内容提要
《微生物学实验》是配合武汉大学、复旦大学编的《微生物学》一书的实验教材。第二版做了较大修改，增添了许多新技术和方法，实验由原来的40个增至63个，并按类规纳成15个部分。每一部分冠以综合性说明，简单介绍该部分内容及其在微生物学工作中的作用。
第二版仍着重微生物学实验的基本操作和技能训练。为方便教学，每一实验基本上仍按照目的要求、基本原理、器材、操作步骤及实验报告（包括实验结果和思考题）五部分。书后附有染色液、培养基、试剂和溶液的配制方法、本书使用的菌种名称，微生物学中常用的计量单位及主要参考书目。
第二版实验内容较多，各校可根据具体条件酌情选做。
第一版前言
《微生物学实验》一书是根据1977年10月成都综合性大学生物类教材会议制定的大纲编写的。在编写过程中，为配合武汉大学、复旦大学编的《微生物学》教材，在内容上有所增加和修改。
本书共有实验40个，内容较多，其中包括与《微生物学》相配合、印证理论以及进行微生物实验所需的基本操作和技能的训练两大部分。各校可根据具体条件酌情选做。
本书为方便教学，每一实验基本上都按目的要求、基本原理、器材、操作步骤及结果与思考题等五个部分来编写的，各实验所用染料、培养基、溶液与悬液等的配制均列在附录内。
由于编者水平所限，在取材、实验方法和编排等方面肯定有不少缺点与错误，希望读者批评指正。
在编写过程中承武汉大学生物系微生物教研室基础微生物学教学小组的大力支持，武汉大学生物系陈宝联同志绘制插图，在此一并表示感谢。
范秀容沈萍
第二版前言
《微生物学实验》第一版自1980年出版以来已有七八年了，在此期间，经过多次印刷，印数已达十余万册。它在微生物学的教学和稳定教学秩序方面起了积极的作用，但是也存在不少缺点，加上近年来微生物学技术发展迅速，因此我们进行了出版第二版的修订工作。
修订内容和特点如下：
1．将繁多的实验按类归纳成15个部分，以求条理清楚，概念分明。每一部分冠以综合性说明，主要简单介绍该部分的内容，阐述其在整个微生物学工作中的作用等。再在每一部分选择有代表性的重点，列出实验，进行操作。
2．继续着重微生物学实验的基本操作和技能的训练。
3．实验内容做如下调整：
(1)为了加强学生对微生物及其应用和无菌概念重要性的认识，以及对实验工具的质量要求和洗涤方法的了解，增加了“微生物学实验室常用的器皿”、“环境中的微生物”和“食品微生物学”等部分。
(2)使一些领域的内容更加全面，例如在“显微镜的结构、性能和使用方法”部分增加了相差显微镜和电子显微镜；“微生物的纯培养”部分增加了厌氧培养；微生物的遗传方面增加了药物抗性菌的分离和细菌的接合作用等实验。
(3)适当增加新技术的介绍，例如生化反应中的微量简易诊检系统；菌种保藏中的液氮冷冻保藏法；水的微生物学检查中增加了滤膜法等。
(4)此外，在基本操作训练方面集中介绍了动物的几种不同途径的注射方法。
(5)由于“环境中的微生物”包括了空气中微生物的检查，故没有再单独设实验，此外还删去了“巴斯德效应”实验。
第二版的实验内容较多，有些内容由于实验条件和学时的限制，可作为学生日后进一步工作的参考。因此各校可根据具体条件酌情选做。
4．第二版将实验报告分为实验结果与思考题两部分。实验结果尽量采用绘图和表格形式，并要求在表格内用简单符号和数字填写，以使作业规范化，便于学生记录与教师批改。
第二版主要由范秀容、李广武、沈萍同志编写，彭珍荣同志参加编写了部分实验。
插图除沿用第一版由陈宝联同志绘制的以外，其余大部分插图由熊定荣同志绘制，个别插图由刘启融同志绘制，在此一并致谢。
由于编者的水平有限，本版的缺点和错误在所难免，尚请各位同仁和读者提出宝贵意见。
编者
1988．6．
实验须知
普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。
为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：
1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。
2．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
3．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。
4．实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
5．实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。
6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。
7．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3％来苏尔液或5％石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸泡在3％来苏尔液中进行消毒。
8．每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。
9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅。
10．离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。
Ⅰ、微生物学实验室常用的器皿
微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。本节将对这几方面作详细介绍。
一、器皿的种类、要求与应用
1．试管（test tube）
微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图Ⅰ-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图Ⅰ-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图Ⅰ-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。
试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。
（1）大试管（约18×180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。
（2）中试管（约13—15×100—150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。
（3）小试管（10—12×100mm）一般用于糖发酵试验或血清学试验，和其他需要节省材料的试验
2．德汉氏试管（Durham tube）
观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6×36mm）（图I-2），此小套管即为德汉氏试管，又称发酵小套管。
3．吸管（又称移液管，pipette）
（1）玻璃吸管（glass pipette）微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管（图I-3，A）。与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。市售细菌学用吸管，有的在吸管上端刻有“吹”字。
除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，B），来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。
（2）活塞吸管（piston pipette）主要用来吸取微量液体，故又称微量吸液器或微量加样器。其外形和结构如图Ⅰ-4，除塑料外壳外，主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的吸嘴。按动按钮，通过弹簧使活塞上下活动，从而吸进和放出液体。其特点是容量固定，使用时不用观察刻度，操作方便、迅速。国内产品一般每个活塞吸管固定一种容量，分别有5、10、20、25、50、100、200、500、1000μl等不同容量。而精制的活塞吸管每个在一定的范围内可调节几个容积，例如在5—25μl的范围内，可调节5、10、15、20、25μl五个不同的量，使用时按需要调节，但当调节固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用毕只需调换吸嘴或将吸嘴洗净，消毒后再行使用。
活塞吸管是国外70年代后半期才开始生产与应用的，近年来国内亦日益广泛应用于免疫学和使用同位素等的科学实验中。
4．培养皿（petridish）
常用的培养皿（图Ⅰ-5），皿底直径90mm，高15mm。培养皿一般均为玻璃皿盖，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养基表面干燥，例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。
在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。
5．三角烧瓶（Erlenmeyerflask）与烧杯（beaker）
三角烧瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶发酵等。常用的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用来配制培养基与药品。
6．注射器（injector）
一般有1、2、5、10、20、50ml等不同容量的注射器。注射抗原于动物体内可根据需要使用1、2和5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。
微量注射器有10、20、50、100μl等不同的大小。一般在免疫学或纸层析等实验中滴加微量样品时应用。
7．载玻片（slide）与盖玻片（cover slip）
普通载玻片大小为75×25mm，用于微生物涂片、染色，作形态观察等。盖玻片为18×18mm。
凹玻片是在一块厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-6），作悬滴观察活细菌以及微室培养用。
8．双层瓶（double bottle）
由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-7），内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时
9．滴瓶（dropper bottle）
用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-8）。
10．接种工具
接种工具有接种环（inoculating loop）、接种针（inocula-ting needle）、接种钩（inoculating hook）、接种铲（inocula-ting shovel）、玻璃涂布器（glass spreader）等（图Ⅰ-9）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍丝的直径以0．5mm为适当，环的内径约2mm，环面应平整。接种某些不易和培养基分离的放线菌和真菌，有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要求粗一些，约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻棒弯曲或将玻棒一端烧红后压扁而成。
二、玻璃器皿的清洗方法
清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。现分述如下：
1．新玻璃器皿的洗涤方法
新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2％的盐酸或洗涤液（见本小节“3”）。浸泡后用自来水冲洗干净。
2．使用过的玻璃器皿的洗涤方法
(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架（图Ⅰ-10）上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。
玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。
装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0．25％新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。
盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。
(2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。量筒或标本瓶底部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。
吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2％煤酚皂溶液或0．25％新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。
吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。
(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5—10分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0．5—2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95％酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。
检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在2％煤酚皂溶液或0．25％新洁尔灭溶液中浸泡24小时，然后按上法洗涤与保存。
3．洗涤液的配制与使用
浓溶液重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g
自来水 150ml
浓硫酸（工业用） 800ml
稀溶液重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g
自来水 850ml
浓硫酸（工业用） 100ml
配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。
配好后的洗涤液应是棕红色或桔红色。贮存于有盖容器内。
（2）原理重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸（chro-mic acid），酪酸的氧化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。
（3）使用注意事项（a）洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌到时忘记将器皿取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即用水洗，再用苏打水或氨液洗。如果溅在桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去；（b）玻璃器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；（c）此液的使用仅限于玻璃和瓷质器皿，不适用于金属和塑料器皿；（d）有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是因为有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污迹都可清除；（e）盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；（f）洗涤液可反复使用，但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。
三、空玻璃器皿的包装
1．培养皿的包装
培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5—8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行于热灭菌。如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图Ⅰ-11），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。
2．吸管的包装
准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0．5cm处，塞一小段约1．5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角（图I-12），并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。
如果有装吸管的铜筒（图Ⅰ-13），亦可将分别包好的吸管一起
装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用手持粗端拔出。
3．试管和三角烧瓶等的包装
试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十九），然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。
空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。
如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。
Ⅱ．环境中的微生物
因为微生物是肉眼看不见的，所以初学微生物学的学生常不知道外界环境和所有与外界接触的身体各部位均有微生物的存在。实际上它们广泛分布于室内外的空气、水和土壤中，
因此，可以说微生物是无缝不钻，无孔不入的。在学生第一次进入微生物学实验室时，建立起“微生物无所不在”这一概念是特别重要的，因为这样才能体会到无菌技术和环境卫生的必要性，才能防止外界微生物对培养物的污染，才能防止病原性细菌或病毒通过手或衣服进入人体而引起传染。
从周围环境和体表各部取样生长出来的微生物，虽然大多数属正常菌群，但当进入破损的皮肤或传入口内或眼睛等处也会引起传染，这一方面是因为通过培养，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但当条件改变时也可能致病（称为条件致病菌），因此必须详细阅读操作步骤和听从指导者的说明，特别是用过的棉签和工作完毕后的培养物等均要放在指定的容器内，接种环不仅在用前必须烧灼灭菌，而且用后也应立即烧灼。这是整个微生物学实验课程和今后进行微生物学实验时均需注意的。
下面的实验就是从实验室空气、实验台、门的旋扭（或把手）和人的头发、皮肤、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等处取样，接种于琼脂平板上，经培养1—2天后，观察并比较不同来源的微生物生长的数量和类型。
实验一实验室环境和人体表面微生物的检查
一、目的要求
1．证明实验室环境与体表存在微生物。
2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。
3．体会无菌操作的重要性。
二、基本原理
平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37℃温度下培养，1—2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。
三、器材
肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。
四、操作步骤
每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。
1．写标签
任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。
2．实验室细菌检查
（1）空气将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。
（2）实验台和门的旋钮
（a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图Ⅱ-1。
（b）取棉签左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出（图Ⅱ-2，B），将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出（图Ⅱ-2，C）。放回棉塞（或试管帽）（图Ⅱ-2，D），并将空试管放在试管架上。
（c）弄湿棉签左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。
（d）取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2平方厘米的范围。
（e）接种按图Ⅱ-3，A在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（图Ⅱ-3，B），立即闭合皿盖。并按图Ⅱ-2，E 和F，将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。
（f）划线另取接种环在火焰上灭菌，如图Ⅱ-4，先将环端烧热（图Ⅱ-4，1），然后将接种环提起垂直放在火焰上（图Ⅱ-4，2），以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次（图Ⅱ-4，3）。
左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处（图Ⅱ-3，C）。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。
闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按图Ⅱ-3，D从上向下来回划线至1／2处。
烧灼接种环，转动平板，按图Ⅱ-3，E，划最后1／4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。
整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。
3．人体细菌的检查
（1）手指（洗手前与洗手后）
（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。
（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。
（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。
（2）头发在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。
（3）咳嗽将去盖琼脂平板放在离口约6—8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。
（4）鼻腔
（a）按照实验台检查法的步骤（b）和（c），取出棉签，并将其弄湿。
（b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。
（c）按实验台检查法的步骤（e）和（f），接种与划线，然后盖上皿盖。
4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37℃培养箱，培养1—2天。
5．结果记录方法
（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。
（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。
菌落特征描写方法如下：
（a）大小大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。
（c）干湿情况干燥、湿润、粘稠。
（d）形态圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。
（f）透明程度透明、半透明、不透明。
（g）边缘整齐、不整齐。
五、实验报告
1．结果
（1）将你自己的平板结果记录于下表中。
（2）与其他同学所做的结果进行比较。
2．思考题
（1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？
（2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？
（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？
（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？
Ⅲ．显微镜的构造、性能和使用方法
由于微生物个体细小，因此我们必须用显微镜来研究它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜和掌握显微镜的操作技术是研究微生物不可缺少的手段。
现代显微镜一般可以分为两大类，一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型，现列表如下：
本部分包括普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和电子显微镜四个实验。目的在于使同学们通过这四个实验，对两种类型的显微镜有较全面的了解，并重点掌握明视野普通光学显微镜的使用。对于电子显微镜则着重了解其工作原理，并要求掌握制作电子显微镜标本的基本技术。
实验二普通光学显微镜
一、目的要求
1．熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2．学习并掌握油镜的原理和使用方法。
二、显微镜的基本构造
显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图Ⅲ-1）。
1．机械装置
镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。
镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。
转换器（no sepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装3—4个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。
载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。
调焦装置是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。
2．光学系统
物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0．30；10×；160/0．17；16mm。其中“NA0．30”表示数值孔径（numerical aperture，简写为NA），“10×”表示放大倍数，“160/0．17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。
目镜（ocular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。镜把物镜造成的像再次放大，
物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。
聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm）组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到1．0。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。
光源（light source）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。
滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。
3．成像原理
普通光学显微镜的成像原理如图Ⅲ-2所示。
三、油镜物镜的基本原理
微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI （oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。
使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度（图Ⅲ-4）。
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：
NA＝n·sinα
式中 NA=数值孔径；
n=介质折射率；
α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。
因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则：
以空气为介质时：
NA=1×0．87=0．87
以水为介质时：
NA=1．33×0．87=1．15
以香柏油为介质时：
NA=1．52×0．87=1．32
显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。
式中λ=光波波长。
我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的
因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。
四、器材
显微镜，显微镜灯，香柏油，二甲苯；
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）染色玻片标本，
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）染色玻片标本。
五、操作步骤
1．观察前的准备
（1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3—4cm。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。
（2）调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。
调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。
2．低倍镜观察
检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。
将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约 0．5cm处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。
3．高倍镜观察
将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物
像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。
4．油镜观察
（1）用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。
（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
（3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。
（4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。
（5）用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。
（6）观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。（7）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
六、实验报告
1．结果
分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。
2．思考题
（1）在使用高倍镜和油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？
（2）用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？
（3）在明视野显微镜下，观察细菌形态时，你认为用染色标本好，还是用未染色的活标本好，为什么？
实验三暗视野光学显微镜
一、目的要求
1．了解暗视野显微镜的基本原理及用途。
2．学习并掌握使用暗视野显微镜观察微生物样品的基本技术。
二、基本原理
生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。暗视野显微镜的原理与来自缝隙的一束强光通过暗室时，可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的，即给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品上反射或折射的光进入物镜，那么，在漆黑的视野中，由于反差增大了，使样品能够看得更清楚。因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体，故在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。
暗视野显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器，在聚光器的下方中央为圆形黑盘所遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光可进入物镜，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。如无暗视野显微镜时，只需将明视野显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可；也可在明视野显微镜聚光器下面的滤光镜支架上放一片星形挡板（star diaphragm）（图Ⅲ-6）构成暗视野，这种方法适用于低倍镜观察。
在暗视野中，由于有些活细胞其外表比死细胞明亮，所以暗视野也被用来区分死、活细胞，此技术现已被用于各种酵母细胞的死、活鉴别。此外，暗视野显微镜对于观察娇弱的微生物，如梅毒密螺旋体（Treponema pallidum）特别有用。
三、器材
酿酒酵母（Saccharomy-ces cerevisiae）；
四、操作步骤
1．选厚薄在1．0—1．2mm的干净载玻片一块，滴上酿酒酵母悬液，加盖玻片（注意切勿有气泡存在）。
2．将聚光镜光圈调至1．4。
3．光源的光圈孔调至最大。
4．在聚光器上放一大滴香柏油，将标本置载物台上，旋上聚光器使油与载玻片接触（不能有气泡发生）。
5．用低倍物镜及7×目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点（图Ⅲ-7），光点愈小愈好，由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。
6．换上所需目镜和高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。
7．在盖玻片上滴一滴香柏油，并将油镜转至应在位置调节配光，进行观察。
五、注意事项
1．进行暗视野观察时，聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射，达不到被检物体，从而不能得到暗视野照明。
2．在进行暗视野观察标本前，一定要进行聚光镜的中心调节和调焦，使焦点与被检物体一致。
3．由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大（ NA=1．2—1．4），焦点较浅，因此，过厚被检物体无法调在聚光镜焦点处，一般载玻片厚度为1．0mm左右，盖玻片厚度宜在0．16mm 以下，同时载玻片、盖玻片应很清洁，无油脂及划痕，否则都会严重地扰乱最终的像。
六、实验报告
思考题
（1）观察活细胞的个体形态，你认为用显微镜的明视野好？还是暗视野好？为什么？
（2）你所观察到的酿酒酵母，在暗视野中能否区分死、活细胞？
（3）暗视野观察时，所用的载玻片、盖玻片有何要求？为什么？
实验四相差显微镜
一、目的要求
1．了解相差显微镜的基本原理和用途。
2．学习掌握相差显微镜的操作技术。
二、基本原理
暗视野显微镜可以看到活细胞的外部形态，但是看不清内部结构。相差显微镜不仅能观察活细胞的形态，而且还能看到细胞内部结构以及细胞分裂的连续过程。
光线通过透明物体如活细菌细胞后，由于受透明物体中密度和折射率不同的物质的影响，部分光线变成了绕射光，光波的相位发生变化，而这种相位差不表现为明暗和颜色上的差异，不能在显微镜视野中观察到。相差显微镜就是将经过透明物体的直射光延迟或提前，并和绕射光产生干涉，使相位差变为振幅差。如果产生的干涉为相长干涉（图Ⅲ-8，R组光线），则振幅的同相量相加而变大，我们便看到较亮的部分；如果所产生的干涉为相消干涉时（如图Ⅲ-8，S组光线），则振幅异相量相消而变小，这部分就变得较暗。这样，变相位差为振幅差的结果，使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，能更清晰地观察活细胞的细微结构。
相差显微镜成像原理和装置如图Ⅲ-9所示。
在普通光学显微镜上增加下列四种附件就成为相差显微镜：
（1）环状光阑
相差显微镜的聚光镜光阑是环状光阑。照明光线只能从环状的透明区进入聚光镜再斜射到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光镜）。大小不同的环状光阑成一转盘（图Ⅲ-10，A），安装于聚光镜下面，更换放大率不同的物镜时，要同时更换与其相应的光阑。
（2）相差物镜（镜头上标有PC或PH字样）
物镜的后焦平面上装有相板，这是相差显微镜的主要装置。相板上和环状光阑相对应的环状部分大多数是涂的吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来的光线，绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，光强度减弱，相位也适当改变。一般所用的相板推迟相位1/4，吸收80％的直射光，这样，就使直射光和绕射光的强度接近，而相位差则增大或减少。由于透明标本内部构造的折射率不同，产生绕射光的相位就会有不同程度的推迟，绕射光和直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。
（3）绿色滤光片
为了获得良好的相差，最好用单色光线照明，一般选用绿色光线。
（4）合轴调整望远镜
为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上，必须拔出目镜，装上特别的低倍望远镜（图Ⅲ-10，B），使相板的暗环与环状光阑的明环合轴（图Ⅲ-11）。
三、器材
相差显微镜，1．0mm以下载玻片，0．16-0．17mm以下盖玻片；酿酒酵母水浸片，枯草芽孢杆菌水浸片。
四、操作步骤
1．将酿酒酵母水浸片置载物台上，夹好。
2．转动聚光器下面的环状光阑转盘至“0”，并将光圈开到最大。
3．通过普通目镜和低倍相差物镜（如10×）调节焦距，看清标本。
4．转动转换器，使油镜相差物镜（90×）对准标本，同时转动环状光阑转盘至40，使与所用的物镜相符。
5．用细调节器调节焦距，使物像清楚。
6．取下目镜，换上合轴调节望远镜，转动望远镜使聚光镜中的亮环和物镜中的暗环看清楚。
7．转动聚光镜左右二侧的调节杆，使两环重合。
8．取下望远镜换上目镜进行观察，每更换标本或改变不同倍数的相差物镜时，都必须依上法重新合轴调节。
9．换上枯草芽孢杆菌的水浸片进行观察（必须先进行合轴调节）。
五、实验报告
1．结果
绘出你用相差显微镜所观察到的酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的形态结构。
2．思考题
为什么说相差显微镜适于观察活细胞的细微结构？
实验五电子显微镜
一、目的要求
1．了解电子显微镜的工作原理。
2．学习并掌握制备电镜标本的方法。
二、基本原理
1．电子显微镜的分辨力和放大率
电子显微镜是利用电子流代替光学显微镜的光束使物体放大成像而由此得名的。发射电子流的电子源部分称为电子枪，电子枪由发射电子的“V”形钨丝及阳极板组成，在高真空中，钨丝被加热到白炽程度，其尖端便发射出电子，发射出来的电子受到阳极很高的正电压的吸引，使电子得到很大的加速度而到达样品。电压越高，电子流速度越快，波长越短，其分辨能力也越强。一般用50—100kV电压时，电子波长在0．54—0．37nm，所以电子显微镜的分辨力极高，可达0．2nm左右，此分辨力比光学显微镜提高了近1000倍。
在电子流的通路上不能有游离的气体分子存在，否则由于气体分子与电子的碰撞而造成电子的偏转，导致物像散乱不清。因此，电子显微镜除需要高电压外，还需要高真空的装置。
电子显微镜的放大率是由透镜决定的，在电子显微镜中，透镜是由看不见的电磁场构成
偏折而放大物体，这与光学显微镜的光线通过玻璃透镜发生折射而放大物体的情况一样，但它不同于光学显微镜的是可利用多个磁透镜的组合而得到逐级放大的电子像，所以现代电子显微镜的成像系统由多个电磁透镜组成。而光学显微镜由于玻璃透镜本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通过增加透镜的数目来无止境地提高。
此外，通过改变这些电磁透镜的磁场强度也可提高放大率。磁场越强，焦距越短，放大倍数也就越大。所以现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜，放大倍数可达一百万倍以上。
图Ⅲ-12表示电子显微镜镜体剖面图。从图上可以看到构成电子显微镜的主要部件及其位置。
2．电子显微镜的成像原理
任何一个物体都是由原子组成的，原子则是由原子核与轨道电子组成的。当电子束照射到样品上的时候，一部分电子能从原子与原子之间的空隙中穿透过去，其余的电子有一部分会与原子核或原子的轨道电子发生碰撞被散射开来；一部分电子从样品表面被反射出来；还有一些电子是被样品吸收以后，样品激化而又从样品本身反射出来等。如果把所有这些不同类型的电子收集起来，使它们成像，便可以构成不同类型的电子显微镜（图Ⅲ—13）。这里只着重介绍透射电子显微镜和扫描电子显微镜。
（1）透射电子显微镜
从图Ⅲ-13可以看出透射电子显微镜收集的是透过样品的电子。在透射电子显微镜中，物像的形成主要来自电子的散射作用与干涉作用。散射作用分“弹性散射”和“非弹性散射”两种。弹性散射指电子和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向，这种碰撞称为弹性碰撞，这时候我们说电子发生了“弹性散射”作用。如果电子是和轨道电子发生碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这时电子便发生了“非弹性散射”作用。
由于物体上不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密的差别，在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目少，因而打在荧光屏上所发出的光就弱，显现为暗区；而散射电子能力弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光屏上所发出的光就强，显现为亮区，这样，便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了反差，人眼就可以辨别。散射作用形成的反差造成强度上的变化，因此又称为“振幅反差”。由于在电子显微镜中利用的是人眼看不见的电子流，所以通常用一块荧光屏来把电子流转换成可见的荧光，使人眼可以接受。
除了散射作用能引起反差外，电子的干涉作用也能造成反差，在电子发生非弹性碰撞的时候，由于电子会失去一部分能量，因而使它前进的速度变慢，这部分速度减慢的电子会和速度不变的电子发生干涉作用，结果造成电子相位上的变化，从而也引起反差，称为“相位反差”。
在低倍观察时，振幅反差是主要的反差来源，而在高倍观察时，也就是在辨别极小的（如1nm大小）细微结构时，相位反差则起主要作用。
（2）扫描电子显微镜
与透射电子显微镜不同，扫描电子显微镜是把从样品表面反射出来的电子收集起来并使它们成像，所以又称反射电子显微镜。扫描电子显微镜的成像原理与电视或电传真照片的原理相似，由电子枪产生的电子束经过三个磁透镜的作用，形成一个很细的电子束，称为电子探针。电子探针经过透镜聚焦到样品表面上，按着顺序逐行逐行地通过样品，也就是对样品扫描，然后把从样品表面发射出来的各种电子（二次电子、反射电子等）用探测器收集起来，并转变为电流信号经放大后再送到显像管转变成图像。
扫描电子显微镜主要用来观察样品的表面结构，分辨力可达10nm，放大范围很广，可从20倍到几十万倍。透射电子显微镜的分辨力虽然很高，但是一般只能观察切成薄片后的二维图像，扫描电子显微镜能够直接观察样品表面的立体结构，并且具有明显的真实感。许多电子无法透过的较厚样品，只能用扫描电子显微镜才能看到。
三、器材
铜网若干个，瓷漏斗，无菌镊子，无菌滴管，大头针，载玻片，细菌计数板，普通光学显微镜；
醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2％磷钨酸钠（pH6．5—8．0）水溶液；
大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。
四、样品制备
根据电子显微镜类型的不同，相应地也就有各种不同的样品制备技术，本实验主要介绍透射电子显微镜的样品制备技术。
由于电子显微镜的整个操作都需要在高真空中进行，所以被观察的微生物标本必须是干燥的，否则就会引起菌体细胞发生收缩变形。同时又因为电子流的穿透能力很弱，不能透过载玻片或较厚的标本，所以需要将标本放在由金属网作支架的火棉胶或聚乙烯甲醛薄膜上观察，此膜又称载膜或支持膜（扫描电子显微镜可用盖玻片）。
1．制作支持膜
支持膜的厚度一般在15nm左右，太薄会影响它的机械支持力，太厚
又会影响成像的分辨力。支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。在常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求。常用的金属网有铜网和不锈钢网。本实验以铜网火棉胶膜为例说明支持膜的制作方法。
（1）铜网的处理铜网为圆形，直径一般是2．3或3．0mm，其规格有150、200、250目之分，其中比较常用的是200目（200个孔）。铜网在制膜前要清洗、脱水，否则会影响膜的质量和标本照片的清晰度。处理方法是先用醋酸戊酯浸漂若干小时后，用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水酒精中进行脱水，最后将洗净的铜网放入瓷漏斗或小培养皿内，漏斗下面套上乳胶管，用止水夹控制水流。然后缓缓向漏斗内放入无菌水，其量为1cm左右，用无菌镊子尖轻轻排除网上的气泡，并将其均匀地摆在瓷漏斗的中心区域。
若铜网经以上处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）处理1分钟左右，立即用无菌蒸馏水冲洗数次，然后放入无水酒精中脱水。
（2）配制火棉胶将1．5g火棉胶溶于100ml醋酸戊酯中。
（3）制膜用无菌滴管取上述火棉胶液滴在瓷漏斗的水面上，待醋酸戊酯蒸发，火棉胶则由于水的表面张力随即在水面上形成一层薄膜（勿振动），用镊子将它除掉，如此操作两次以清除水面上的杂质。然后再适量滴一滴火棉胶液以形成支持膜（火棉胶液滴的多少与膜的厚薄关系很大，要适量控制）。松开止水夹，缓缓放掉漏斗中的水，使膜自然下沉，并紧贴在铜网上，在此过程中切勿使膜皱折。最后在瓷漏斗上覆盖一洁净的纸，让膜自然干燥。
将干燥后的膜用大头针的针尖在铜网周围划破，再用无菌镊子小心地将铜网膜移到载玻片上，置普通光学显微镜下用低倍镜检查，挑选无皱折、完整无缺、厚薄均匀的铜网膜备用。
2．制片
有许多种制片方法，如直接贴印法、滴液法、负染色法和超薄切片法等。本实验介绍负染色法，此法常用来观察病毒粒子、高分子和细菌等。所谓负染色法是将样品用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来包围样品，即不是被样品成分所吸附而是沉积到样品四周。如果样品具有表面结构，这种物质还能穿透进表面上凹陷的部分，这样，在有染液的重金属元素沉积的地方，散射电子的能力强，因而样品四周表现为暗区；在有样品的地方散射电子的能力弱，因而表现为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。具体操作如下：
（1）将适量无菌水加入生长良好的大肠杆菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。用无菌滤纸过滤，并调整滤液中的细胞浓度为每毫升108—109个。
（2）取等量的上述菌悬液与等量的2％的磷钨酸钠水溶液（pH6．5—8．0）混合，制成混合菌悬液。
（3）用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
（4）经3—5分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，先置低倍光学显微镜下检查，
为了保持形状，常用戊二醛、甲醛、饿酸蒸汽等试剂小心固定后再进行染色。其方法是将无菌水制备好的菌悬液经过滤，然后向滤液中加几滴固定液（如0．15％的戊二醛磷酸缓冲液，pH7．2），经这样预先稍加固定后，离心，收集菌体，制成菌悬液，再加几滴新鲜的戊二醛，在室温或4℃冰箱内固定一夜，次日离心，收集菌体，再用无菌水制成菌悬液，并调整细胞浓度为每毫升108—109个，然后按上述方法染色。
五、实验报告
思考题
（1）比较透射电子显微镜与普通光学显微镜的主要异同点。
（2）利用透射电子显微镜来观察的样品为什么要放在金属网作为支架的火棉胶膜（或其他膜）上？而扫描电子显微镜则可以将样品固定在盖玻片上？
（3）在用负染色法制片时，磷钨酸钠起什么作用？
Ⅳ．微生物的染色与形态结构观察
虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
本部分实验着重于细菌的染色观察，同时也针对放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态特点进行相应的实验。目的在于使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。
实验六细菌的单染色法
一、目的要求
1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
2．巩固显微镜的使用方法。
二、基本原理
所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：
MBC→methylene blue++chloride-
带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
三、器材
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水；
吕氏碱性美蓝染色液，石炭酸复红染色液；
金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌。
四、操作步骤
1．涂片取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作（图Ⅳ-1，具体操作参照实验一），分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
3．固定涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
4．染色放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美蓝染色液约染2—3分钟，石炭酸复红染色液约染1—2分钟。
5．水洗染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。
6．镜检
按实验二操作程序进行显微镜观察。
五、实验报告
1．结果
绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。
2．思考题
（1）根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
（2）制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
实验七革兰氏染色法
一、目的要求
了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
三、器材
大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；
革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤
1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
图Ⅳ-2示革兰氏染色过程。
五、实验报告
1．结果
在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？
2．思考题
（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
实验八细菌芽孢染色法
一、目的要求
学习并掌握芽孢染色法。
二、基本原理
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
三、器材
枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；
孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液等。
四、操作步骤
方法1、
（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。
（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。
（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
方法2、
（1）取二支洁净的小试管，分别加入0．2ml无菌水，再往一管中加入1—2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1—2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。
（2）在菌悬液中分别加入0．2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3—5分钟。
（3）用接种环分别取上述混合液2—3环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出。
（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。
（5）取1—2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。
五、实验报告
1．结果
绘图表示你观察到的两种芽孢杆菌的芽孢在形状、大小、着生位置上有什么不同？
2．思考题
实验九荚膜染色法
一、目的要求
学习并掌握荚膜染色的基本方法。
二、基本原理
荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。
三、器材
圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）；
荚膜染色液，纯甲醇等。
四、操作步骤
1．在载玻片一端滴一滴无菌水，取少许培养了72小时的圆褐固氮菌在水滴中制成悬液。取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。
2．用纯甲醇固定1分钟。
3．加番红液数滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30秒钟，以细水流适当冲洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。
五、实验报告
1．结果
绘图说明圆褐固氮菌菌体及荚膜的形状。
2．思考题
为什么在荚膜染色中一般不用热固定，而用纯甲醇进行固定？
为什么在孔雀绿染色液加热染色中，要待玻片冷却后才能用水冲洗？
实验十鞭毛染色法及活细菌运动性的观察
一、目的要求
1．学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。
2．学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。
二、基本原理
鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0．01—0．02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。
在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。
三、器材
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），假单胞菌（Pseudomonas sp．），金黄
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
《微生物学》实验教学教案[实验项目] 实验一微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌 [教学时数] 3学时 [实验目的与要求] 1．认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。 2．掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。 [实验原理] 微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。 干热灭菌的原理，空的玻璃器皿一般用干热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 [实验材料与设备] 1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。 2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。 3．棉花、扎绳、包扎纸。 [实验步骤] （一）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围 1. 培养皿 由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90 mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 2. 试管 (1)大试管(约18mm×180mm) : 可装倒平板用的培养基，可作制备斜面用（需要大量菌体时用），装液体培养基用于微生物的振荡培养。 (2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用，用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 (3)小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 3.三角瓶
《微生物学》课程教学大纲 课程名称：微生物学 课程类型: 必修课 总学时： 108 讲课学时： 54 实验学时：54 学分：3 适用对象: 生物工程专业 先修课程：普通生物学，生物化学 一、课程性质、目的和任务 微生物学是生命科学的一个重要分支，是生物工程专业的一个重要的学科基础必修课。通过本课程的学习，使学生掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；病毒的结构、复制、防治；了解微生物学的研究方法和手段；培养学生“综合”生物学的科学思想，从而使学生能够运用“综合”思想解决生物学中的问题，为学生学习有关后续课程提供必要的理论基础。 二、教学基本要求 通过本课程的学习，要求学生系统掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；了解微生物学的研究方法和手段。 三、教学内容及要求 （一）绪论 1.教学基本内容： （1）微生物与人类； （2）微生物的发现和微生物学的建立与发展； （3）微生物的类群及特点； （4）微生物学研究对象与任务； （5）本课程的目的、要求及范围。 2.要求：通过教学，引导学生走进微生物世界，了解微生物的概念和作用以及它们与人类的特殊关系；明确微生物学作为一门独立学科在生命科学发展中的重要作用和地位；展望未来，激发学生的学习兴趣和明确肩负的重任。 （二）微生物细胞的结构和功能——原核微生物 1.教学基本内容： （1）细菌的形态、结构和繁殖，细菌的群体形态； （2）放线菌的形态、结构和繁殖，放线菌的群体形态； （3）蓝细菌的形态、结构和繁殖；（3～5部分用图表形式概要描述）
（4）支原体、立克次氏体和衣原体的形态、结构、功能和繁殖； （5）古生菌的概念、细胞形态和细胞结构。 2.要求：掌握细菌、放线菌的个体形态、细胞结构、化学组成、群体形态特征、繁殖方式。了解蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体及古生菌的基本结构特点和生活特性。 （三）微生物细胞的结构和功能——真核微生物 1.教学基本内容： （1）真核微生物的概述； （2）酵母菌的形态、结构和繁殖，酵母菌的群体形态； （3）霉菌的形态、结构和繁殖方式，重点以青霉和曲霉为主，霉菌的群体形态； 2.要求：掌握酵母菌、霉菌的个体形态、结构、群体形态特征、繁殖方式。 （四）病毒 1.教学基本内容： （1）病毒的定义和特点； （2）病毒的形态、种类、结构和化学组成与功能；（重点） （3）病毒的复制和感染；（重点） （4）病毒与宿主的相互作用；（重点与难点） （5）亚病毒因子； （6）病毒与实践：危害人类健康的病毒。 2.要求：了解病毒类群的划分，掌握病毒的形态、结构、化学组成，重点掌握病毒的复制及病毒与宿主的相互作用。 （五）微生物的营养 1.教学基本内容： （1）微生物细胞的化学组成和营养物质及其生理功能； （2）微生物的营养类型（光能营养型微生物和化能营养型微生物）； （3）微生物吸收营养的方式（单纯扩散、促进扩散、主动运送和膜泡运输）； （4）选用和设计培养基的原则和方法、培养基的类型及应用。（重点与难点） 2.要求：掌握微生物所需营养素、微生物营养类型、吸收营养的方式，学会培养微生物的各类型的培养基配制原则及其应用。 （六）微生物的代谢 1.教学基本内容： （1）微生物产能代谢 异养微生物的生物氧化，自养微生物的生物氧化，光能营养微生物的能量转换过程，能量转换方式（2）微生物特有的耗能代谢——二氧化碳的固定，固氮作用，肽聚糖的合成及其它
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
《微生物学》学习指南 一、课程的基本情况 本课程总学时：104 学时，其中理论教学：40学时，实验教学40学时，实习周教学1周（24学时），一个学期内完成全部授课内容。 《微生物学》课程是我校微生物技术及应用、生物技术及应用、食品加工技术、饲料与动物营养、食品安全与质量管理等9个专业的必修课程。《微生物学》是建立在学生学完《化学应用技术》、《生物化学》等课程之后开设的课程，是一门实践性较强的专业基础课。是微生物技术及应用专业、生物技术及应用专业和酿酒技术专业的核心主干课程。 本课程的主要内容：微生物形态观察、微生物培养、微生物生长测定、微生物分离纯化及鉴定、微生物检测、微生物育种和微生物的保藏。本课程的主要任务是使学生掌握微生物的形态构造、营养代谢、生长控制、遗传变异等方面的基本理论知识，掌握无菌操作技术、微生物的分离和培养技术、微生物鉴定技术、工业微生物菌种选育及保藏技术等关键技能，学习无菌操作室、微生物菌种室的建设，并掌握微生物技术常用仪器和设备的运行与维护，并培养学生之间的团结协作及沟通能力。学完该课程，为学生今后的学习及工作奠定坚实的基础。二、基本学习方法 《微生物学》课程理论、实践性均强，内容丰富，知识点琐碎，技能训练要求严格，许多学生反映该学科难学。因此，如何教与学好这门学科是很值得探讨的问题。这需要师生共同努力，教与学相辅相承。 1.明确目的是前提 要学好一门课程，首先要充分认识学科的性质及其重要性，才会有学习的动力，由“要我学”变为“我要学”，这样，你才能认真地、刻苦地去钻研它。这就要求你要听好第一堂即“认识微生物和微生物学”的讲解，明确学习的目的，激发学习的兴趣。明确微生物学与人们的生产生活联系非常紧密，与多学科联系紧密，有“桥梁”学科之称。如后续的发酵工艺课中的酶制剂、微生态制剂、酒
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
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一、名词解释：微生物:微生物是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构，用肉眼看不见或看不清的低等生物的总称。 微生物学:微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动基本规 律，并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等实践 领域的科学，其根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物，控 制、消灭或改造有害微生物，为人类社会的进步服务。 原核生物：即广义的细菌，指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露DNA的原始 细菌：是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。 病毒：是超显微的，无细胞结构，专性活细胞内寄生，在活细胞外具一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。 烈性噬菌体：凡在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、成熟、裂解这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体。 C/N比：所谓C/N是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。 生长因子：一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。
培养基：是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且其间比例合适。 基因：是生物体内一切具有复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。 纯培养：微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。 次生代谢产物：指某些微生物的生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢作前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂化学物。 发酵：无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力不经呼吸链而直接传递给某一中间代谢物的低效产能反应。 抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。 最小抑制浓度:表示抗生素的抗菌活性，单位是g/ml。 抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）； 窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素） 生态学（ecology）：是一门研究生命系统结构，及其与环境系统间相互作用规律的科学。 微生物生态学：是生态学的一个分支，它的研究对象是微生物与其周围生物和非生物环境条件相互作用的规律。
实验一实验室和人体表面微生物的检查 一实验目的 1 证明实验室环境与体表存在微生物 2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二实验原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材 1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板 2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台 ①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。 ④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。 ⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
绪论微生物与人类 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。个体微小(一般小于0。1nm）、构造简单。 微生物种类：①原核类：细菌（真细菌，古生菌)，放线菌，蓝细菌，枝原体，立克次氏体，衣原体。②真核类：真菌(酵母菌，霉菌，蕈[xun]菌）,原生动物，显微藻类.③非细胞类：病毒，亚病毒(类病毒，拟病毒，朊病毒）。 微生物五大共性：体积小，面积大；吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多。 第一章原核生物的形态、构造和功能 一般构造:细胞壁，细胞膜,细胞质，核区.特殊构造：鞭毛，菌毛,性菌毛，糖被（包括荚膜和粘液层）和芽孢，伴孢晶体。 细胞壁是细胞的外被，主要成分肽聚糖。功能：①固定细胞外形和提高机械强度②为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需③阻拦大分子有害物质（某些抗生素和水解酶）进入细胞④赋予细菌特定的抗原性以及对抗生素和噬菌体的敏感性⑤与革兰氏染色反应密切相关革兰氏阳性细菌细胞壁：磷壁酸，脂磷壁酸,肽聚糖。厚度大（20层）,90%肽聚糖和10％磷壁酸。 革兰氏阴性细菌细胞壁：肽聚糖，脂蛋白，磷脂，脂多糖，孔蛋白，外膜蛋白。壁薄，层次多，成分复杂，机械强度较弱。 革兰氏染色法：涂片固定→结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红覆染 阳性菌：紫色.阴性菌:红色。 缺壁细菌1。实验室中形成：①自发缺壁突变：L型细菌。②人工方法去壁：彻底除尽（原生质体）、部分去除(球状体）2.自然界长期进化中形成：枝原体。 L型细菌:专指稳定的L型即那些实验室或宿主体内通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺损菌株。 芽孢形成：①DNA浓缩，形成束状染色体；②细胞膜内陷，细胞发生不对称分裂，其中小体积部分即为前芽孢；③前芽孢的双层隔膜形成,这时芽孢的抗热性提高；④在上述两层隔膜间充填芽孢肽聚糖后,合成DPA-Ca（吡啶2，6—二羟酸钙）,开始形成皮层，再经脱水，使折光率提高；芽孢衣合成结束;⑥皮层合成完成，芽孢成熟,抗热性出现；⑦芽孢囊裂解,芽孢游离外出. 渗透调节皮层膨胀学说:芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中的水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予了芽孢极强的耐热性。 放线菌：是一类主要呈菌丝状生长和一孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。也可以将其定义为一类主要呈丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。 枝原体,立克次氏体，衣原体寄生性逐步增强，是介于细菌和病毒间的一类原核生物。 枝原体的特点：①细胞很小,光镜下勉强可见；②细胞膜含甾[zai］醇，比其他原核生物的膜更坚韧；③因无细胞壁，故呈革兰氏阴性细菌且形态易变，对渗透压较敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感；④菌落小（0.1~1。0mm），在固体培养基表面呈特有的“油煎蛋”状;⑤以二分裂和出芽等方式繁殖；⑥能在含血清、酵母菌和甾醇等营养丰富的培养基
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
水处理微生物学实验指导书 班级 姓名 学号 市政与环境工程学院 年月
目录 实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察实验二革兰氏染色技术 实验三培养基的配制和灭菌 实验四水中细菌总数的测定
实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察 一、实验目的与要求 （1）了解普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。 （2）观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。 （1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，
微生物学课程设计 甜酒酿的制作 起止日期：2013 年月日至2013 年月日 学生姓名 班级生物技术1102班 学号 成绩 指导教师(签字) 包装与材料工程学院 2013年1月10日
摘要 甜酒酿简称酒酿，是我国民间广泛食用的一种高糖、低酒精含量的发酵食品。本文内容主要以微生物学发酵工程中的基本方法，酿制甜酒，旨在学会甜酒的制作技术。 关键词：甜酒、酿造、方法。
ABSTRACT Sweet whose abbreviation, whose is our country folk widely consumed a high sugar, low alcohol content in fermented food. This paper content mainly by the basic methods of microbiology fermentation engineering, brewing wine, to learn to wine making technology. Keywords: wine、brewing wine、methods.
目录第一章背景与意义 第二章酿造原理与方法 第三章方法与步骤 第四章实验结果记录与分析 第五章总结报告
第一章背景与意义 甜酒酿，是我国民间的一种广泛食用的食品。其原理是糯米经过根霉和酵母糖化发酵制成的，制作原理简单。在学习微生物学之后，通过自行设计酿造甜酒酿，使得理论省时，省力，理论与实践相结合，将书本上面的东西应用到实践中。
第二章酿造原理与方法 2.1 酿造原理 根霉的孢子在米饭及枝上发芽后，迅速萌发出大量菌丝体，它们分泌的几种淀粉酶将基质中的淀粉水解为葡萄糖。这是糖化阶段。接着，再再由根酶和多种酵母菌继续将其中一部分葡萄糖转化为乙醇，此即酒精发酵阶段。 2.2 酿制方法 糯米用水浸透后蒸煮、冷却→接种小曲粉并搅匀→装入洁净容器后压实→25℃下培养3~5d→成品。 从甜酒或小曲等材料中可分离优质根霉菌种。
食品微生物学实验技术 实验1 食品中细菌菌落总数的测定 1 目的要求 （1）掌握食品中菌落总数测定方法。 （2）了解食品清洁程度（被污染程度）及观察细菌在食品中繁殖的动态，从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。 2 基本原理 菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（g，cm2)检样中所含菌落总数。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。 菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。 3 实验材料 3．1 仪器恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。 3．2 材料吸管（容量为0.1mL、1m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。 3．3 试剂营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。 4 实验方法与步骤 4．1 菌落总数实验程序（如图28-1） 4．2 检样稀释及培养 （1）以无菌操作将检样25g(25mL)剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶，经过充分振荡或均质处理制作成1：10的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管（注意吸管尖端不要触及管稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。 （3）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿，每个稀释度作两个平皿。 （4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿作空白对照。 （5）待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃温箱培养24+2hr（肉、乳和蛋品为48+2h，水产为30℃48+2h）。