水质六种特定多环芳烃的测定高效液相色谱法
GB 13198—91
1 适用范围
本标准规定了测定水中多环芳烃(PAH)的高效液相色谱(HPLC)法。本标准参照采用国际标准ISO/DIS 7981/2高效液相色谱法分析的六种特定多环芳烃。
本标准适用于饮用水、地下水、湖库水、河水及焦化厂和油毡厂的工业污水中荧蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、苯并(ghi)苝、茚并(1,2,3-cd)芘六种多环芳烃的测定。
本法用环己烷提取水中多环芳烃，提取液通过弗罗里硅土柱，PAH吸附在柱上，用丙酮加二氯甲烷混合溶液脱附PAH后，用配备荧光和(或)紫外检测器的高效液相色谱仪测定。本方法对六种PAH通常可检测到ng/L水平。
水样中若存在可被共萃取的能产生荧光信号或熄灭荧光的物质对本法也有干扰。本法用弗罗里硅土柱层析净化分离，可降低荧光背景。
2 试剂和材料
2.1 高效液相色谱流动相为水和甲醇的混合溶液。
2.1.1 甲醇：分析纯，用全玻璃仪器重蒸馏，要求有足够低的空白。
2.1.2 水：电渗析水或蒸馏水，加高锰酸钾在碱性条件下重蒸。在测定的化合物检测限内未观察到干扰。
2.2 配制标准样品和水样预处理使用的试剂和材科。
2.2.1 二氯甲烷(CH
2Cl
2
)：用全玻璃蒸馏器重蒸馏，在测定化合物检测限内不出现色谱干扰为
合格。
2.2.2 丙酮(C3H6O)：同2.2.1。
2.2.3 环已烷：分析纯，同2.2.1。
注：若环已烷的纯度不够，可采用附录中两种办法中的任一种进行净化。
2.2.4 无水硫酸钠(Na
2SO
4
)：分析纯，在400℃加热2h。
2.2.5 硫代硫酸钠(Na
2S
2
O
3
·5H
2
O)：分析纯。
2.2.6 弗罗里硅土(Florisil)：60～100目，色层分析用。在400℃加热2h。冷却后，用水(2.1.2)调至含水量为11％(m/m)。
2.2.7 碱性氧化铝；层析用，50～200μm，活度为BrockmannⅠ级。达到Ⅰ级的制法如下：
将氧化铝加热至550±20℃至少2h，冷却至200～250℃，移入放有高氯酸镁的干燥器内，继续冷却，即得活度为BrockmannⅠ级的氧化铝。在干燥器内可存放五天。
2.2.8 柱层析用硅胶：100目，在300℃活化4h。
2.2.9 浓硫酸(H2SO4)：分析纯。
2.2.10 标准溶液：
注：有些多环芳烃是强烈致癌的，因此操作时必须极其小心。不允许人体与多环芳烃固体物质、溶剂萃取物、多环芳烃标准品接触。多环芳烃可随溶剂一起挥发而沾附于具塞瓶子的外部，因此处理含多环芳烃的容器及实验操作过程必须使用抗溶剂的手套。被多环芳烃污染的容器可用紫外灯在360nm紫外线下检查，并置于重铬酸钾-浓硫酸洗液中浸泡4h。标准溶液应在有适当设备(如合适的毒气橱、防护衣服，防尘面罩等)的实验室中配制。用固体化合物配多环芳烃标准品，在没有合适的安全设备及尚未正确掌握使用技术之前，不能进行。
2.2.10.1 色谱标准物：固体多环芳烃标准物为荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘及苯并(ghi)苝等六种，纯度在96％以上。采用固体标准物配制标准储备液，亦可采用经证实为合格的市售多环芳烃标准溶液配置标准储备液。
2.2.10.2 用固体多环芳烃配制标准储备液：分别称量各种多环芳烃(2.2.10.1)20±0.1mg，分别溶解于50～70mL环己烷(2.2.1)中，再以环已烷稀释至100±0.1mL，配成浓度为200μg/mL 单个化合物的标准储备液。若用市售溶液配制标准储备液，可在容量瓶中用环已烷稀释，使标准储备液的浓度各为200μg/mL的单化合物溶液。储备液保存在4℃冰箱中。
2.2.10.3 混合PAH标准溶液的配制：在10mL容量瓶中加入各种PAH储备液(2.2.10.2)1±0.01mL，用甲醇稀释至标线，使标准溶液中含各种多环芳烃的浓度各为20μg/mL的混合PAH 标准溶液。标准液保存在4℃冰箱中。
2.2.10.4 标准工作溶液：根据仪器灵敏度及线性范围的要求，取不同量的混合PAH标准溶液
(2.2.10.3)，用甲醇(2.1.1)稀释，配制成几种不同浓度的标准工作溶液。
3 仪器
3.1 高效液相色谱仪：带荧光和紫外检测器的高效液相色谱仪。
3.1.1 恒流梯度泵系统。
3.1.2 反相柱：填料为Zorbax 5μODs，校长250mm，内径
4.6mm。
3.1.3 荧光检测器：荧光分光光度计检测器，激发波长280nm，发射光波长大于389nm截止点；荧光光度计检测器应有激发用的色散光系统和可用滤光片或色散光学系统的荧光发射部分。3.1.4 紫外-可见光检测器：可调波长紫外检测器或固定波长为254nm的紫外检测器，可单独使用，也可以与荧光检测器联用。
3.1.5 记录仪：与检测器匹配。
3.1.6 微量注射器：规格为5，10，50，100及500μL。
3.1.7 恒温水浴(或恒温柱箱)。
3.2 采样瓶：1L具磨口玻璃塞的棕色玻璃细口瓶。
3.3 振荡器：调速，配备自动间歇延时控制仪。
3.4 玻璃器皿：
3.4.1 分液漏斗：1000mL，玻璃活塞不涂润滑油。
3.4.2 碘量瓶200mL。
3.4.3 层析柱：
3.4.3.1 净化环己烷层析柱：长500mm，内径25mm，玻璃活塞不涂润滑油的玻璃柱。
3.4.3.2 样品预处理层析柱：长250mm，内径10mm，玻璃活塞不涂润油油的玻璃柱。
3.4.4 K-D浓缩瓶：25mL，带刻度，容积必须进行标定，带磨口玻璃塞。
3.4.5 K-D蒸发瓶：500mL。
3.4.6 K-D Snyder柱：三球，常量。
3.4.7 K-D Snyder柱：二球，微量。
3.4.8 量筒：500mL。3.5 玻璃毛或玻璃纤维滤纸：在400℃加热1h。冷却后，保存在具塞磨口的玻璃瓶中。3.6 沸石：在00℃加热1h。冷却后，保存在具塞磨口的玻璃瓶中。
4 样品
4.1 样品的性质
4.1.1 样品名称：水样。
4.1.2 样品状态：液体。
4.1.3 样品稳定性：水样中的PAH对光敏感。
4.2 水样采集和储存方法
4.2.1 水样采集：样品必须采集在玻璃容器中，采样前不能用样品预洗瓶子，以防止样品的沾染或吸附。防止采集表层水，保证所采样品具有代表性。在采样点采样及盖好瓶塞时，样品瓶要完全注满，不留空气。若水中有残余氯存在，要在每升水中加入80mg硫代硫酸钠(2.2.5)除氯。
4.2.2 水样保存：水样应放在暗处，4℃冰箱中保存；采样后应尽快在24h内进行萃取。萃取后的样品在40天内分析完毕。
4.3 水样预处理
4.3.1 水样的萃取：摇匀水样，用500mL量筒(3.4.8)量取500mL水样(萃取所用水样体积视具体情况而定，可增减)，加入50mL环己烷(2.2.3)，手摇分液漏斗，放气几次后，安装分液漏斗于振荡器架上(3.3)，振摇5min进行萃取。取下分液漏斗，静置约15～30min(静置时间视两相分开情况而定)，分出下层水相留待进行第二次萃取，上层环已烷相放入200mL碘量瓶(3.4.2)中，再用50mL环己烷对水样进行第二次萃取，水相弃去，环己烷萃取液并入同一碘量瓶中，加无水硫酸钠(2.2.4)至环己烷萃取液清沏，至少放置30min，脱水干燥。
4.3.2 萃取液的净化：
4.3.2.1 饮用水的环己烷萃取液，可以不经柱层析净化，浓缩后直接进行HPLC分析。
4.3.2.2 地表水及工业污水用柱层析净化。
4.3.2.2.1 层析柱的装填：在玻璃层析柱(3.4.3.2)的下端，放入少量玻璃毛或玻璃纤维滤纸(3.5)以支托填料，加入3mL环己烷(2.2.1)润湿柱子、称4～6g弗罗里硅土(2.2.6)于小烧杯(3.4.9)，用环己烷制成匀浆，以湿式装柱法填入上述柱中。净化地表水的校，填充4g弗罗里硅土，净化污水的住，填充6g弗罗里硅土。放出柱中过量的环己烷至填料的界面。
4.3.2.2.2 萃取液的净化；从层析柱(4.3.2.1)的上端加入已干燥的环己烷萃取液，全部溶液以1～2mL/min流速通过层析柱，用环己烷洗碘量瓶中的无水硫酸钠三次，每次5～10mL，环己烷洗涤液亦加入层析柱，回收通过柱的环己烷。被吸附在柱上的PAH用丙酮(2.2.2)和二氯甲烷(2.2.1)的混合溶液解脱。地表水用100mL(88mL丙酮＋12mL二氯甲烷)脱附；污水用
75mL(15mL丙酮＋60mL二氯甲烷)脱附。解脱液收集于已联接K-D蒸发瓶(3.4.5)的K-D浓缩瓶
(3.4.4)中，加入两粒沸石(3.6)，安装好三球Snyder柱(3.4.6)、待浓缩。
4.3.2.3 试样的浓缩：将K-D浓缩装置的下端浸入通风橱中的水浴锅(3.7)中，在65～70℃的水温下浓缩至约0.5mL，从水浴锅上移下K-D浓缩装置，冷却至室温，取下三球Snyder柱，用少量丙酮洗柱及其玻璃接口，洗涤液流入浓缩瓶中。加入一粒新沸石，装上二球Snyder柱(3.4.7)，在水浴锅中如上述浓缩，定容至0.3～0.5mL，留待HPLC分析。
注：甲醇、环己烷、二氯甲烷及丙酮等是易燃的有机溶剂，应在通用橱中操作。
5 操作步骤
5.1 调整仪器
安装高效液相色谱仪，使其达到预期的分离效果，预热运转至获得稳定的基线。
5.1.1 柱温：35℃。
5.1.2 流动相组成：
A 泵：85％水(2.1.2)＋15％甲醇(2.1.1)(V/V)。
B 泵：100％甲醇(2.1.1)。
5.1.3 洗脱：视柱的性能可采用下列方式的一种进行洗脱，或按柱的性能选择条件。
5.1.3.1 恒溶剂洗脱：以92％B泵和8％A泵流动相组成，等浓度洗脱。
5.1.3.2 梯度洗脱：
以60％B泵＋40％A泵的组成洗脱，保持20min；
以3％B/min增量至成为96％B＋4％A泵的组成，保持至出峰完。
以8％B/min减量至成为60％B泵＋40％A泵的组成，保持15min，使流动相组成恒定，为下一次进样准备好条件。
5.1.4 流动相流量：30mL/hr恒流；或按校的性能选定流量。
5.1.5 检测器：
5.1.5.1 荧光检测器(3.1.3)波长的选择：
a.荧光分光光度计检测器：六种PAH在荧光分光光度计特定的条件下最佳的激发和发射波长如表1。
表1 六种多环芳烃最佳的荧光激发和发射波长
水样中含苏并(1,2,3-cd)芘时选λ
ex ＝340nm，λ
em
＝450nm较好，在此波长下茚并
(1,2,3-cd)芘的荧光强度较高；否则选λ
ex ＝286nm，λ
em
＝430nm对苯并(a)芘灵敏度较高。
b.荧光计检测器：单色光荧光计使用λ
ex ＝300nm，λ
em
＝460nm为适宜；滤色器荧光计在
λex=300nm，λem＞370nm下测定。
5.1.5.2 紫外检测器(3.1.4)：在254nm下检测PAH。
以上几种检测器可以单独使用；亦可以把荧光和紫外两种检测器串联使用。
5.1.6 记录器：
5.1.
6.1 放大：根据样品中被测组分含量调节记录仪放大档；使谱图在记录纸量程内。
5.2 校准
5.2.1 用外标法定量。
5.2.2 标准样品：
5.2.2.1 标准样品的制备：在线性范围内用混合PAH标准镕液(2.2.10.3)配制几种不同浓度的标准溶液，其中最低浓度的溶液浓度应稍高于最低检测限。
5.2.2.2 高效液相色谱法中使用标准样品的条件：
a.标准样品与试样进样体积最好相同，两者的响应值也要相近。
b.在工作范围内，相对标准偏差＜10％。
c.标准样品与试样应尽可能同时进行分析。
5.2.2.3 使用次数：每个工作日必须测定一种或几种浓度的标准溶液来检验校准曲线或响应因子。如若某一化合物的响应值与预期值间的偏差大于10％，则必须用新的标准对该化合物绘制新的校准曲线或求出新的响应因子。
5.2.3 校准数据的表示；以响应值对进样量作校准曲线，可得一条通过原点的直线。响应值与进样量的比值为一常数，可用平均比值或响应因子代替标准曲线来计算测定结果。
5.3 测定
5.3.1 进样
5.3.1.1 进行方式：以注射器人工进样。
5.3.1.2 进样量：5～25μL。
5.3.1.3 操作：用试样(4.3.2.3)润湿微量注射器(3.1.6)的针头及针筒，并洗涤三次。抽取样品，排出针筒中的气泡。迅速注射样品至HPLC的柱头，进行HPLC分析。
5.3.2 记录
5.3.2.1 放大和纸速：记录下放大倍数及纸速。
5.3.2.2 组分的色谱峰：以标样核对，记下色谱峰的保留时间及对应的化合物。
5.3.2.3 基线漂移：记下漂移值。
5.4 色谱图的考察
5.4.1 标准色谱图
不同填料的色谱柱，化合物出峰的顺序有所不同，下因为两种不同检测器串联的十六种PAH
＝标准色谱图。图1为紫外检测器在波长254nm下的色谱图；图2为萤光分光光度计在λ
ex
286nm，λ
＝430nm下的色谱图。多环芳烃标样浓度十六种化合物皆为2μg/mL，进样量10μem
g/mL。
荧光强度
图1 十六种PAH标样的HPLC紫外谱图
图2 十六种PAH标样的HPLC荧光谱图
5.4.2 定性分析
5.4.2.1 各组分的洗脱次序：以标准谱图相对照。图1和图2为十六种PAH标样在Zorbax ODS
柱的HPLC图，出峰顺序为1.萘，2.苊烯，3.苊十芴，4.菲，5.蒽，6.荧蒽，7.芘，8.苯并(a)
蒽十枹，9.苯并(b)荧蒽，10.苯并(k)荧蒽，11.苯并(a)芘，12.二苯并(a，h)蒽，13.苯并(ghi)
苝，14.茚并(1,2,3-cd)芘。
5.4.2.2 保留值：以试样的保留时间和标样的保留时间相比较来定性。用作定性的保留时间窗
口宽度以当天测定标样的实际保留时间变化为基准。用一个化合物保留时问标准偏差的三倍计
算设定的窗口宽度。
5.4.2.3 鉴定的辅助方法：可用加标样使峰高叠加的方法；或用停泵扫描，测定各组分荧光激发和发射谱图与对应标样的荧光图对比的办法来帮助鉴证化合物。
5.4.3 定量分析
连接峰的起点与终点之间的直线作为峰底，以峰最大值到峰底的垂线为峰高。垂线在时间坐标上的对应值为保留时间。通过峰高的中点作平行峰底的直线，此直线与峰两侧相交，两点之间的距离为半高峰宽。峰与峰底之间的面积为峰面积，等于峰底乘半高峰宽。
)
5.4.3.2 计算(外标法
式中：X
——试样中组分i的含量，μ/L；
i
——标样中组分i进样量对其峰高(或峰面积)的比值，ng/mm(或ng/mm2)；
A
i
——样品中组分i的峰高(或峰面积)，mm(或mm2)；
B
i
——萃取液浓缩后的总体积，μL；
V
f
V
——注射样品的体积，μL；
f
——水样体积，mL。
V
s
6 结果的表示
6.1 定性结果
根据标准色谱图各组分的保留时间，确定出被测试样中存在的组分数目和组分的名称。
6.2 定量结果
6.2.1 含量的表示方法：按5.4.3.2公式计算出水样中PHA的含量，以μg/L表示。
6.2.2 精密度：见表2。
表2 不同实验室测定的精密度(再现性)
注：（1）为苯并（b）荧蒽＋苯并（k）荧蒽数据。
（2）空格表示未检出或分不开按苯并（ghi）苝。
6.2.3 准确度：见表3。
表3 各实验室准确度（地表水加标回收率）测定汇总
注：（1）空格表示未检出或分不开，按苯并（ghi）苝。
6.2.4 检出限：以HPLC最灵敏档噪音的五倍作为仪器的检出限。
附录A 六种特定多环芳烃的名称、结构及其在自然界的分布
(补充件)
多环芳烃几乎存在于所有的水中，可以在水中成为溶液或为微粒物质(悬浮性固体、沉积物)所吸附。下表所列特定的六种多环芳烃用作天然水和污水中存在的一大类多环芳烃的指示物。世界卫生组织拟定了饮用水中表列的六种特定多环芳烃总的最高可接受的水平为
200ng/L。这一标准也已为欧洲经济共同体所采纳。
各种不同水中，六种多环芳烃总的代表性数值如下：
地下水最高达50ng/L
地面水最高达1μg/L
废水最高达100μg/L
表A1 六种特定多环芳烃的名称和结构式
附录B 环己烷的净化方法
(补充件)
B1 浓硫酸净化
将环己烷与浓硫酸(2.2.9)共振摇，用试剂水(2.1.2)洗涤，经无水硫酸钠(2.2.4)干燥后进行蒸馏。
B2 柱层析净化
在一根具有玻璃活塞的玻璃柱(3.4.3.1)内，先加入Ⅰ级活性碱性氧化铝(2.2.6)50g，再从顶端加入20g干燥硅胶(2.2.8)，两种吸附剂都以干品加入。用分液漏斗从住顶端慢慢加入环己烷。通过校的最初50mL环己烷再从柱的顶端重新加入。在一般情况下一支柱可纯化2.5L 环己烷。若柱上出现黄色区带，就必须停止过柱，更换柱填料。
附加说明：
本标准由国家环境保护局科技标准司标准处提出。
Cems环保数据折算公式 流速 Vs = Kv * Vp 其中 Vs 为折算流速 Kv为速度场系数 Vp 为测量流速 粉尘 1 粉尘干基值 DustG = Dust / ( 1 – Xsw / 100 ) 其中 DustG 为粉尘干基值 Dust 为实测的粉尘浓度值 Xsw 为湿度 2 粉尘折算 DustZ = DustG * Coef 其中 DustZ 为折算的粉尘浓度值 DustG 为粉尘干基值 Coef 为折算系数，它的计算方式如下: Coef = 21 / ( 21 - O2 ) / Alphas 其中 O2 为实测的氧气体积百分比。 Alphas 为过量空气系数(燃煤锅炉小于等于折算系数为; 燃煤锅炉大于折算系数为; 燃气、燃油锅炉折算系数为 3粉尘排放率 DustP = DustG * Qs / 1000000 其中 DustP 为粉尘排放率 Dust 为粉尘干基值 Qs 为湿烟气流量，它的计算方式如下： Qs = 3600 * F * Vs 其中 Qs 为湿烟气流量 F 为测量断面面积 Vs 为折算流速 SO2 1 SO2干基值 SO2G = SO2 / ( 1 – Xsw / 100 ) 其中
SO2 为实测SO2浓度值 Xsw 为湿度 2 SO2折算 SO2Z = SO2G * Coef 其中 SO2Z 为 SO2折算率 SO2G 为SO2干基值 Coef 为折算系数，具体见粉尘折算 3 SO2排放率 SO2P = SO2G * Qsn / 1000000 其中 SO2P 为SO2排放率 SO2G 为SO2干基值 Qsn 为干烟气流量，它的计算方式如下： Qsn = Qs * 273 / ( 273 + Ts ) * ( Ba + Ps ) / 101325 * ( 1 – Xsw / 100 )其中 Qs 为湿烟气流量 Ts 为实测温度 Ba 为大气压力 Ps 为烟气压力 Xsw 为湿度 NO 1 NO干基值 NOG = NO / ( 1 – Xsw / 100 ) 其中 NOG 为NO干基值 NO 为实测NO浓度值 Xsw 为湿度 2 NO折算 NOZ = NOG * Coef 其中 NOZ 为 NO折算率 NOG 为NO干基值 Coef 为折算系数，具体见粉尘折算 3 NO排放率 NOP = NOG * Qsn / 1000000 其中 NOP 为NO排放率
新项目试验报告 项目名称：环境空气汞的测定 原子荧光分光光度法《空气与废气监测分析方法》（第四版）项目负责人：杨刚 项目审批人： 审批日期：
一、新项目概述 原子吸收分光光法和氢化物发生-原子荧光分光光度法测定汞，灵敏度高、方法快速准确、干扰少；双硫腙分光光度法是经典方法，准确、测定范围等，但操作复杂，要求严格，适用于高浓度汞污染物的监测。 二、检测方法与原理 检测方法：原子荧光分光光度法《空气与废气监测分析方法》（第四版）（2003）5.3.7.2 原理：通过等速采样，将颗粒物从固定污染源中抽取到玻璃纤维滤筒中或将无组织排放颗粒物收集到氯乙烯滤膜上。所采集的样品用混合酸消解处理。 在酸性介质中，加热消解是样品溶液中的汞以二价汞的形式存在，再被硼氢化钾还原成单质汞，形成汞蒸气，被引入原子荧光分光光度计进行测定。 大气颗粒物中Sb、Se、Bi、Au等元素含量较低，一般含量的Sb、Se、Bi、Au不干扰Hg的测定，大量的Cu、Pb等均不干扰测定。 当将采集10m3气体的滤膜制备成50ml样品时，最低检出限为3×10-3μg/m3。 三、主要仪器和试剂 1.试剂和材料 测定过程中，除非另有说明，均使用符合国家标准或专业标准的分析纯试剂和蒸馏水或同等纯度的水，所有试剂应不含铬。 1.1 硝酸：ρ=1.42g/ml，优级纯。 1.2 硝酸：1+1。 1.3 硝酸：1+19。 1.4 盐酸：ρ=1.19g/ml，优级纯。 1.5 5%盐酸。 1.6 重铬酸钾：优级纯。
1.7 氢氧化钾或氢氧化钠：优级纯。 1.8 盐酸溶液：1+1. 1.9 0.04%硼氢化钾溶液：称取0.4g硼氢化钾于已加入1gKOH的200ml去离子水中，溶解后，用脱脂棉过滤，稀释至1000ml。此溶液现用现配。 1.10 0.5g/L重铬酸钾溶液：称取0.5g重铬酸钾溶解于1000ml（1+19）HNO3中。 1.11 汞标准贮备液：准确称取1.080g氧化汞（优级纯，于105～110℃烘干2h）， 用70ml（1+1）HCl溶液溶解，加入24ml（1+1）HNO3溶液、1.0gK 2Cr 2 O 7 ，溶解 后移入1000ml容量瓶中，用水稀释定容至标线。此溶液每毫升含1.0mg汞。1.12汞标准使用液（Hg），0.500μg/ml：临用时，用0.5g/L重铬酸钾溶液逐级稀释汞贮备液而成。 2. 仪器和设备 2.1原子荧光分光光度计及相应的辅助设备。 2.2中流量采样器。 2.3烟尘采样器。 2.4玻璃纤维滤筒。 2.5过氯乙烯滤膜。 四、采样要求或样品与处理技术 4.1采集 中流量采样器，玻璃纤维滤膜过滤直径8㎝时。以50～150L/min流量，采样30～60m3。采样应将滤膜毛面朝上，放入采样夹中拧紧。采样后小心取下滤膜尘面朝里对折两次叠成扇形，放回纸袋中，并详细记录采样条件。 4.2试料溶液 4.2.1硝酸-过氧化氢溶液浸出法 取试样滤膜，置于高兴烧杯中，加入10ml硝酸-过氧化氢混合溶液浸泡2h以上，微火加热至沸腾，保持微沸10min，冷却后加入过氧化氢10ml，沸腾至微干，冷却，加硝酸溶液20ml，再沸腾10min，热溶液通过多孔玻璃过滤器，收集于烧杯中，用少量热硝酸溶液冲洗过滤器数次。待滤液冷却后，转移到50ml容量瓶中，
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法 1.1.常量肉汤稀释法 1.1. 1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如 1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。 抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如： 需配制100ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为 182.6mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml） /1280μg/ml= 107.0ml，然后将 182.6 mg抗生素粉剂溶解于 107.0ml稀释剂中。 制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1. 3.培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH 7.2~
7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。 嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.1. 4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至 0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成 0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1. 5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入 1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为 256、128、 64、32、
流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）
抑菌圈法测量抑菌活性 1．无菌条件下取保存于-80℃的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、李氏杆菌、猪丹毒、植物乳酸菌、戊糖乳酸杆菌菌种划线于固体琼脂平板上，37℃培养，挑取单个菌落，连续传代2次，保存备用。 2．取活化后的不同菌种接种于相应的培养基中，其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌接种于LB培养基中，37℃摇床培养至对数生长期。链球菌、李氏杆菌、猪丹毒、巴斯杆菌接种于LB培养基中(加入5%的血清)，37℃摇床培养至对数生长期。植物乳酸菌和戊糖乳杆菌接种于MRS培养基中，37℃静置培养至对数生长期。 3．取对数生长期的各种细菌10 μL加入到1mL相应的培养基中混匀，涂于琼脂平板，待菌液稍干后，在每个平板中放入2个牛津杯，其中一个牛津杯中加入200 μL复性超滤浓缩的1 mg/mL重组蛋白，另一个牛津杯中加入最后一次透析液作为对照，每种菌做三个重复。 4．将琼脂平板放入37℃温箱中培养，细菌长满平板后用镊子小心的取出牛津杯，测量清晰地抑菌圈直径。 2.2.9.2 最小抑菌浓度测定(MIC) 1．菌悬液制备：取2.2.8.1中活化的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、李氏杆菌10uL接种于相应的5mL培养基中，37℃摇床培养至对数生长期。 2．平板活菌计数：用生理盐水将培养至对数生长期的各种细菌做10倍比稀释，混匀后选择10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10六个稀释度接种平板，每个稀释度做三个重复，每板接种100uL，并将之在平板上涂布均匀，37℃培养16 h，选择菌落数在30至300的稀释度，计算其菌落数的平均值，并按其稀释倍数计算出培养液中的活菌数量。 3．乳铁蛋白溶液的制备：将2.2.7.2方法中复性的蛋白进行超滤浓缩，并用2.2.7.3方法进行蛋白浓度的测定，使其终浓度达到4mg/mL。 4．乳铁蛋白对各种细菌的MIC值：取灭菌的干净离心管25支，分成五组，每组5个，编号1～5，将五种细菌培养至对数生长期，再将其稀释至105/mL，每个离心管中加入0.5 mL。再向每组的第一个离心管中加入0.5 mL浓度为4mg/mL的猪乳铁蛋白制备液，混匀后取0.5 mL加入到第二个离心管中，同样的方法一直稀释到第五个离心管中，1～5管中重组蛋白的浓度分别2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，37℃作用18 h，观察结果，以无细菌生长的最低浓度为MIC值。
烟气监测系统计算公式： 1. 流量 1.1原烟气流量（湿态） 【未用】 1.2净烟气流量 1.2.1工况下的湿烟气流量s Q ： s s V F Q ??=3600 s Q ――工况下的湿烟气流量，h m 3； F ――监测孔处烟道截面积，2m ； s V ――监测孔处湿烟气平均流速，s m /。 1.2.2监测孔处湿烟气平均流速s V : s V = 流速仪输出值 1.2.3标准状态下干烟气流量sn Q ： )1(273273101325sw s s a s sn X t P B Q Q -+?+?= sn Q ――标准状态下干烟气流量，m 3； sw X ――烟气湿度。 1.2.4烟气排放量 ∑=?=n i sni h Q n Q 1)1( ∑==24 1i hi d Q Q ∑==31 1i di m Q Q ∑==121i mi y Q Q 式中， Q h ——标准状况下干烟气小时排放量，m 3；
Q d ——标准状况下干烟气天排放量，m 3； Q m ——标准状况下干烟气月排放量，m 3； Q y ——标准状况下干烟气年排放量，m 3； Q sni ——标准状况下，第i 次采样测得的干烟气流量，m 3/h ； Q hi ——标准状况下，第i 个小时的干烟气小时排放量，m 3/h ； Q di ——标准状况下，第i 天的干烟气天排放量，m 3/h ； Q mi ——标准状况下，第i 个月的干烟气月排放量，m 3/h ； n ——每小时内的采样次数。 2.烟气湿度sw X ： 222O O O sw X X X X '-'= 2O X ――湿烟气氧量，%； 2O X '――干烟气氧量，%。 3.过量空气系数α'： 2 2121O X -='α 4.烟尘 4.1.1标准状态下干烟气的烟尘排放浓度 程截距烟尘方程斜率＋烟尘方.dust dust C C ''=' 式中， dust C ''——实测的烟尘排放浓度，mg/m 3; dust C '——标准状态下干烟气烟尘排放浓度，mg/m 3。 4.1.2折算的烟尘排放浓度 α α'?'=dust dust C C 式中， dust C ——折算成过量空气系数为α时的烟尘排放浓度； dust C '——标准状态下干烟气烟尘排放浓度，mg/m 3； α' ——实测的过量空气系数；
细胞生长状况有关指标的检测方法 一、细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为细胞计数板。巴氏吸管和显微镜。步骤如下。 l 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干。 l 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。 l 在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。 细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100% 在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。 二、细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。 测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。 也可采用MTT法来进行生长曲线测定。 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)|琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 1.培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。 2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。 3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。 4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
煤中汞的分析测定方法 汞是一种具有严重生理毒性的全球性污染物。汞一旦释放进入生态环境（尤其是水生与湿地生态环境），无机汞可以被转化为毒性更强的甲基汞，甲基汞的脂溶性和较长的半衰期使其在鱼和其它水生生物体内具有极高的生物富集系数(104以上)，并通过食物链富集起来，进而置野生生物和人类于甲基汞暴露风险之中[1]。工业革命以来，由于人为释汞源使大气中汞是工业革命前的3倍，而最大的人为释汞源即为煤燃烧，每年向大气释放约810吨汞[2],超过所有人为释汞源排汞的三分之二[3]。准确分析测定煤中汞的含量是估算我国煤燃烧释汞量的基础。 我国目前分析测定煤中汞的方法是于2009年5月1日实施的GB/T 16659-2008。但笔者认为该方法由于在煤样消解过程中使用大量的V2O5为催化剂消解煤样[4]，但国内生产的V2O5含汞空白一般较高（？？），有的甚至是煤实际含汞量的30-50%（？），因此严重影响了煤样中汞的分析测定。因此有必要建立更为可靠的分析测定方法。 本文通过对比GB/T 16659-2008的V2O5催化消解煤样原子荧光分析法，王水常温消解煤样原子荧光分析法及煤样直接热解原子吸收分析法分析测定了煤标样及一些煤样，得出较好的结果。 1.材料及仪器 2.样品消解及分析方法 3.结果与讨论 4.结论 实验部分 1 冷原子荧光分光光度法 1.1分析仪器与试剂
1.1.1 分析仪器:金丝捕汞管，冷原子荧光分光光度计，分析天平：感量0.1mg，汞蒸气发生瓶（50ml），振荡器 1.1.2 试剂:优级纯浓硝酸；优级纯浓盐酸；12% 盐酸羟胺溶液; 10% SnCl2溶液 BrCl 溶液: 11. 0 g 分析纯KBrO3 和15.0 g 分析纯KBr 溶于200 mL 蒸馏去离子水中, 轻轻搅拌溶液, 同时缓慢加入700 mL 优级纯浓HCl。整个操作应在通风橱内进行。冷却后, 装入棕色瓶中, 放置阴凉处保存。 王水：按浓盐酸：浓硝酸=3:1，配制。加入硝酸时，缓慢搅拌溶液。整个操作应在通风橱内进行。静置1-2小时后，放置阴凉处保存。 1.2除汞方法 将新配好的氯化亚锡溶液置于还原瓶中, 以0. 5 L/ min 的速度通入不含汞的氮气12 h, 装瓶备用。 1.3化学试剂及器皿的汞空白 汞空白值0.05 0.04 1.4 煤样消解 称取粒度小于0.2mm的空气干燥煤样约1g，称准到0.0002g，于50ml离心管中。加入事先配制好的王水10ml，摇匀，静置24h。第二天将加有试剂的离心管放入振荡器内，拧紧离心管盖子，转速调到220-240转/分，两小时后关闭振荡器，取下离心管。加入1ml BrCl，摇匀，用去离子水定容到50ml。 1.5溶液过滤 在铁架台上用漏斗和中速滤纸，过滤离心管中溶液。滤过后溶液用新离心管盛放。 1.6样品测定 冷原子荧光光度计设备开机，运行20分钟，测噪声。低于40分贝时开始吹扫金管中富集
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(ＭIC)
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期: ?
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MＩC)|琼脂稀释 法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中,制成含不同递减浓度抗菌药物的平板,接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MＩC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定,结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 1.培养基制备 使用MH琼脂,按商品说明书进行配制，ｐH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用ＧC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含５%(V/V)绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时,使用溶解的马血)。 2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解,并在45~50℃水浴中平衡的ＭH琼脂中,充分混匀倾倒灭菌平皿,琼脂厚度3~4mm。通常按１∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。 3.接种物制备与接种 制备浓度相当于０．5麦氏标准比浊管的菌悬液,再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μｌ）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CＦU，形成直径为５~8mm的菌斑。接种好后置３５℃孵育16~２0h(甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。 4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点,以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长,与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
环境空气汞的测定巯基棉富集-冷原子荧光分光光度法1.适用范围 本标准规定了测定环境空气中汞及其化合物的巯基棉富集-冷原子荧光分光光度法。 本标准适用于环境空气中汞及其化合物的测定。 本标准方法检出限为0.1ng/10ml试样溶液。当采样体积为15 L时，检出限为6.6×10-6mg/m3，测定下限为2.6×10-5mg/m3。 2规范性引用文件 本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。 HJ/T 194 环境空气质量手工监测技术规范 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3方法原理 在微酸性介质中，用巯基棉富集环境空气中的汞及其化合物。无机汞反应式如下： 有机汞反应式如下： 元素汞通过巯基棉采样管时，主要为物理吸附及单分子层的化学吸附。 采样后，用4.0 mol/L盐酸-氯化钠饱和溶液解吸总汞，经氯化亚锡还原为金属汞，用冷原子荧光测汞仪测定总汞含量。 4试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。水，GB/T 6682，二级。4.1 高纯氮气：?=99.999%。 4.2 重铬酸钾（K2Cr2O7）：优级纯。 4.3 硫酸：ρ (H2SO4)=1.84 g/ml，优级纯。 4.4 盐酸：ρ (HCl)=1.19 g/ml，优级纯。 4.5 硝酸：ρ (HNO3)=1.42 g/ml，优级纯。 4.6 重铬酸钾溶液：w(K2Cr2O7)=1.0%。 称取1.0 g的重铬酸钾（4.2），溶于水，稀释到100 ml。 4.7 硫酸溶液：(H2SO4)=10%。 量取10 ml的浓硫酸（4.3），缓慢加入90 ml水中。 4.8盐酸溶液：c(HCl)=4.0 mol/L。 量取123 ml盐酸（4.4），用水稀释至1 000 ml，混匀。 4.9 盐酸溶液：c(HCl)=2.0 mol/L。 量取12 ml盐酸（4.4），用水稀释至1 000 ml，混匀。 4.10 盐酸溶液：pH=3。 吸取2.0 mol/L 盐酸（4.9）0.50 ml，用水稀释至1 000 ml，混匀。
烧一吨煤，产生1600×S%千克SO2，1万立方米废气，产生200千克烟尘。 烧一吨柴油，排放2000×S％千克SO2，万立米废气；排放1千克烟尘。 烧一吨重油，排放2000×S％千克SO2，万立米废气；排放2千克烟尘。 大电厂，烟尘治理好，去除率超98%，烧一吨煤，排放烟尘3-5千克。 普通企业，有治理设施的，烧一吨煤，排放烟尘10-15千克； 砖瓦生产，每万块产品排放40-80 千克烟尘；12-18千克二氧化硫。 规模水泥厂，每吨水泥产品排放3-7千克粉尘；1千克二氧化硫。 乡镇小水泥厂，每吨水泥产品排放12-20千克粉尘；1千克二氧化硫。 物料衡算公式： 1吨煤炭燃烧时产生的SO2量＝1600×S千克；S含硫率，一般。若燃煤的含硫率为1%，则烧1吨煤排放16公斤SO2 。 1吨燃油燃烧时产生的SO2量＝2000×S千克；S含硫率，一般重油%，柴油。若含硫率为2%，燃烧1吨油排放40公斤SO2 。 ¬排污系数：燃烧一吨煤，排放万标立方米燃烧废气，电厂可取小值，其他小厂可取大值。燃烧一吨油，排放－万标立方米废气，柴油取小值，重油取大值。 【城镇排水折算系数】 ~，即用水量的70-90%。 【生活污水排放系数】采用本地区的实测系数。。 【生活污水中COD产生系数】60g/人.日。也可用本地区的实测系数。 【生活污水中氨氮产生系数】7g/人.日。也可用本地区的实测系数。使用系数进行计算时，人口数一般指城镇人口数；在外来较多的地区，可用常住人口数或加上外来人口数。 【生活及其他烟尘排放量】 按燃用民用型煤和原煤分别采用不同的系数计算： 民用型煤：每吨型煤排放1~2公斤烟尘 原煤：每吨原煤排放8~10公斤烟尘 一、工业废气排放总量计算 1.实测法 当废气排放量有实测值时，采用下式计算：
第四章白细胞检验的基本方法 第一节白细胞功能的检验 一、墨汁吞噬试验 【目的】掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。 【实验原理】墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。 【材料】 1．器材试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。 2．试剂 （1）肝素：配成6U/ml水溶液。 （2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min 研磨3min。所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。 （3）瑞氏染液等。 【方法步骤】 1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。 2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。 3．置37℃温育4h。 4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。 5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。 6．判断结果根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度： 阴性：细胞内未见吞噬墨粒。 阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。 (++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。 (+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。 (++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。 7．计算吞噬率及吞噬指数 吞噬率（%）= ×100% 吞噬指数= 【注意事项】肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。【参考范围】 成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186； 成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。 【临床意义】临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有吞噬能力。AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。 二、白细胞吞噬功能试验 【目的】掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。 【实验原理】白细胞吞噬功能试验（leukophagocytic function test），是将待测的白细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观
FHZHJDQ0105 环境空气氯化氢的测定硫氰酸汞分光光度法 F-HZ-HJ-DQ-0105 环境空气—氯化氢的测定—硫氰酸汞分光光度法 1 范围 本方法可用于空气中氯化氢的测定。5mL样品溶液中含2μg氯化氢，可有0.033吸光度。 本法检出限为1μg/5mL，若采样体积为200L时，最低检出浓度为 0.01mg/m3；测定范围为5mL样品溶液中含2～20μg氯化氢，若采样体积为200L时，可测浓度范围为0.02～0.40mg/m3。 2 原理 空气中氯化氢吸收在碱溶液中，在酸性溶液中与硫氰酸汞反应置换出硫氰酸根，再与高铁离子作用生成硫氰酸铁红色化合物，比色定量。 3 试剂 所有试剂均用蒸馏水或去离子水配制。 3.1 吸收液：0.05mol /L氢氧化钠溶液。 3.2 无水乙醇。 3.3 硫氰酸汞-乙醇溶液：称取0.4g硫氰酸汞用无水乙醇溶解成 100mL。 3.4 高氯酸：70％～72％。 3.5 硫酸铁铵溶液：称取6g硫酸铁铵用（1＋2）高氯酸溶解成100mL。 3.6 标准溶液：准确称量0.2045g经105℃干燥2h的氯化钾（一级），用水溶解后，移入1000mL 容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液1.00mL含0.1mg氯化氢。再用吸收液稀释成1.00mL含10μg 氯化氢的标准溶液。 4 仪器 4.1 气泡吸收管：普通型，有10mL刻度线。 4.2 空气采样器：流量范围0.2～3L/min，流量稳定。使用时，用皂膜流量计校准采样系列在采样前和采样后的流量误差应小于5％。 4.3 具塞比色管，10mL 4.4 分光光度计，用20mm比色皿，在波长460nm下，测定吸光度。 5 采样 串联两个各装10mL吸收液的普通型气泡吸收管，以2.5L/min流量采气200L。长时间采样，需用水补充到原体积。 6 操作步骤 6.1 标准曲线的绘制 按下表制备标准色列管。 0 1 2 3 4 5 6 7 标准溶液V/mL 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.50 2.00 吸收液V/mL 5.0 4.80 4.60 4.40 4.20 4.00 3.50 3.00 氯化氢含量m/μg 0 2 4 6 8 10 15 20 于标准色列各管中加入2mL硫酸铁铵溶液，混匀。加入1mL硫氰酸汞-乙醇溶液，混匀。 在室温下放置10～30min。用20mm比色皿，以水作参比，在波长460nm下，测定各管溶液 吸光度。以氯化氢含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归线的斜率。以斜率倒数作为样品测定的计算因子B S（μg）。 6.2 样品测定
渗透压摩尔浓度测定方法 生物膜，例如人体的细胞膜或毛细血管壁，一般具有半透膜的性质，溶剂通过半透膜由低浓度溶液向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗透所需施加的压力，即为渗透压。在涉及溶质的扩散或通过生物膜的液体转运各种生物过程中，渗透压都起着极其重要的作用。因此，在制备注射剂、眼用液体制剂等药物制剂时，必须关注其渗透压。处方中添加了渗透压调节剂的制剂，均应控制其渗透压摩尔浓度。 静脉输液、营养液、电解质或渗透利尿药（如甘露醇注射液）等制剂，应在药品说明书上标明其渗透压摩尔浓度，以便临床医生根据实际需要对所用制剂进行适当的处置（如稀释）。正常人体血液的渗透压摩尔浓度范围为285～310mOsmol/kg ，0.9％氯化钠溶液或5％葡萄糖溶液的渗透压摩尔浓度与人体血液相当。 溶液的渗透压，依赖于溶液中溶质粒子的数量，是溶液的依数性之一，通常以渗透压摩尔浓度（Osmolality ）来表示，它反映的是溶液中各种溶质对溶液渗透压贡献的总和。 渗透压摩尔浓度的单位，通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压摩尔来表示，可按下列公式计算毫渗透压摩尔浓度（mOsmol/kg ）： 1000n m Osm ol/kg ??=分子量的克数每千克溶剂中溶解溶质）毫渗透压摩尔浓度（ 式中，n 为一个溶质分子溶解或解离时形成的粒子数。在理想溶液中，例如葡萄糖n=1，氯化钠或硫酸镁n=2，氯化钙n=3，枸橼酸钠n=4。 在生理范围及稀溶液中，其渗透压摩尔浓度与理想状态下的计算值偏差较小；随着溶液浓度的增加，与计算值比较，实际渗透压摩尔浓度下降。例如0.9％氯化钠注射液，按上式计算，毫渗透压摩尔浓度是2×1000×9/58.4=308mOsmol/kg ，而实际上在此浓度时氯化钠溶液的n 稍小于2，其实际测得值是286mOsmol/kg ；复杂混合物，如水解蛋白注射液的理论渗透压摩尔浓度不容易计算，因此通常采用实际测定值表示。 1.渗透压靡尔浓度的测定
中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 543—2009 固定污染源废气汞的测定 冷原子吸收分光光度法(暂行) Stationary source emission-Determination of mercury- Cold atomic absorption spectrophotometry 本电子版为发布稿。请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。 2009-12-30发布 2010-04-01实施 环 境 保 护 部 发 布
目次 前言..............................................................................................................................................II 1 适用范围 (1) 2 规范性引用文件 (1) 3 方法原理 (1) 4 干扰 (1) 5 试剂和材料 (1) 6 仪器和设备 (3) 7 样品 (3) 8 分析步骤 (3) 9 结果计算 (4) 10 质量保证和质量控制 (5)
前言 为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国大气污染防治法》，保护环境，保障人体健康，规范固定污染源废气中汞的监测方法，制定本标准。 本标准规定了测定固定污染源废气中汞的冷原子吸收分光光度法。 本标准由环境保护部科技标准司组织制订。 本标准起草单位：北京市环境保护监测中心。 本标准环境保护部2009年12月30日批准。 本标准自2010年4月1日起实施。 本标准由环境保护部解释。
抗菌药物最小抑菌浓度的测定 一、概念：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。 二、实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对----菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。 三、仪器和试剂： 四、检验方法：液体稀释法、琼脂稀释法、E试验（E test）液体稀释法操作步骤：
1..抗菌药物原液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。 所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表1。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20℃环境，并注意抗菌药物的保存期限。 表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 3.培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接
空气中气态汞的测定 吴志刚 宜安职业安全技术有限公司江苏宜兴214206 摘要：冷原子吸收光谱法测定空气中汞时，对实验中易出现的问题提出了相应解决方法，对分析方法的正确使用，起到一定作用。 关键词：冷原子吸收光谱法；空气中汞；吸光值 前言：汞在自然界分布极少，常温、常压下以液态存在的金属。常温下蒸发出汞蒸气，汞及其化合物有剧毒，可在体内蓄积。吸入或接触后，可使人导致肝、脑损伤。工业慢性中毒，可发生口腔炎和中毒性脑病。随着工业的发展，对于职业病危害因素的检测变得越来越重要。目前工作场所空气中汞及其化合物测定方法是国家职业卫生标准GBZ/T160.14-2004，笔者仅在原方法的基础上进行了探讨。 1实验部分 1.1方法原理 汞原子对波长253.7nm的紫外光具有最大吸收，在一定范围内，吸收值与汞蒸气浓度成正比。空气中汞由酸性高锰酸钾吸收，加入氯化亚锡还原为汞单质，载气带入冷原子测汞仪，测定吸收值，标准曲线定量。 1.2仪器：NCG-1冷原子吸收测汞仪 10ml翻泡瓶，干燥管，内填变色硅胶，橡皮管 1.3试剂：
实验用水为去离子水，用试剂为优级纯。 硫酸，ρ20＝1.84g/ml。 硝酸，ρ20＝1.42g/ml。 高锰酸钾溶液，3.16g/L。 硫酸溶液A，1.8mol/L：取100m l硫酸慢慢加入到900ml 水中。 硫酸溶液B，0.18mol/L：取10ml 硫酸慢慢加入到990ml 水中。 硝酸溶液，0.8mol/L：10ml 硝酸加入到190ml 水中。 汞吸收液：临用前，取100ml 高锰酸钾溶液与100ml 硫酸溶液A等体积混合。 汞保存液：称取0.1g 重铬酸钾，溶于1L硝酸溶液中。 盐酸羟胺溶液，200g/L 氯化亚锡溶液：称取10g 氯化亚锡，溶于硫酸溶液B中并稀释至50ml，临用前配制。 标准溶液：用国家认可的标准溶液GSB-1729-2004浓度1000μg/mL；临用前稀释成0.1 μg/mL。 1.4实验方法 1.4.1校正lng/ml—5ng/ml的标准曲线，方法如下： 调节调零电位器使数字显示0 0 0，按下保持常规钮，打开翻泡瓶盖，用移液管在瓶内加入0.3ml浓度为0.1ug/m1的汞标液，再加入8ml 蒸馏水，2ml 10%氯化亚锡溶液，随即盖好翻泡瓶，载气将瓶内的汞蒸汽带入吸收池，电路记录吸收峰值，通过显示器显示，并被保持，调节显示调节钮，使显示的数值为0 6 0，然后按一下复零钮，使显
活细胞内钙离子浓度 的检测
钙离子—第二信使 钙离子在信号传导通路中发挥第二信使作用。 在细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要活动中，均需要钙离子的参与及调节。 钙离子的信使作用是通过其浓度的升高或降低来实现的。 细胞内游离钙离子的浓度是10-8---10-7M，比细胞外钙离子浓度低104---105倍，当细胞受到特异性信号刺激后，细胞内钙库（内质网、肌浆网）的钙通道或质膜上的钙通道开放，使细胞内钙离子浓度快速升高，产生钙信号，进而使细胞内某些酶的活性和蛋白质功能发生改变，产生细胞效应。
荧光钙离子测定技术发展简史 荧光钙离子浓度测定中常用的指示剂 荧光钙离子测定常用仪器 荧光钙离子测定的原理及具体方法
荧光钙离子测定技术发展简史 In 1920s 许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定许多学者开始着手进行钙离子浓度的测定。。 1962年，Shimomura 等首次分离出水母蛋白作为钙激活蛋白检测Ca 2+浓度浓度，，但其发光高峰较相应生理过程出现慢但其发光高峰较相应生理过程出现慢，，且分子量大且分子量大，，通过细胞膜及在胞浆内扩散的能力较差浆内扩散的能力较差，，难于反映细胞内Ca 2+浓度的动态变化浓度的动态变化。。 1967年Ross 使用离子选择性微电极直接测定细胞内Ca 2+水平水平，，该方法简便该方法简便，，但反应时间长但反应时间长，，只能测定静息状态下的Ca 2+水平水平。。 70年代用砷偶氮年代用砷偶氮ⅢⅢ（aresenazo Ⅲ）染色染色，，可定量分析钙离子变化可定量分析钙离子变化，，但用微注射技术将染料注入细胞内注射技术将染料注入细胞内，，故只能测大细胞的Ca 2+变化变化。。