌 D.细菌 四、判断题（下列叙述中，对于正确的在括号里标“√”，错误的标“×”每小题1分，总分10分，共10题。将答案写在下面:） 1——5： 6——10： 1.进行微生物检验采集的食品样品，在送检过程中应越快越好，一般不应超过24h。（） 2.病原微生物分离鉴定工作可以在普通微生物检测实验室中进行。（）
食品微生物检测方法 范围 本标准规定了食品微生物检测方法 1 菌落总数 1.1 培养基和试剂 ⑴、营养琼脂培养基：按GB/T4789.28-2003中4.7规定 成分: 蛋白胨10克、牛肉膏3克、氯化钠5克、琼脂15～20克、蒸馏水1000ml 制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入琼脂,加热煮沸,使用权琼脂溶化.分装烧讧,121℃高压灭菌15分钟. 注:此培养基可供一般细菌培养之用,注平板或制成斜面.如用于菌落计数,琼脂量为 1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%. ⑵磷酸盐缓冲液:按GB/T4789.28-2003中3.22规定. 成分：磷酸二氢钾34克、1mol/l氢氧化钠溶液175ml、蒸馏水825ml 、PH7.2 制法: 先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000 ml. 稀释液: 取储存液1.25 ml ,用蒸馏水稀释至1000 ml,或每管10ml,121℃高压灭菌15分钟. ⑶明胶磷酸盐缓冲液 成分:明胶2克、磷酸氢二钠4克、蒸馏水1000ml、PH6.2 制法:加热溶解,校正PH,121℃高压灭菌15分钟. ⑷0.85%灭菌生理盐水 ⑸75%乙醇 1.2 设备和材料 ⑴冰箱：0~4℃ ⑵恒温培养箱36℃±1℃ ⑶恒温水浴锅46±1℃ ⑷均质器或灭菌乳钵 ⑸架盘药物天平：0~500克，精确至0.5克. ⑹菌落计数器. ⑺大镜4× ⑻灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)
⑼灭菌锥形瓶:500ml ⑽灭菌玻璃珠:直径约5mm ⑾灭菌培养皿直径约90mm ⑿灭菌试管16mm×160mm ⒀灭菌刀、剪子、镊子等。 1.3 检验程序（菌落总数的检验程序见图1） 1.4 操作步骤 ⑴检样稀释及培养 a. 以无菌操作将检样25克(ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min～10000r/min的速度处理1min,做成1：10的均匀稀释液。 b. 用1ml的灭菌吸管吸取1：10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。
LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究 目的：研究LAMP法和PCR法在阪崎肠杆菌快速检测中的差异，指导临床在阪崎肠杆菌快速检测中方法的选择。方法：针对阪崎肠杆菌的OmpA基因，设计相关特异性引物，分别建立LAMP法和PCR法两种检测方法体系对其进行检测，并对两种检测方法的灵敏度进行记录比较；分别采用两种方法对45株阪崎肠杆菌近源菌进行检测，分析比较两种方法的特异性；最后采用两种方法对60份商场奶粉样品进行检测，将检测结果与FDA检测结果进行比较分析。结果：两种检测方法的灵敏度检测结果显示：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度（101 cfu/ml）明显高于PCR法（102 cfu/ml），两者比较差异有统计学意义（P ＜0.05）；在对45株阪崎肠杆菌近源菌的检测中，显示LAMP法有5株阪崎肠杆菌出现阳性结果，而PCR法则显示非特异性条带，表明LAMP法检测的特异性明显优于PCR法。结论：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测有效可行、灵敏度高、特异性强，是临床进行阪崎肠杆菌快速检测的一种有效方法。 标签：LAMP；PCR；阪崎肠杆菌 阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。由其可引发婴儿各种疾病，致病机制可能与其侵入、诱导凋亡及肠毒素作用有关[1]。对于阪崎肠杆菌的检测，最新研究发现LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测，灵敏度高、特异性强[2]。笔者所在医院应用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的进行对比探究，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 菌株标本 所研究的菌株共60株，其中2株阪崎肠杆菌标准菌株是由广东省微生物研究所提供的ATCC51329和ATCC29544，8株阪崎肠杆菌野生菌株是采用FDA 传统手段从商场奶粉或果汁中提取出来的；其余在试验中用到的菌株均为本实验室自己保存。 1.2 仪器 细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Bst DNA Polymerase（美国NEB公司），betaine（美国Sigma公司），agarose（Promega），DK28D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），PCR仪：PTC-200型；美国Bio-rad公司，EPS301电泳仪（瑞典Amersham公司）。 1.3 方法 采用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌进行快速检测具体分为以下步骤。
食品微生物检验技术试题库 （期末考试 15×2＝30。黑体为重点，期末为 8 道小题。 ） 一、名称解释： 1.微生物：是对所有形体微小、单细胞或个体结构较为简单的多细胞，甚至无细胞结构的低 等生物的总称。 2.原核微生物：是指一大类没有核膜和核仁，仅含一个由裸露的 DNA 分子构成的原始核区 的单细胞生物。 3.细菌：是一类细胞细而短（细胞直径约 0.5μm，长度约 0.5～5μm）、结构简单、细胞壁 坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。 4.荚膜：是细菌的特殊结构，是某些细菌在新陈代谢过程中产生的覆盖在细胞壁外的一层疏 松透明的粘液状物质。 5.芽孢：某些细菌生长到一定阶段或在一定环境条件下，细胞的正常生长和分裂停止，细胞 内细胞质浓缩，逐步行成一个圆形、椭圆形或圆柱形的，对不良环境有较强抵抗力的特殊结 构，称为芽孢。 6.菌落：固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞 集团，这就是菌落（colony）。 7. 菌苔：将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果长成的各“菌落”相 互联接成一片，这就是菌苔（lawn）。 ： 是一类呈菌丝状生长、 主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。 8.放线菌 （actinomycetes） 9.酵母菌（yeast） ：是一通俗名称，是指以出芽繁殖为主的单细胞真菌。 10. 菌丝体：许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 ：是一类超显微的非细胞型微生物，每一种病毒只含有一种核酸（DNA 或 11.病毒（virus） RNA) ；它们只能在活细胞内营专性寄生，依靠其宿主的代谢系统进行增殖，它们在离体条 件下，能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。 12.微生物的营养：微生物从环境中吸收营养物质并加以利用的过程即称为微生物的营养 13.碳源 ：凡是可以被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的物质通称碳源。 14.生长因子：通常是指那些微生物生长所必需而且需要量很小的，但微生物自身不能合成 的，必须在培养基中加入的有机营养物。 15.自养微生物：以 CO2 为唯一的碳源，能够在完全无机的环境中生长。 16. 培养基： 根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积 累代谢产物的营养基质称为培养基。 17.微生物的生长曲线（growth curve） ：将少量单细胞微生物纯菌种接种到新鲜的液体培养 基中，在适宜条件下培养，以细胞数目的对数为纵坐标，时间为横坐标，可以画出一条有规 律的曲线，这就是微生物的生长曲线（growth curve）。
第三章大肠菌群测定 一、大肠菌群检验 (一)检验方法 (二)培养基 (三)检验时应注意事 二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。 一、大肠茵群检验 (一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验 1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。 2 检验方法： 2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。 2.2 器具及材料： 2.2.1 干热灭菌器。 2.2.2 高压灭菌釜。 2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。 2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。 2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。 2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。 2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。 2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。 2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。 2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。 2.2.11 pH测定仪。 2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。 2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。 2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。 2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。 2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。 2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。 2.2.18 旋涡混合器（Vortex mixer）。 2.2.19 显微镜：能放大至1000倍以上之一般光学显微镜。 2.2.20 载玻片及盖玻片：适用于染色及镜检用。 2.2.21 研钵、杵。 2.2.22 药勺、剪刀、小刀、镊子：可灭菌。 2.2.23 滤纸及褐色试药瓶。 2.2.24 无菌滤膜：孔径0.45 μm或以下之亲水性醋酸纤维膜。 2.2.25 杜兰发酵管（Durham fermentation tube）：外径9 × 22 mm或其它适用者。 2.2.26 试药：氯化钠、硫酸月桂酸钠（sodium lauryl sulfate）、胆盐No. 3（bile salts No. 3）、中性红（neutral red）、结晶紫（crystal violet）、柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate）、脱氧胆酸钠（sodium desoxycholate）、硫代硫酸钠（sodium thiosulfate）、草酸铵（ammonium