Stock solutions
1 10*YNB
134g YNB dissolve in 1000mL H2O, filter
2 500*B （0.02%）Biotin
20mg Biotin dissolve in 100 mL H2O, filter
3 100*H (0.4% histidine)
400mg L-Histidine dissolve in 100ml H2O
At 323K to dissolve
4 10*D (20% Dextrose)
Dissolve 200g of D-Glucose in 1000mL H2O
Autoclave for 15min, filter
5.10*M (5% Methanol))
5mL methanol add to 95mL H2O
6 10*GY (10% Glycerol)
100mL glycerol add to 900mL H2O, filter
7 1M Potassium phosphate buffer, pH 6.0
132mL 1M K2HPO4 add to 868 ml 1M KH2PO4
(Phosphoric or KOH to adjust pH 6.0)
BMGY （Buffered Glycerol-complex Medium ）1L
BMMY （Buffered Methanol-complex Medium）1L
Prescriptions
1% (m/v)酵母浸出物，2% (m/v)蛋白胨，100mM磷酸钾PH6.0，1.34% (m/v)YNB , 0.00004%(m/v)生物素，1%(v/v)甘油或0.5%(v/v)甲醇
1）溶解10 g 酵母浸出物，20 g 蛋白胨于700 ml 水中;
2）121度灭菌20 min;
3）冷至室温，加入下列混合液：
100 ml 1M 磷酸钾缓冲液PH6.0
100 ml 10×YNB
2 ml 500×B
100 ml 10×GY
4）制BMMY 时，加入100ml 10×M 取代10×GY
5）存于4 度，可放2 个月
贮存液：
*10×YNB（13.4%酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸）
溶解134 gYNB 于1000 ml水中，过滤除菌，加热至YNB 完全溶解，存于 4 度。或者用34 gYNB（不含硫酸铵不含氨基酸），100 g 硫酸铵进行配制，可放 1 年。注意毕赤酵母在高浓度YNB 下生长更好。该试剂盒中所用YNB 的量是酿酒酵母中的两倍。
*500×生物素（0.02%）
溶解20 mg 生物素于100 ml 水中，过滤除菌，放于4度，可放 1 年
*10×M（5%甲醇）
混合5 ml 甲醇与95 ml 水，过滤除菌存于4度，可放2个月
*10×GY（10%甘油）
混合100 ml 甘油与900 ml 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放 1 年以上
*1 M 磷酸钾缓冲液PH6.0
132 ml 1 M K2HPO4，868 ml 1 M KH2PO4，调整PH 值为6.0±0.1（如果需调PH 值，用磷酸或KOH）。过滤或高压灭菌，室温下可放 1 年以上Reagents
Yeast extracts 500g*1
Yeast Nitrogen Base (YNB) 500g*1
Peptone from casein 1kg*1
D-glucose 25mL*2
L-Histidne 100g*1
D-Biotin 120g*1 CAS:58-85-5 D-Biotin 偶合（国产）
BioRAD Gene Pulser Cuvette*2 电穿孔仪*2
锥形瓶250mL*2, 1L*3
10*Glycerol 500mL
500*B Biotin 250mL
ZXL 121026 500mL
10*YNB 500mL
10*Methanol 500mL
1M potassium phosphate buffer pH6.0, 1L
Zeocin 1.25mL 100mg/mL, Invitrogen
-20度冰箱保存物品
HaoA 甘油菌一支
载体质粒一包
cDNA片段
内切酶SacI, PmeI
cDNA片段10支
di cDNA EcorL/NatI 84.5mg/ml
di PPILZa EcorL/NatI 29.8mg/ml
PPI LZa
PPI LZa-P 402.8mg/ml 20120617
PPILZa 349.2mg/ml 20120515
Zhj1-P
Zhj2-R
Zhj3-P /3 0.1mm
Zhj4-P /4 0.1mm
/3 0.01mm
载体质粒(29支)：
pGro7
pKJE7
pG-KJE8
pG-TF2
pTF16
NBD1 plasmid 10ng/μL *2
pET21a 7.14 337ng/μL
pET11c 464ng/μL
pET11c N/B NdeI/BamH 18.4ng/μL
TEV K+ 9.28 265ng/μL
pcDNA 3.1(一) 755ng/μL
Brd4 44-168 His-Tev Brd4 44-168 pET11c 128ng/μL ATAD2 pET11c His-Tev ATAD2 (981-1108)
JNK1 correct expression 486 ng/μL
JNK2 correct expression pFBHTB 0.54ng/μL
JNK3 correct expression pFBHTB 0.54ng/μL
DRD1-7 7.29 585ng/μL
pFastBac HTB 0.68 mg/mL
EDNRA-6 639ng/μL
CXCR4 -3 952ng/μL
Acl-BL
ZLG/Acl-BL
GLp-1R-2 954ng/μL
pPICA-1 7.8 177ng/μL
MKK4 correct expression 573ng/μL
MKK7 correct expression 374ng/μL
实验流程：
1 PCR引物的设计与合成
2 总RNA分离提取。
3 RT-PCR反应和cDNA 的扩增
4 目的基因片段的克隆鉴定与测序
5 重组质粒的构建
6 重组酵母的转化
7 重组酵母的诱导表达与活性检测（前述步骤师兄似已完成？目前正在进行试表达？）
挑取经鉴定的阳性转化子接种于3 mL YPD 液体中，30℃、250 r/min振摇过夜培养；
取20μL储备全菌（挑单克隆?）接种于含25mL BMGY液体培养基250mL锥形瓶；
302K振荡培养18 h，250rpm；
至菌体OD 达到2～6时；
离心收菌，弃上清；
添加BMMY液体培养基至OD约1.0（约100-200mL BMMY）；
在诱导过程中，每24 h取样并同时加入甲醇使其终浓度为0.5；
在培养0h，6h，12h，24h，36h，48h，96h取样；
样品经10 000 r/min离心3min，取上清进行Tricine SDS-PAGE电泳。表达产物体外活性的检测采用单层平板抑制法（？）。