SD大鼠全脑缺血-再灌注损伤模型
一、实验目的：
1. 掌握SD大鼠全脑缺血-再灌注损伤模型的建立方法。
2. 掌握取SD大鼠海马匀浆、测蛋白，使用试剂盒测定SOD、MDA、
CAT的方法。
3. 讨论全脑缺血-再灌注损伤的机理。
二、实验原理：
脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤。
脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。脑缺血后短时间内ATP、CP、葡萄糖、糖原等均减少，乳酸明显增加。缺血期cAMP含量增加，而cGMP含量减少。缺血-再灌注后脑内cAMP进一步增加，cGMP进一步下降，这提示缺血-再灌注时脂质过氧化反应增强。脑是一个富含磷脂的器官，再灌注后cAMP升高可导致磷脂酶激活，使膜磷脂降解，游离脂肪-酸增多，最显著的是花生四烯酸及硬脂酸增多，自由基与游离脂肪酸作用使过氧化脂质生成增多。脑缺血时脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一定时间后再灌注，慢波持续并加重。缺血-再灌注损伤时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变也越严重。
三、实验材料
动物：SD大鼠（200g左右，雌雄不限）
药物：20%水合氯醛，Folin-酚试剂，SOD、MDA、CAT试剂盒。
器材：鼠板，注射器，电凝器，剪刀，绳子，匀浆机，分光光度计，恒温水浴箱，试管。
四、实验方法
1.取7只SD大鼠,称重，编号并记录。7只大鼠分别以20%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，在枕骨后切开皮肤，暴露第一颈椎两侧的翼小孔，用尖端直径为0.5mm的电凝器插入翼孔，烧灼双侧的椎动脉，造成永久性闭塞。
2.待大鼠适应24h后，在颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，各组大鼠均用动脉夹夹闭阻断， 15min后松开动脉夹恢复血流，进行再灌注，第1组再灌注0分钟；第2组再灌注15分钟；第3组再灌注30分钟；第4组再灌注45分钟；第5组再灌注60分钟；第6组再灌注90分钟。第7组为对照
组，处理同以上组，但不结扎双侧颈总动脉。缺血时保持其直肠温度在36.5-37.5℃之间。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。
3.再灌注后取SD大鼠海马，用匀浆机匀浆，再Lowry法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质浓度。具体操作如下：1.标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，编号，加入不同浓度梯度的牛血清蛋白液，分别加入蒸馏水，碱性硫酸铜试剂，10分钟后加入Folin-酚试剂，混匀，40℃，10分钟，500nm波长比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定：准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样加入以上试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。
4.按照试剂盒说明书的操作步骤，测定每一实验组的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化物氢酶（CAT）值。
具体操作如下：
（1）. 超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒：
试 剂测 定 管对 照 管
试剂一(ml) 1.0 1.0
样品(ml)a*
蒸馏水(ml)a*
试剂二(ml)0.10.1
试剂三(ml)0.10.1
试剂四(ml)0.10.1
用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟
显色剂(ml)22
混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。
注：a*代表样本取样量和双蒸水取样量；
计算SOD值：
(2). 丙二醛（MDA）试剂盒：
标准管标准空白管测定管测定空白管
**
10n mol/ml标准品(ml)a*
无水乙醇（ml）a*
测试样品（ml）a*a*
试剂一（ml）a*a*a*a*
混匀（摇动几下试管架）
试剂二（ml）3333
试剂三（ml）111
50%冰醋酸（ml）1
旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40分钟，取出后流水冷却，然后3500~4000转/分，离心10分钟，（3000转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀完全）。取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
注：a* 表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。
计算MDA值：
（3）.过氧化物氢酶（CAT）试剂盒
对照管测定管
试剂一（37℃预温）（ml） 1.0 1.0
试剂二（37℃预温）（ml）0.10.1
1%组织匀浆（ml）0.05
混匀，37℃准确反应1分钟（60秒）
试剂三（ml） 1.0 1.0
试剂四（ml）0.10.1
1%组织匀浆（ml）0.05
混匀，0.5cm光径，405nm水调零测各管吸光度。
计算CAT值：
5.统计作图，根据结果讨论全脑缺血再灌注的现象和发病机制。
注意事项：
1.模型制作的关键步骤是凝断双侧椎动脉，有些大鼠翼孔很小，电凝器根本插不进去，可以用牙科微型小磨钻，将翼孔扩大，直视下用电凝器凝断双侧椎动脉，用磨钻扩大翼孔也要注意，容易损伤椎动脉造成出
血。另外，电凝针插入翼孔的角度也要掌握好，向外下（约于大鼠脊柱正中线呈50度角）插入翼孔，不然容易损伤脊髓。
2.高血糖可加重脑损伤，增加梗塞面积1.4倍，所以做手术前大鼠禁食12h。还可以防止麻醉过程中呕吐物窒息呼吸道。另外在实验过程中需注意控制脑温，因为脑温每降低10℃，大脑代谢率可降低50％。一般控制在37℃±0.3℃。
附：
鉴定大鼠脑缺血模型标准如下：缺血前大鼠处于完全清醒状态，其生命体征正常。缺血后30-60秒内大鼠即失去知觉和活动能力，翻正反射消失，呈现角弓反张，同时痛觉消失，双侧瞳孔散大，对强光刺激闭睑反射消失,眼球颜色灰白（正常为鲜红色）。再灌注后眼球颜色立即恢复红色，瞳孔回缩。缺血15分钟需再灌注约1小时后才能恢复自主活动。假手术组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。
