无血清培养基的介绍
经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。
无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。
无血清培养基的基本配方
基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。
添加组分包括以下几大类物质：
(1)促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
(2)促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。
(3)酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。
(4)结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基
都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素：硒是最常见的。
使用方法
目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
●处于对数生长中期
●>90% 活细胞率
●适应时以较高的起始细胞接种
有两种方法使细胞适应无血清培养基:
1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
●以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
●当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
●以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
●当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml(接种后4到6天)，在100％SFM培养基
中传代培养。
●每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，
贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS 的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1(v∶v)的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。
无血清培养基的优点
●增加确定性
●性能更加一致
●容易进行纯化和下游加工
●细胞功能的精确评估
●增强生长和/或产量
●生理反应性的较好对照
●增强细胞内中介物的检测
无血清培养基种类：
①UltraCULTURETM培养剂
UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium)
简介：一种通用的无血清培养剂
适用范围：培养贴壁和悬浮哺乳动物细胞，疫苗生产中病毒颗粒的制备
②PC-1TM培养基
PC-1Complete Serum-free Medium 5
PC-1 Complete Serum-free Medium(powder plus supplement)
PC-1 Supplement (50)
简介：是一种低蛋白，无血清培养基。PC-1培养基旨在应用于各种研究和工业用途，使用限定成份配制的培养基确保在维持最低蛋白成分同时使细胞获得最佳的生长状态。
适用范围：培养原代细胞和贴壁依赖性细胞
③UltraMEM Reduced Serum培养基
UltraMEM Reduced Serum Medium
(Low-protein medium containing L-glutamine &ITES)
UltraMEM Reduced Serum Medium
(Protein-free basal medium without L-glutamine)
简介：用于支持多种贴壁信赖性细胞在低血清浓度下的正常生长的限定培养基。
适用范围：培养贴壁信赖性细胞
④UltraCHOTM培养基
UltraCHO Meidum(1*liquid with L-glutamine) 1L
UltraCHO Meidum(1*liquid without nucleosides) 500mL
UltraCHO Supplement(Non-sterile) 100ml
简介：培养基最适于培养转染和未转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞，表达重姐蛋白质。
适用范围：培养CHO细胞; 重组蛋白的合成。
⑤UltraMDCKTM培养基
UltraMDCK Meida
简介：是一种无血清限定培养剂，适于高/低平板密度培养MADIN-DABBY犬肾细胞（MDCK）
适用范围：培养供体外诊断（IVD）用的MDCK细胞
⑥Pro293TMCDM系统
PRO 293A-CDM
1PRO 293S-CDM
简介：用于293细胞（转化的人胚肾细胞）培养Pro293限定培养基系统是专为促进293细胞重组蛋白的合成和下游反应而开发的。这些配方不需要任何动物来源的成分即可支持高密度的培养
适用范围：293细胞重组蛋白和合成
⑦Insect-XPRESSTM培养基
Insect-XPRESS Medium
简介：采用一种无蛋白配方，适合培养来源于Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆虫细胞系。
适用范围：杆状病毒的增殖，重组蛋白的表达。
⑧HL-1TM完全无血清培养基
HL-1 Complete Serum-free Medium(powder) 10L
简介：HL-1TM完全无血清培养基是一种限定培养基，蛋白含量低于30ug/ml. HL-1TM 完全无血清培养基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。
适用范围：杂交瘤细胞和淋巴细胞来源的分化细胞的无血清培养。
⑨UltraDOMATM培养基
BUltraDOMA Medium 500ml
简介：适用于中空纤维反应器中进行中，鼠和嵌合杂交瘤细胞的培养及上述细胞的批量培养。适用范围：杂交瘤细胞的培养，单克隆抗体的制备。
⑩UltraDOMA-PFTM无蛋白培养基
UltraDOMA-P.F.Protein-free Medium
简介：一种不含蛋白的培养基，适于鼠，人和嵌合细胞来源的杂交瘤细胞系的培养。
适用范围：杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞的培养，单克隆抗体的制备。
11. X-VIVO培养基
X-VIVO 10
X-VIVO 10 with Gentamicin and Phenol Red
X-VIVO 10 w/o Gentamicin and Phenol Red
简介：为了有助于在无血清环境中制备淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)而设计的。
X-VIVO 15
X-VIVO 15 with Gentamicin and Phenol Red
X-VIVO 15 w/o Gentamicin or Phenol Red
简介：在组成上和X-VIVO 10相似，并且经过调整优化使之适合于无血清条件下肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周学及人类肿瘤中分离纯化的CD3+细胞的增殖。同时还用于维持人类单核细胞、巨噬细胞及细胞系、粒细胞和自然杀伤细胞（NK）的生长。X-VIVO 20
X-VIVO 20 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L
简介：经过改进和优化有助于单核细胞耗竭的高密度的外周淋巴细胞制备LAK细胞。
存储条件：2℃-8℃
三种培养的部分细胞类型应用如下：
人和鼠淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）；外周血淋巴细胞（PBL）；人和鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）；人T细胞；人和鼠巨噬细胞；人和鼠造血干细胞（克隆形成和增殖）；人体组织的冰冻保存。
X-VIVO 产品的其他应用包括：
PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰冻保存和移植；人单核细胞和巨噬细胞的培养；干细胞的培养；树突状细胞的培养。
无血清培养基精华贴汇总
（原则：整理有价值的帖子，并将部分精彩内容提取出来，相关话题深入讨论看原贴，连接给出的可能是提问，也可能是回答。）
1、无血清培养基的优缺点：
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1597419_0.html
优点：
（1）无血清培养基完全采用人工合成的化合物，因此成分确定，可以排除血清中未知成分的干扰，实验结果更为可靠。
（2）采用无血清培养基更容易发现一些在血清培养基中不容易发现的细胞因子。
（3）采用无血清培养基可提高生物制品的质量，纯度，方便产物的分离纯化，减少过敏源。
缺点：
（1）成本较高。
（2）针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。
2、无血清培养基介绍
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1532143_0.html
无血清培养基是设计用来在无血清条件下生长特殊类型的细胞或进行专门应用的培养基。无血清培养基的使用体现了一种重要的工具，它允许细胞培养在一套限定的条件下进行，尽可能免于干扰参数的影响。
优点：增加确定性，性能更加一致，容易进行纯化和下游加工，细胞功能的精确评估，增强生长和增加产量，生理反应性的较好对照，增强细胞内中介物的检测。
无血清培养基中没有添加血清，但可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。
无血清培养基的用途很广，如血液和骨髓细胞、杂交瘤细胞、昆虫细胞、293细胞、中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、神经细胞、哺乳动物细胞等均有相应的无血清培养基可供选择。
在使用无血清培养基时，有些细胞需要逐渐适应的过程，即先将原来的培养基与无血清培养基混合培养，渐渐地再转为完全的无血清培养。有些贴壁生长的细胞，复苏时可用少量的血清（如5%）先培养，因为血清可助细胞贴壁，然后再换为无血清培养基。
GIBCO公司有各种无血清培养基提供，我们使用过不少，效果不错。
3、https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1532382_0.html、
我的一些看法：
（1）无血清培养基一般用于细胞清洗，大部分细胞都不能用无血清培养基培养，否则细胞很难存活．（2）部分细胞在消化培养后先用含血清培养基培养，待细胞完全贴壁后可换无血清培养基，以消除血清成分对实验处理因素的干扰．
（3）在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞，因为基因工程主要对象是蛋白质．
（4）无血清培养基目前发展还属于初级阶段，还不能取代完全培养基的主要地位．
4 无血清培养基的主要成分
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1555260_0.html
无血清培养基由下面成分组成：
（1）基础培养液
很多人工合成的培养基使用的是HamF12 和DMEM培养液（1：1混合），补加15mM的HEPES ,1.2g/升NaHCO3,根据不同的细胞需求还补加其它成分.
（2）附加成分
a,细胞外基质,能帮助细胞附着
b,营养成分,能促进细胞增殖,如多种生长因子
c,蛋白酶抑制物
5无血清培养基主要商家的产品目录
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1621910_0.html
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1621928_0.html
6无血清培养基配制
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/400105_0.html
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=474213&sty=3&keywords=%CE%DE%D1%AA%C7%E5 %C5%E0%D1%F8%BB%F9
7、实验中什么情况应该用无血清培养基
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=3300423&sty=3&age=30&tpg=1&ppg=1#3300423 https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=3300869&sty=3&age=30&tpg=1&ppg=1#3300869
血清是体外培养用的最多的天然培养基，在动物细胞生长培养基中起多方面的作用，但是在血清中成分复杂，存在许多未知因素，有时会干扰实验结果，掩盖培养细胞的潜在的生理功能。例如，神经母细胞瘤系具有诸如轴突延伸，胞膜多极化，神经特异性酶活性等神经组织的特异性功能，而这些功能在无血清培养中要比在含血清培养中表达强。此外，在生理状况下，由于血－脑屏障的存在，神经组织并不直接暴露于血浆的大部分成分中。因此，培养液中的血清成分可能干扰神经细胞正常的功能活动。血清中还含有一定的细胞毒物质和抑制物质，对细胞有去极化作用，影响细胞的功能的正常表达。
无血清培养基是成分确定的培养液，可以排除含血清培养时血清中许多未知因素的干扰，使实验结果更为可靠。用无血清培养可能发现一些在有血清培养中不容易发现的因子，如细胞生长调节因子，激素等。
我是养的神经细胞，在这里只能就神经细胞说说，在细胞培养一周左右（视细胞生长状况而定），就可以换成低浓度血清的培养基，过渡一到两天，再换成无血清培养基。应用无血清培养基，能有效的抑制非神经元的增殖。
8、细胞培养正常对照组为什么要用无血清培养基
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=3422270&sty=3&age=30&tpg=1&ppg=1#3422270
（1）为血清培养基里面的血清成分比较复杂，对于分析药物本身的作用可能会有干扰，所以在分析结论的时候，不能得到令人信服的答案，如果用无血清培养基的话，那么就可以排除这种干扰，得到想要的结果。（2）在进行细胞原代培养时，加入5-溴脱氧核苷的目的主要是为了抑制其它细胞的增殖，比如在进行心肌细胞原代培养的时候，加入5-溴脱氧核苷可以抑制非心肌细胞的增殖。
9、为什么用无血清培养基后再加含血清培养基后细胞死亡?
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/81054_0.html
细胞撤除生长因子，会停止生长，时间过长，将导致凋亡。这是你的细胞在无血清培养基中的时间太长，此时细胞已启动了凋亡程序，所以虽然没有立即死亡，但也是无可救要。
10、请问无血清培养基中只有特定细胞会长吗？
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2992481&sty=3&keywords=%CE%DE%D1%AA%C7%E5 %C5%E0%D1%F8%BB%F9
由于血清成分非常复杂，对一些要求较高的基础研究的结果影响较大，同时血清中也含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响某些细胞功能的表达，因而现在出现了无血清培养基。现在已有商品化的无血清培养液供应。但现在尚无对所有细胞通用的无血清培养液，各种无血清培养液的针对性很强，因为各种细胞所需的成分不完全相同。
由于血清中含有许多细胞因子，有的能刺激干细胞分化，所以如果想保持干细胞的未分化状态，往往不添加血清。
11、STEMCELL公司的无血清培养基的资料
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/896405_0.html
12、在无血清培养基中加入NH4Cl的目的。
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2963356&sty=3&keywords=%CE%DE%D1%AA%C7%E5 %C5%E0%D1%F8%BB%F9
13、请问无血清培养基培养细胞，是否需要加入青链霉素?
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1949737_0.html
如果要加的话浓度要减半，因为血清可以结合一部分抗生素，减少对细胞的毒性，无血清培养基剂量就要减半，否则细胞受影响。
14、有关转染时无血清培养基对细胞状态的影响问题
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/738286_0.html
转染细胞本来对细胞就是一种强冲击，而且转染进的质粒要用细胞内的系统进行表达，这都是对细胞较强的冲击。加上转染试剂一般对离子，PH比较敏感，所以转染时使用无血清培养液，细胞缺乏了营养必需，
更不会长得好了。也就是说细胞转染时细胞长得不好是正常现象，只要有结果就不要担心。
15、无血清培养基需换多少时间可以取其中的分泌性蛋白
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1216322_0.html
（1）一般是无血清培养48小时提取《细胞培养》上如此介绍
（2）可以作一个time course.看看您要的分泌性蛋白在几天的表达最强
16、请问无血清培养基可以用含0.3％的BSA的培养基代替吗
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=3388208&sty=3&age=30&tpg=1&ppg=1#3388208
肯定不可以代替
17、食管癌细胞能用无血清培养基培养吗？
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/1696348_0.html
能! 可以用MCDB151培养基含转铁蛋白，氢化可的松，EGF，胰岛素，牛垂体提取物（Sigma公司）
18、无血清培养基中可以长出普通细胞的克隆吗？
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2786990&sty=3&age=30&tpg=1&ppg=1#2786990
完全可以。
19、无血清培养基与细胞因子
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/880229_0.html
对这个问题的本身概念的探讨，我觉得没有太大的意义。关键是对于不同的细胞实验模型，最终所采用的血清的最适浓度是需要摸索的。如果你是研究细胞因子之类的，理论上最好采用完全没有血清的培养基；但事实上好多时候，如果你完全不加血清，有些细胞很难生长，或者是根本不生长，所以我们就用最适浓度的血清含量（能使细胞生长的最小浓度）来代替“无血清培养液”，使得“血清”这一影响因素达到最小。
20、无血清培养CHO细胞的方法？
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/actions/archive/post/451690_0.html
培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。
无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。
21、无血清培养出现不明污染（黑焦虫？）
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2565652&sty=3&age=30&tpg=1&ppg=1#2565652
（1）我遇到过和你同样的问题，我分析你的观察结果有可能是这样的：
在有血清的情况下，细胞生长当然比无血清的时候旺盛，但并不代表小黑点没有生长，或数量减少了，而是大部分吸附在细胞表面或被细胞吞噬掉了，你在相差显微镜下再仔细观察，可看到细胞内有同样大小的颗粒甚至空泡。
细胞离开了有血清的环境当然生长状况不如以前，而且有小黑点存在的情况下，状态就更差，所以你观察到细胞大半都死了。进入细胞里面和黏附在细胞上面的小黑点少了，而是大部分跑到上清里去了，所以上清看起来要比有血清的培养基混浊多了。
黑点是什么，目前好像还没人说清楚，据说与血清有关。我觉得它很象微生物，但繁殖速度又较慢，细胞生长还能继续。如果说它不是微生物，但它又会繁殖。我们共同探讨这个问题吧。
建议你把细胞多洗几次，再换血清试试。
（2）你观察的很仔细，分析的也很有道理
我想补充两点：
一、无血清培基应该不会对我的细胞的生长造成太大的影响，因为以前我做过两次，细胞生长速度和形态都与有血清培养无明显差别，最长的一次我养了三天半，培基清亮，细胞生长良好，这可能是因为那时细胞状态很好的缘故吧，好怀念那段时光啊！
二、是不是有一种微生物特别依赖转铁蛋白和胰岛素,当有血清培养时受到限制，而换无血清培养基时反而发展的很快，我可是闻到了一股令人作呕的臭味。
如你所建议的，我正在洗细胞，即消化后吹打制悬，离心去上清，再加HANKS液洗两次，吹打制悬再分装。除此之外我发现有小黑点的细胞特别容易被胰酶消化下来，所以每次消化时都先消化下来一部分，倒掉消化液并以HANKS液清洗，最后再吹打制悬。
经过以上的处理发现黑点明显减少，打算过两天再换无血清培基看看。
我正在做，结果还可以。
我用的上海第二医科大学的测AFP的试剂盒
步骤如下：
将1*106/孔的细胞铺六孔板，24小时后换无血清培养液，2ml/孔，48小时后收集上清和细胞，然后根据试剂盒的操作步骤操作。注意细胞要先用PBS洗，然后刮下来，冻融3次后离心取上清做。
不同细胞AFP的表达量是不同的，我做的是Hep3B，PLC/PRF/5表达高，故上清也有很高的量。
[17] FDA news FDA add boxed waming for heart2related risk to antrdinbetes drug A vandial[E B/OL].2007211214.http// www.fdagov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW0173him1. [18] EMEA:Questions and answers on the benefits and risk of rosiglitazone[EB/OL].2007210218[2007212215]. http//www.emeaeuropaeu/pdfs/human/press/pr/48446407 en pdf. [19] 张杰.罗格列酮心血管安全性问题尚需监测与进一步 评价[J].中国临床药理学杂志,2008,24(1):92294. [20] Lars Slordal,Olav Spigset.Heart Failure Induced by Non2Cardiac Drugs[J].Drug Safety,2006,29(7):5672 586. (收稿日期:2009202219)无血清培养基的研究进展 梁 菁,李多伟(西北大学生命科学学院,陕西西安710069) 摘要:目的 总结无血清培养基的组成、主要补充因子及作用、应用以及新近研究进展,为细胞培养等研究工作提供参考。方法 查阅国内外文献资料进行整理和归纳。结果 无血清培养基克服了完全培养基的种种弊端,且关于无血清培养基的研究取得了诸多进展。结论 无血清培养基在生产实践中已得到广泛应用,进一步提高其通用性、降低成本、用于大规模生产的方法有待探索。 关键词:无血清培养基;补充因子;研究进展 中图分类号:R97 文献标识码:A 文章编号:100422407(2009)0420325203 动物细胞培养技术近年来发展迅速。传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质,但其存在多种缺点:具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染;血清昂贵,可能发生供应紧张,血清的来源不稳定等问题。无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分,既能满足细胞的培养要求,又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用,而且无血清培养基技术也迅速发展并取得了许多进展。1 无血清培养基的发展过程 无血清培养基的发展大致经过了三代,第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势[1](见表1)。 表1 无血清培养基的发展过程 成分优缺点 第1代不含血清,但含有大量的动物或 植物蛋白如BSA和动物激素等。蛋白含量高(低于有血清培养基),不利于目标蛋白的分离纯化,降低回升率,增加成本。 第2代完全不用动物来源蛋白(无动物 衍生蛋白)。降低生产成本,加快报批的速度(目前市面上销售的主要产品)。 第3代完全没有蛋白或含量极低。化学成分确知,细胞培养与生产容易做到恒定, 分离纯化容易,成本低,管理容易。仅限于应用 几株细胞系。 第4代无血清,无蛋白。适合多种不同细胞生长并可高温消毒。2 无血清培养基的组成及其主要补充因子 无血清培养基一般认为是由两部分组成,即基础培养基和替代血清的补充因子。 2.1 基础培养基 无血清培养基的基础培养基一般为与所需培养细胞相应的合成培养基,是按细胞生长需要由一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组成的。在对不同的细胞进行培养时可根据需要对基础培养基和某些组分进行相应的调整。 2.2 补充因子 补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称。这些补充因子可使培养基既能满足动物细胞培养的要求,又能有效避免血清培养基成分不明确、有批间差异、常被病毒和支原体污染、血清来源不稳定、细胞产品不易纯化等问题。补充因子可分为如下几类[2]。 2.2.1 激素和生长因子 激素可分为多肽类激素和甾体类激素。多肽类激素有胰岛素、生长因子、胰高血糖素等;甾体类激素有孕酮、氢化可的松、雌二醇等。多肽类生长因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等[3]。 在细胞无血清培养中,胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子[3]。Jan等[4]认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。氢化可的松能促进细胞贴壁和细胞分离,在某些情况下会诱导细胞生长和诱导细胞分化[3]。 2.2.2 结合蛋白 无血清培养基中的结合蛋白主要是白蛋白和转铁蛋白。白蛋白可通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定并调节上述物质在无血清培养基中的活性,此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用[1,5]。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其它微量元素如钒等结合[6]。 2.2.3 贴壁和铺展因子 绝大多数的动物细胞在体外生长时需要固着于适宜生长的基质上,并铺展成一单层,才能开始增殖。目前在无血清培养中常用的贴壁和铺展因子有纤黏蛋白、胶原、聚赖氨酸、昆布氨酸、血清铺展因子等[1,2]。 2.2.4 微量元素和低相对分子质量营养元素 一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低相对分子质量的化学物质,如微量元素、维生素、脂类等。微量元素能消除过氧化物酶和氧自由基对细胞的损害,维生素参与代谢、抗氧化等[3],维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢,维生素C和维生素E 具有抗氧化作用。丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质[1]。 2.2.5 酶抑制剂 有时将细胞用酶处理后会有一些酶残留,此时若不对残余的酶加以处理可能会对细胞不利,应加入相应的酶抑制剂终止残余酶的作用以达到保护细胞的作用。 3 无血清培养基的研究进展 由于近年来动物细胞体外培养技术的迅速发展以及无血清培养基在动物细胞培养中的广泛应用,与无血清培养基相关的研究在近几年来也取得了很大的进展,主要表现在以下方面。 3.1 有关无血清培养基的新方法 在人牙龈上皮细胞培养
2019-2025年全球及中国无血清培养基行业调研报告 喵咪产业服务（微信公众号） 第一章产业概述 1.1 无血清培养基定义 无血清培养基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。 1.2 无血清培养基分类 目前，无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种： 1.一般意义上的无血清培养基，用各类可代替血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白（BSA），转铁蛋白，胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高，添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。 2.无动物来源培养基：许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。 3.无动物蛋白培养基：培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。 4.化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全的，最为理想的培养基，首先可以保
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
V ero细胞是日本学者Y asumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴附依赖性细胞系, V ero一词由世界语中的verde(意为绿色的)和reno意为肾脏的)两个词合并而成。V ero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，V ero细胞具有以下特点:①来源方便，可连续传代，生长速度快;②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高;③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高;④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。疫苗的接种对象主要是大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组分复杂而尚不完全明确的混合物，至少含有1 000种不同的蛋白质，总蛋白量高达60~150g/L，它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受V ero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的V ero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度;从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎的阮病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患阎。 由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括V ero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势问。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。 V ero细胞无血清培养基的研究和商业开发 1.1 V ero细胞无血清培养基的研究 培养基是影响体外培养细胞生长代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。V ero细胞无血清培养的技术关键在于无血清培养基的设计和优化。 设计V ero细胞无血清培养基组成配方的技术核心是筛选和确定具有促进细胞贴附生长、维持细胞存活、提高病毒扩殖效果的培养基组成成分。基于细胞生长和代谢的高通量分析及Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken响应面设计是V ero细胞无血清培养基设计和优化的主要技术。V ero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态。此外，在某些病毒疫苗(如流感病毒疫苗)的生产过程中，需要在培养基中加人一定浓度的胰蛋白酶以提高病毒的感染和增殖效率。另一方面，病毒的感染和增殖不仅是细胞代谢负荷不断加大的过程，也是细胞病变、以致凋亡和坏死、甚至裂解的渐进性过程。V ero细胞无血清培养基的设计和优化相对于应用于动物细胞悬浮培养工艺生产重组蛋白、特别是治疗性抗体生产的无血清培养基更具挑战性。 设计V ero细胞无血清培养基的较为便捷和有效的策略是以DMEM,F-12,M199和RPMI1640等商品化的合成培养基的单独使用或联合使用为基础培养基，以反映细胞生长和代谢的主要参数为评价指标，结合统计学方法确定向其中添加生长因子、激素、结合蛋白及豁附因子、微量元素、脂类和脂类前体物等的种类和浓度。无血清培养基中常用的黏附因子主要是存在于细胞间质和血清中的胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等。其中，纤粘连蛋白和层粘连蛋白不仅具有提高细胞的砧附力及活力的作用，同时在促进有丝分裂中也起着重要的作用。某些含有精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)序列的短肤也能够有效地促进V ero细胞贴附到以聚苯乙烯和醋酸纤维素为材
CHO细胞无血清培养基技术手册2009 北京清大天一生物技术有限公司 BEIJING TSINGHUA SKYWING BIO TECH Co.,LTD. 2009年9月
1 CHO细胞 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC 保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 ATCC提供的CHO-K1细胞照片 CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。 二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用
动物细胞无血清培养基的优势、特点与实验研究 摘要：动物细胞无血清培养基相比天然培养基、合成培养基等传统培养基有无可比拟的优势，其组成成分相对清楚，制备过程简单，日益得到生物技术界的重视。运用统计学实验方法，可科学有效地考察细胞培养基中多因素、多水平间的交互作用。应用新型蛋白质组分分析技术及生物芯片技术定位胞浆信号通路相关蛋白、膜表面的生长因子受体、激素受体、细胞因子受体、粘附分子等，用以确定细胞培养基中调控分子的添加组合。对无血清培养基的优势特点及常用的实验研究进行概述。以期为动物细胞无血清培养基的研究与研制提供参考。 关键词：动物细胞；无血清培养基；实验设计 动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿研究课题之一，无论是在基础研究还是生产实践方面都得到生物技术界的重视。随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长，基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。无血清细胞培养技术的研究日益得到人们的重视。近年来，有关无血清培养基的研制和开发得到了迅速发展，推动了基因工程产品及产业的发展。 1 无血清培养基的优势特点及分类 细胞培养基是细胞体外培养的最重要因素。无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比，无血清培养基是一种不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养技术也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。 常规细胞培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物，其中最常用于培养基的血清是一种组分很不明确的混合物。所以常规血清细胞培养基存在以下缺点： （1）血清来自于动物体，其对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用，但同时也有细胞生长抑制因子和毒性因子，所以存在潜在毒性。 （2）由于动物血清提取的局限，使其应用于培养基的价格格外昂贵。 （3）动物血清提取的局限，也给细胞培养的标准化带来困难，同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题，具有潜在的细胞毒性作用，给规模化培养细胞增加了难度［1］。 由于上述常规血清细胞培养基存在的诸多问题，促使我们改进培养方法，用
用无血清培养基制备V ero细胞 狂犬病疫苗的实验研究 1材料 细胞株： V ero 细胞（中国典型培养物保藏中心CCTCC） 病毒株： CTN-1V株（中国药品生物制品标准化研究中心） 培养基及添加物： Medium 199（Gibco公司） 无血清培养基（Gibco公司、Hyclone公司） 新生牛血清（兰州民海生物有限公司） 细胞培养容器： T75培养瓶，2L转瓶，10L瓶 仪器设备： 细胞培养恒温室，XDS倒置显微镜，转瓶机，7.5L生物反应器 2方法 2.1 2L转瓶试验方法 2.1.1具体步骤 用T75细胞瓶培养复苏的V ero细胞，按照常规方法传代扩增至一定数量的2L转瓶中，待细胞长至均匀单层后接种病毒，换为不同浓度（分别为100%、50%、25%）的两个厂家的无血清培养基作为维持
液，同时以传统培养基（M199+0.2%人血白蛋白）作为对照组，根据病变情况收获病毒液并超滤层析。 2.1.2结果及讨论 2.1.2.1细胞状态比较 均匀的单层细胞接种病毒后,在尚未出现病变时，SFM试验组的细胞，体积略大于人白对照组的细胞，细胞轮廓清晰、饱满，病变的出现亦稍晚于对照组；约3-4天时均有病变产生：细胞面呈网状，有脱落、游离细胞。至5-6天收毒时，SFM试验组的细胞维持较好，未脱落细胞多于对照组，细胞维持时间较对照组长。 人白对照组细胞： Hyclone SFM 试验组细胞：Gibco SFM 试验组细胞：
2.1.2.2滴度比较 2.1.2.2.1 100%SFM(Gibco)作为维持液与2‰人白M199作为维持液所收获的病毒液相比，滴度结果基本一致；但100%SFM(Hyclone)作为维持液的病毒液滴度稍高于人白对照组。（见表一） 表一 2.1.2.2.2在以不同浓度SFM作为维持液的试验中，两者之间差别不明显。（见表二） 表二
无血清培养基 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-17 12:29 文章来源：丁香园 分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养培养基点击次数：1026 无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。 无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 5.微量元素：硒是最常见的。 使用方法 目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
无血清培养基应用 细胞培养就是从机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。体外细胞培养最常见的是合成培养基如DMEM,F12,MEM等混合一定比例的牛血清进行培养;但是大量使用牛血清制品有许多缺陷，如，动物源成分，无法用于临床研究;成分复杂，批间差大，质量不稳定，重复性差，影响实验和生产，而且极易引起交叉污染，所以无血清培养正在替代有血清培养。 无血清培养基成分 无血清培养基成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质 许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素 针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂 培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶;抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白 常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
细胞血清培养基和无血清培养基的配制以及区别 细胞培养基是如何配制的？培养细胞的完全培养基由基础培养基和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是迈健基础培养基和迈健培养基营养添加物的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而迈健培养基也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。现应用于快速生长的细胞，同培养基含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培养基中这两种物质缺乏时)。但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清用于神经元培养，也有人用马血清来培养胶质细胞。用大鼠进行神经元培养的某些研究者喜欢使用同型血清;人类的胎盘血清，亦曾用于神经组织的器官类型的培养，也用在一些特殊培养种类中。 血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞输入人体，所以可能存在人体异源体排斥和冲突，有一定风险，现如今该研究领域为了规避这样的风险，研究发明了迈健细胞无血清培养基，取代血清培养基的不利因素。 无血清培养基 1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的组合置换培养基中的成分，最后找到了适合大多数细胞培养的试剂配方，该配方称为N2，专
无血清细胞培养 摘要：本文综述了动物和昆虫细胞培养对细胞培养基的要求，并且在总结细胞培养基化学成分的基础上归纳了细胞无血清培养的条件和目前的研究现状。 关键词：细胞培养无血清 细胞培养是从生物体内取出细胞, 模拟其体内的生理环境, 在无菌、适温和丰富的营养条件下, 使细胞生存、生长并维持结构和功能的技术。 细胞培养基成分要求 在动物和昆虫细胞培养中，培养基是细胞培养的关键, 培养基是细胞赖以生长、增值、分化的重要因素。不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求, 至少有14种必需的氨基酸是细胞本身不能合成而必须由培养基提供的。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质, 维生素对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有作用, 泛酸、异已酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的,胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖, 无机盐在培养基中维持昆虫细胞生长的渗透压。水解乳蛋白和酵母提取物是昆虫细胞培养基中最常用的添加物。缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。因此，昆虫细胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培养基中摄取有效，所以各类培养基中都含有较高浓度的谷氨酰胺。有机酸，单独测试时只有苹果酸有生长促进作用。联合使用时，则对细胞生长有显著的促进作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖。在昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，这是因为昆虫细胞要在高于哺乳动物细胞生长的渗透压中生长，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+／K+比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+、A13+等能促进细胞贴附和增加产量，其中A13+和Zn2+还可以促进病毒的感染和复制。在昆虫细胞悬浮培养中还需添加一些多聚物如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮和聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物等，以保护细胞免受机械剪切力的损伤和降低细胞聚集程度。大部分鳞翅目昆虫细胞在25～30℃之间生长最佳。培养基pH保持在6.2左右。多数昆虫细胞倍增时间为16-24 h。 血清的作用及其缺点 动物血清对细胞生长和促进细胞分裂有非常重要的作用。血清能够提供促进细胞生长、
人干细胞无血清/无饲养层培养基 Stemmera TM人无血清/无饲养层培养基（SFM）是在无血清和饲养层情况下，用于培养人的干细胞能支持干细胞的生长，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。 规格: 500ml 产品描述： Stemmera TM人ESCs/iPSCs无血清/无饲养层培养基(hStemSFM)是一种成分明确的即用型培养基，特殊的配方，在完全无血清和无饲养层环境下能用于人诱导多能干细胞（hiPSCs）和胚胎干细胞(hESC)的重编程、增殖和维持。 产品成分： 两种成分混合后是一种即用型完全培养基 存储和运输： Stemmera TM hStemSFM中的两种成分是分开运输的，基本培养基在室温下运输然而SFM添加物是在干冰环境下运输。在收到产品后基本培养基需存储在2-8°C环境中而SFM 需要存储在-20°C，避免多次冻融。完全培养基储存在2-8°C的黑暗环境中能使用长达1个月。完全培养基分成等份的供每日使用，避免反复预热，避光保存最佳。 产品使用：该产品是仅用于体外使用和研究使用。不可用于人类或动物的诊断或治疗使用。 使用注意事项： 1.使用aerosol barrier枪头，每次用完更换新的枪头。 2.要用新的，干净的手套和穿实验服。 3.材料安全数据表（MSDS）可在网站下载。
4.用70%乙醇或其他合适的消毒剂清洁工作空间。 培养条件: 培养基：Stemmera TM hStemSFM。 细胞：人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）。 培养类型：单细胞传代和贴壁培养。 温度范围：37°C。 孵育器的环境：在含5% CO2或5% O2的潮湿环境中，确保适当的气体交换，减少与外界接触。 建议培养容器：基质胶包被的板子、皿或烧瓶（Corning，货号：356231，稀释比1:100），根据容器的大小，调整细胞数量。 操作手册: ?完全SFM培养基的制备：添加3.5ml冷冻SFM添加物（货号 ST02001-S1）到500ml 基础培养基中（货号st02001-bm 500ml），搅拌均匀，0.22μM滤膜过滤。 ?将完全培养基分成等份并在室温下预热SFM供每天使用。。 ?Corning基质胶包被培养容器：使用Corning基质胶（货号356231，稀释比1:100）包被容器，在5% CO2或5% O2（低氧孵育器）的孵育器中37 o C孵育至少30min或过夜。 已包被的容器能在一周内使用。使用前，立即倒掉所有的基质胶，更换预热的完全Stemmera TM hStemSFM培养基。 注意：所有成分在有效期内存储在黑暗的2-8o C环境中，完全培养基StemmeraTM hStem SFM 能稳定储存时间长达4周。 在完全培养基hStemSFM 中hiPSCs 和hESCs的复苏 1.37°C水浴迅速解冻一小瓶冷冻人干细胞。 2.用移液管轻轻将小瓶中的所有干细胞都吸入含完全培养基的15ml无菌离心管中。 3.在1000转下离心5min。 4.吸弃上清液，尤其小心避免干扰细胞颗粒。 5.在含10nM Rock 抑制剂Y27632（Fisher Scientific, 货号50-863-7）的1ml预热完全培 养基中重悬细胞。
CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY ACHIEVEMENTS \第18期\2009年\中国科技成果 科技计划成果 27 E-mail:lixy@https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,\李小莹\编辑DOI:10.3772/j.issn.1009-5659.2009.18.010本课题通过引进技术，开发生产替代小牛血清、胎牛血清的无血清或低血清动物细胞培养基，引进先进的动物细胞培养技术，建立中空纤维细胞反应器培养技术，从而实现动物细胞无血清、连续化大规模的生产，将对生物工程、生物医药、疫苗生产等领域的应用有着重要意义。 动物细胞大规模培养广泛应用于抗体药物、基因治疗药物、人用疫苗、兽用疫苗以及基因工程药品等生物制品的生产，目前主要采用最基础的合成细胞培养基（如199、MEM 等），甚至在天然培养基（如水解乳蛋白）中加入10％左右的新生牛血清，在转瓶中培养细胞。随着对生物制品安全性要求不断提高，在生产过程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势。美国FDA 和美国农业相关部门已经严密控制在细胞培养中新生牛血清和胎牛血清的使用，以降低动物血清可能携带的传染源对细胞系和制品带来的风险。 我国的养殖业发展迅速，而内蒙古更是我国重要的畜牧业基地，而畜禽防疫是畜牧业发展的重要环节。在我国疫苗等生物制品处于快速发展时期，目前利用动物细胞生产疫苗（如口蹄疫疫苗、猪瘟疫苗）一直沿用平面转瓶培养和高血清培养基生产细胞，生产企业大多采取加大固定资产投资的方式，即新建车间、大批量添置转瓶机、加大转瓶容量等方式提高产能，这种方式在一定程度上限制了生产的发展，并造成社会资源的浪费。其影响生产成本和产品质量的主要因素为：新生牛血清价格较高、病原体去除困难；转瓶培养车间占地面积大；人员费用高；细胞污染较严重等。本项目开发的低血清和无血清培养基可替代95%新生牛血清，细胞培养原辅料成本降低30%。 中空纤维细胞反应器的优点：纤维拥有让细胞吸附的较大表面积，并使营养交换、供液系统无剪切，高传质、营养成分选择性渗入且细胞代谢产物核细胞碎片易于分离、防止感染；可有效节省生产空间，一只500ml 容量的中空纤维超滤器的细胞培养空间相当于20瓶2000ml 转瓶培养瓶的培养空间；高密度的细胞可以让病毒快速、稳定的侵染，从而使细胞和产物密度都可达到很高水平；可以有效节省劳动力50%以上；同时减少污染，大幅度提高疫苗质量。如能在现有生物制品生产规模的基础上，将本项目成功应用到动物疫苗生产中，将给企业带来巨大的经济效益，同时，生产的优质疫苗降低了奶牛流产、高热症等不良注射反应，对促进畜牧业的良性发展将起到推动作用。 主要成果： （1）本课题通过引进澳大利亚凯斯特拉研究公司非动物促细胞生长因子制备技术，合作研究生产无血清培养基。在细胞大规模培养中，可以替代80%～100%牛血清，该项目技术达到国内领先水平。 （2）利用国产中空纤维超滤器，组装成套小型细胞反应器，完善细胞耗养、细胞培养自动监控系统，为进一步开发细胞代谢产物分离装置和代替同类进口产品奠定了基础。 （3）与国内有关单位合作，制备CIK、DC 细胞专用低血清、无血清培养基，进行实验室规模应用与综合测评，为进一步产业化开发积累了试验数据。 （4）在引进、消化核心技术的基础上，项目组进一步拓宽了合作渠道，与国内外有关单位合作开发了动物非特异性免疫增强剂，该产品具有高效的抗菌、抗病毒及增强免疫作用，为实现无抗化养殖业开辟了新的途径。课题完成单位：内蒙古科学技术与社会发展研究院 内蒙古新宏生物科技有限公司 课题完成人：何秀萍 杨保军 张 宏 李 煜 王孔江 王 铮 魏学锋 卢水干 Mal Brandon 廛洪武 * 国际科技合作计划课题（2006DFA32540）。 无血清动物细胞培养基的研制及 大规模动物细胞培养新技术应用 * CSTA 万方数据
CHO细胞无血清培养基技术手册 1 CHO细胞 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 ATCC提供的CHO-K1细胞照片 CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。
二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr基因进行筛选时，首先将重组DNA分子导入dhfr-表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在挑选表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌呤和胸苷的培养基。另外，氨甲喋呤（MTX）选择压力可使CHO/dhfr-细胞的外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表达。 CHO-GS细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损伤、抑制作用。 ATCC提供的CHO/dhfr-细胞照片 2 CHO细胞表达系统的优势与特点 由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳
CHO细胞无血清培养基的筛选与优化 目的:动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿技术之一,无论是在研究还是在生产实践方面都对当代生物技术有着重要的影响。虽然目前市售的商业化培养基已具有非常好的广谱性,但是却缺少针对性。针对某一细胞品种设计对应的培养基成分无疑是需要耗费大量的金钱和时间,利用多种市售的培养基进行不同比例的混合,可以在较短时间内使细胞培养得到针对性优化,从而提高产物的产量。 方法:本文利用了市售的几种常用培养基,对CHO细胞进行培养,采用先筛选后优化组合的方式进行针对文中的CHO细胞培养进行优化。筛选和优化又分为两部分进行:一是基础培养基的筛选和优化;二是补料培养基的筛选和优化。在培养过程中检测细胞的活率、密度以及产物的表达量作为培养基的评价指标,用以考察培养基的优劣。 结果:通过对基础培养基和补料培养基的筛选、优化,使得最终的利用混合培养基培养的细胞不论是在细胞密度、活率还是产物蛋白的表达量方面都优于单一培养基培养的细胞。通过优化使得基础培养基筛在最细胞高密度方面:混合培养基的平均最高密度高出单一培养基的平均最高密度9.8%;在最后细胞活率方面,混合培养基的最终平均活率高出单一培养基的最终平均活率11.8%;在最终蛋白产量方面,混合培养基的最终产量高出单一培养基的最终产量17.4%。通过优化补料培养基在最细胞高密度方面:混合培养基的平均最高密度高出单一培养基的平均最高密度11.0%;在最后细胞活率方面,混合培养基的最终平均活率高出单一培养基的最终平均活率26.6%;在最终蛋白产量方面,混合培养基的最终产量高出单一培养基的最终产量20.6%。
结论通过初步筛选和优化组合的方式进行多种培养基的成分配比可以在短时间内提高细胞密度、提升细胞活率的维持时间从而提高目的蛋白的产量。
https://www.doczj.com/doc/0b3639872.html,
NutriStem? MSC XF Medium 间充质干细胞无血清培养基 使用说明
1. 培养基组分 产品名称 NutriStem? MSC XF Basal Medium 间充质干细胞无血清基础培养基 NutriStem? MSC XF Supplement 间充质干细胞无血清营养添加物 NutriStem? MSC XF Basal Medium 间充质干细胞无血清基础培养基 NutriStem? MSC XF Supplement 间充质干细胞无血清营养添加物 注意: 作为完全的，即用型的培养基，不需要额外的添加物。两种组分不单独销售。 2. 产品描述 NutriStem? MSC XF Medium是无血清、不含异源动物成分(Xeno-free) 的人类间充质干细 胞培养基，可促进多种来源的人类间充质干细胞的生长，如骨髓（BM-hMSC）、脂肪组织 （AT-hMSC）、脐带（UCM-hMSC）。NutriStem? MSC XF Medium可促进人类间充质干 细胞的长期生长，同时还能保持多向分化潜能。NutriStem? MSC XF Medium和MSC间充质 干细胞促贴壁试剂（货号: 05-752-1）共同使用，细胞贴壁及增殖效果更好。 3. 特点 ? ? ? ? ? ? 无血清、不含异源动物成分：所有成分都是明确的，且同种来源（人），包括蛋白质； 不含抗生素； 能够培养不同来源的人类间充质干细胞； 维持人类间间充质干细胞的长期生长，保留类纤维原细胞形态； 极低的背景分化率； 维持间充质干细胞的自我更新及多向分化潜能，可分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。 货号 05-200-1A 05-201-1U 05-200-1B 05-201-1-06 规格 500 ml 3 ml 100 ml 0.6 ml 储存条件 4°C -20°C 4°C -20°C
4. hMSCs对NutriStem? MSC XF Medium的适应性 若之前使用血清培养法，转换至NutriStem? MSC XF Medium间充质干细胞无血清培养，可 能会面临细胞适应的问题，需要逐步适应，并优化培养方案，建议从原代开始使用。 注意：如同任何培养体系的转换，在新的培养体系下细胞会损失一部分并需要一定过程适应。
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