第二章生物药物概论
一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。
主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。
特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。
（2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。
（3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。
分类：
按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。
按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。
按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。
二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。
工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法： 冷冻法，-40℃；②有机溶剂脱水法；③防腐剂保鲜，多用于液体）。
2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数，注意温度、变性剂等因素）。
3、生物药物的分离纯化：（1）蛋白质类药物的分离纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。
试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。2、不破坏活性成分。
3、利于后续预处理。
4、对环境影响较小，有利于回收和处理。
5、对设备要求不高。
6、成本较低。
7、最好对人体无害。
第三章基因工程制药
一、基因工程制药的主要工艺过程。
获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装
二、什么是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？
目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。
获取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；⑸逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。
基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到一定数量。
三、基因工程克隆细胞和表达细胞、克隆载体和表达载体其各自特点。
克隆载体：1、具备复制原点，在宿主细胞内必须能够自主复制。2、有一个或多个用于筛选的选择标记。3、具备合适的限制性核酸内切酶的单一识别位点。4、有较高的拷贝数。表达载体：要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将他放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中，这种载体就成为表达载体。表达载体的结构比克隆载体复杂，除了必须具备与克隆载体相同的复制原点，多克隆位点和筛选标记基因以外，还必须有控制目的基因表达的调控序列，包括启动子，转录终止子等。
四、目的基因高效表达的方式有哪些？怎样全面提高目的基因的表达水平？有何措施？
目的基因高效表达的方式：
1.目的基因的不溶性高效表达。表达的蛋白质往往形成不溶性的无生物活性的包涵体，需要经过溶解和复性才能获得有活性的目的蛋白。
2.目的基因的高效可溶性表达。可溶性的目的蛋白本身常具有生物活性，无需复杂的变性复性的后分离过程，是一种很有希望的提高目的基因表达的新策略。
3.目的基因的高效分泌型表达。目的基因的分泌型表达有两种情形：目的蛋白分泌到细胞周质中和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外。对于能分泌到细胞外的表达系统，能进一步简化产物分离工艺。
提高目的基因表达水平的措施：
1.对基因工程宿主菌进行改造。如在上游阶段通过改造宿主的遗传性能从而减少或消除乙酸的生成；通过改造大肠杆菌使之能在贫氧条件下生长。
2.提高工程菌的质粒稳定性。如在上游阶段质粒构建时插入抗生素抗性基因；在质粒构建时应该加入称为par和cer的位点（par位点能够在细胞分裂过程中使质粒分布更均匀，cer位点则能够防止多聚体质粒的形成，从而能从源头上提高质粒稳定性）。在下游阶段采用细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培养策略，另外还可采用培养条件循环控制策略和采用固定化细胞培养等。
3.选择能高密度表达的宿主菌和对重组菌进行高密度培养。如选择培养时菌体密度和表达水平能尽可能高的宿主菌。在下游阶段赋予工程菌生长和产物表达的最适环境条件。
4.减少乙酸等抑制性副产物的形成。如在下游阶段设计好培养基的组成；选取合适的比生长速率；适当降低培养温度；限制性流加葡萄糖；将基因工程菌培养和乙酸的分离同时进行等。
5.选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌以及能提高目的蛋白表达质量的方法。如在上游阶段选择尽可能地不产生或少产生能引起蛋白质变性或降解的酶系的宿主细胞。而在下游阶段可采用将菌体生长与蛋白表达时期分开的策略。
（也可以分上、下游表述为：
上游----对基因工程宿主菌进行改造；提高工程菌的质粒稳定性；选择能高密度表达的宿主菌；选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌。
下游----提高工程菌的质粒稳定性；对重组菌进行高密度培养；减少乙酸等抑制性副产物的形成；选择能提高目的蛋白表达质量的方法。）
五、工程菌的稳定性及其影响因素和考察方法。
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：
1.结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰导致其表观生物学功能的丧失。
2.分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸。
影响基因工程菌稳定性的因素：
遗传特性：1.载体的选择 2.宿主的选择 3.外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺：1.培养基 2.生长速率 3.限制性机制 4.温度 5.pH和溶氧 6.外源基因表达六、基因工程菌的常见培养方式及其各自特点有哪些？连续式发酵对基因工程产品的大规模生产有什么优势？影响基因工程菌发酵的因素。基因工程菌构建和基因工程菌生产其发酵研究各自的目的、意义及相应研究内容。
培养方式：分批培养，补料分批培养，连续培养，透析培养，固定化培养。
补料分批培养将种子接人发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
连续培养将种子接人发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。
透析培养透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。
固定化培养即将固定化技术应用于基因工程菌培养，基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。
连续培养可为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，可为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造良好条件。
在连续式培养中，还可以将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开进行两阶段连续培养，并通过优化诱导水平、稀释率和细胞比生长速率这3个参数，可以保证在第一阶段培养时质粒稳定，在第二阶段可获得最高表达水平或最大产率。
影响基因工程菌发酵的主要因素：
1、培养基的影响。
2、接种量的影响。
3、温度的影响。
4、溶解氧的影响。
5、诱导时机的影响。
6、诱导表达程序的影响。
7、pH的影响
基因工程菌发酵研究内容：1、选择宿主菌：研究不同宿主菌对外源基因表达的影响2、基因工程菌的生长曲线测定3发酵条件对外源基因表达的影响4、重组质粒稳定性研究。
七、以包涵体表达形式的基因工程药物的分离纯化过程和方法，分离纯化出具有活性的蛋白质的一般步骤及其操作要点。进行分离纯化研究涉及到的研究项目及内容。
过程方法及操作要点：
1、菌体细胞的收集与破碎（既要使菌体破碎率尽可能高，又要保持包涵体的完整性）。
2、包涵体的分离、洗涤与溶解（通过离心法使包涵体与上清液中的碎片及杂质蛋白分开，
包涵体洗涤的基本原则是杂质去除率尽可能高而不溶解包涵体中的目的蛋白。溶解包涵体的试剂选择基本原则是对目的蛋白的溶解性强、选择性好；保护蛋白质的生物活性；
安全性；适合后续各种操作；成本低）。
3、变性蛋白的纯化（对包涵体抽提物采用柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方
法进一步分离纯化）。
4、蛋白质的复性（恢复可溶性和生物活性，应考虑影响因素：蛋白质浓度、杂质含量、冲
折叠速度、氧化还原剂用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH、离子强度等）。
分离纯化研究：
1、破菌研究：破菌方法及其条件研究，镜检评价其破碎效果，原则是使菌体破碎率尽可能
高，又要保持包涵体的完整性
2、包涵体的分离和洗涤研究：（1）分离包涵体时的离心力和时间的考察；（2）洗涤剂及其
他浓度、用量研究；（3）洗涤时间和温度研究。
包涵体洗涤操作的基本原则：（1）洗涤剂杂质去除率尽可能高，而不溶解包涵体中的目的蛋白；（2）分离包涵体时的离心力和离心时间尽可能满足将包涵体与细胞碎片等杂质很好地分离。
3、目的蛋白的变性（抽提）研究：（1）变性剂及其浓度、用量的研究（2）变性操作时间
和温度研究（3）变性操作后的固液分离（离心力和离心时间）研究。
4、变性蛋白的纯化研究：对包涵体抽提物可采取柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC
等方法进一步分离纯化。Ps：重组蛋白的纯化可以在包涵体溶解后进行，也可以在复性后进行，因此还应进行两种方法的对比研究。
5、变性蛋白的复性研究：考察比较不同复性方法对目的蛋白复性效果的影响。主要考察其
对蛋白回收率和复性程度的影响；另外，还需要考察复性时间的影响因素，如蛋白质浓度、杂质的含量、重折叠速度、氧化还原剂的用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH值和离子强度等对复性效果的影响。
6、目的蛋白的高度纯化研究：对经复性后得到的目的蛋白进行进一步高度纯化，以满足不
同的需要。
八、基因工程药物质量控制的必要性及其质控要点，基因工程药物最终产品的质量控制特点及要点。
必要性：
1、它是利用获得细胞作为表达系统来制备产品，所获得的蛋白质往往分子量较大，并且具
复杂的表达结构；
2、许多基因工程药物都是参与人体一些生理功能精密的蛋白质，在极微量的差别的情况下
产生显著效应；
3、宿主细胞中表达的外源基因在翻译、转录及工艺放大的过程中会产生变化。
质控要点：
1、原料的质量控制。确保编码药品的DNA序列正确性，重组微生物来自单一克隆，所用
的质粒纯而稳定。
2、生产的质量控制。原始细胞库生产、有限代次的生产、连续培养生产、分离纯化。
3、最终产品的质量控制。产品的鉴别、纯度分析、生物活性测定、安全性稳定性考察和产品一致性的保证。
质控特点：任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求，它需要综合生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论和技术，才能切实保证基因工程产品的安全有效。
第四章酶工程制药
一、酶工程制药的主要内容
1、药用酶的生产：发酵生产，分离纯化，分子修饰
2、酶法制药：酶催化反应、固定化、非水相催化
二、酶法制药研究中涉及到的研究项目及内容
1、原料的选择及反应的研究。
2、酶或酶系的选择研究。
3、酶催化反应最佳工艺条件研究。
4、产物的分离纯化研究
第五章植物细胞培养制药
一、植物细胞的生理特性，植物细胞培养的基本流程和技术。
生理特性：
1、比微生物细胞大得多；
2、具有群体生长特性，单细胞难以生长，繁殖；
3、对剪切力敏感，抗张力强度大，抗剪切力小；
4、生长速度慢，操作周期长；
5、容易结成细胞团；
6、大多植物细胞的生长及次级代谢物的生产都要求一定的光照和时间，且不同波长的光具有不同的效果。
基本流程：
1、外植体的获得及预处理；
2、获得悬浮细胞株
3、悬浮细胞株筛选
4、植物细胞的扩大培养；
5、大规模培养
基本技术：
1、植物细胞的获得技术；
2、植物细胞的选育与改良技术；
3、植物细胞培养技术；
4、植物细胞培养次级代谢产物技术；
5、植物细胞培养生物转化技术
二、植物细胞获取的主要方法及其操作过程，植物细胞培养制药的培养方法。愈伤组织培养的基本过程和操作。
主要方法：从外植体直接分离，愈伤组织诱导获取，原生质体再生
操作过程：
1、外植体的选择与预处理。选择时需综合考虑的因素有外植体大小、同一植物不同部位的
选取、不同物种的选择、植物年龄以及取材季节。注意灭菌剂和灭菌时间选择以及灭菌后无菌水洗。
2、直接分离：
（1）机械捣碎法：先将外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞；
（2）酶解法：利用果胶酶，纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞。
3、愈伤组织诱导法：（1）诱导培养基的制备（2）外植体植入诱导培养基中培养生成愈
伤组织（3）愈伤组织继代培养（4）从愈伤组织分离得到植物细胞。
4、原生质体再生法（不要求）。
培养方法：
按培养对象分：愈伤组织培养，原生质体培养，小细胞团培养
按培养基类型分：固体培养，液体培养
按培养方式：悬浮细胞培养，固定化细胞培养
基本操作和过程：
1、愈伤组织培养基的配制。
①配制液体培养基配制含有各种所需营养成分的液体培养基，其浓度是所需培养基浓度的2倍。
②琼脂的配制与熔化按照1.5%琼脂的比例称取琼脂，加入所需培养基体积一半的蒸馏水，放置一段时间，待琼脂吸水膨胀后加热使琼脂完全熔化。
③分装将上述熔化的琼脂趁热与液体培养基按照1:1的比例混合均匀，用稀酸或稀碱调节至所需的pH值，分装于培养皿、三角瓶或试管等培养容器中。
④灭菌在120℃的条件下，灭菌15~20min，冷却后备用。
2、愈伤组织的选择。通常在愈伤组织诱导的10-15d左右进行继代培养，在继代培养的第10-15d进行新一轮的继代培养。
3、接种。首先在无菌条件下，用镊子或小刀将选择好的愈伤组织块分割成若干小块，剔除附着在愈伤组织块上的原有培养基，必要时可以用无菌水清洗几次，然后在无菌条件下将处理好的愈伤组织小块转移到含有新鲜固体培养基的培养皿中。
4、培养。将培养皿置于培养箱中，在一定条件下进行培养。培养一定时间后，适时地进行下一轮的继代培养或接种到液体培养基中进行细胞悬浮培养。
例：从愈伤组织获得植物细胞有哪两种操作方式？将愈伤组织接种到新鲜的固体培养基中是怎样操作的？（10分）
答：方法1：对诱导获得的愈伤组织用镊子或小刀分割得到植物小细胞团；
方法2：将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。
操作：在无菌条件下，首先用镊子或小刀将选择好的愈伤组织块分割成若干小块，将原培养基清洗干净，然后将处理好的愈伤组织小块转移到含有新鲜固体培养基的培养器皿中。
三、植物细胞培养中提高植物次生代谢物生产的途径。（具例见教材）
1、添加诱导因子：引起植物过敏反应，诱导植物特定基因表达，进而激活特定次生代谢途径，积累特定的目的次生代谢物，具有种属专一性；
2、前体饲喂：在植物细胞培养中加入次生代谢物合成的前体物质；
3、两相法培养：细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，而这些产物又通过主动或被动运输方式释放到细胞外，并被另一相所吸收，达到富集产物的目的；
4、培养条件的控制：通过优化培养基、光照、温度、通气等条件的调控，使细胞次级产物分泌变多；
5、在培养基中添加代谢产物合成抑制剂；
6、其他，如选育高产细胞株，二步法培养，新型生物反应器等。
四、植物细胞培养次级代谢物生产的基本工艺过程，过程涉及到哪些研究内容？如何进行研究？
工艺过程：
1、外植体的选择与处理；
2、植物细胞的获得；
3、植物细胞的扩大培养；
4、植物细胞悬浮培养；
5、次级代谢物的分离纯化
研究的内容：
1、外植体的选择和处理研究；
2、愈伤组织诱导；
3、植物细胞的诱变、筛选；
4、细胞悬浮培养的研究；
5、提取分离与纯化方法研究
五、植物细胞培养生物转化制药的基本工艺过程，过程涉及到哪些研究内容？如何进行研究？
生物转化基本过程：
1.转化反应植物细胞筛选
2.外植体的选择和处理
3.培养基的选择和配置
4.细胞的获取
5.稳定细胞系的建立
6.加入底物进行生物转化
7.转化产物的提取分离
8.产物检测
研究内容：
1.转化持续时间的研究
2.底物浓度的研究
3.不同细胞密度的研究
4.培养体系pH 值的研究
5.温度光照的研究
六、植物细胞培养代谢物生产制药和生物转化制药其过程的影响因素。
植物细胞培养代谢物影响因素：
1.外植体的选择。不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累计时间各异。
2.培养条件的影响
培养环境的内在因素：
a。接种和诱导
b。基本培养基的组成：1.磷 2.氮 3.碳源 4.植物生长调节剂 5.O2和pH值 6.渗出物
两步培养法
培养环境的外部因素：
温度 2.搅拌频率3.培养容器的影响 4.光的影响
生物转化制药其过程的影响：
1、植物细胞的影响 1.转化系统的影响 2.细胞系的影响 3.细胞生长阶段的影响
2、外源底物的影响
（1）外源底物浓度的影响：外源底物对培养的植物细胞一般都是有毒性的
（2）外源底物结构的影响
（3）外源底物添加方式的影响不溶性的底物，先溶解后再加入；活用细粉末；用吐温或环糊精来促溶
3、培养条件的影响
培养基的组成、植物激素、刺激剂、抑制剂以及pH值、温度、光照等培养条件。
第六章动物细胞培养制药
一、动物细胞的生理特点，生产用动物细胞的种类及其特点，生产用动物细胞的获得，工程细胞库的种类及要求，细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领。
生理特点：
1、动物细胞的分裂周期长；
2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象；
3、正常二倍体细胞的生长寿命有限；
4、对环境敏感；
5、对培养基要求高；
6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。
细胞种类及特点：
1、原代细胞：增殖能力有限，需大量动物。
2、二倍体细胞体：2n型染色体组，传代寿命有限，具有明显的贴壁依赖和接触抑制特点，
无致癌性。
3、转化细胞系：具有无限繁殖超额能力，倍增时间较短，对培养条件和生长因子要求较低。
4、融合细胞系：杂交特性。
5、重组工程细胞系
工程细胞库的种类及要求：
1、原始细胞库（MCB）:储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质细胞，对二倍体细胞应
该是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时需有该细胞的详细档案，包括该细胞系的历史，和对各种有害因子的检查结果。
2、生产用细胞（MWCB）储存于MWCB的细胞应该是从MCB来的，或从单一安瓿来，或
从多个安瓿在融化即刻混合在一起的然后经培养扩增达一定数量后，再分装储存形成的细胞库。该细胞库同样需要建档案，而且需进行无菌性的无细胞交叉污染的检查。
细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领：
常用技术是液氮冷冻保存法，主要采用加入适量保护剂的缓慢冷冻法保存细胞。步骤：细胞悬液制备→加保护剂→分装和封口→液氮冻存。
复苏一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。
二、动物细胞体外培养的生长与增殖过程，动物细胞与微生物细胞和植物细胞在培养上的区别，动物细胞培养的方法和操作方式及其特点。
生长与增殖过程：原代培养期→传代培养期→衰退期。
培养区别：1、动物细胞无细胞壁，且大多哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；2、对营养要求严格，除氨基酸，维生素，盐类，葡萄糖或半乳糖外，还需要血清；3、动物细胞对环境敏感，包括pH，溶氧，温度，剪切应力都比微生物有更严的要求，一般需
严格地监测和控制。
培养方法及特点：
1、悬浮培养：适用于一切各类的悬浮细胞和兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件较
均一，传质和传氧较好，容易扩大规模培养。缺点：较难采用灌流培养，细胞密度一般较低（即不适于高密度培养）。
2、贴壁培养：适用于一切贴壁细胞和兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞各类广，较易采用
灌流培养，细胞密度高，缺点：操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不均一，传质和传氧较差。
3、贴壁－悬浮培养：将悬浮培养和贴壁培养两者结合，优势互补，主要方法有：微载体培
养，包埋和微囊培养，结团培养。
操作方法及特点：
1、分批式操作：细胞和培养基一次性加入反应器进行培养。
2、流加式操作：不断加入营养成分而不取出条件培养基（经培养已经含有细胞产物但不含
细胞的培养基）。
3、半连续式操作：细胞和培养基加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中每隔一段时
间取出部分培养物，补充同样数量新鲜培养基，反应器内培养液的总体积保持不变。
4、连续式操作：连续地加入新鲜培养基，同时等速地取出反应器内的培养液（连同细胞）。
5、灌流式操作：不断取出部分条件培养基（无细胞），补充等量新鲜培养基。
三、动物细胞大规模培养的主要影响因素及其不良因素的控制。
主要影响因素：
1.细胞培养环境（营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压）
2.乳酸和氨的毒性累积
3.必需营养物的添加
4.对细胞的剪切作用
不良因素解决手段：设计适应细胞生长的无血清培养基；控制营养物的添加；减少产物消耗积累；剪切损害可通过反应器的优化被减少，另外在培养液中添加剪切抑制剂。
四、动物细胞培养制药的基本工艺过程。目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白工业化过程的主要通用技术平台及其特点。如何进行动物细胞培养制药的研究。
动物细胞－（捣碎）－组织碎片－（酶处理）－单个细胞－离心收集细胞－（营养培养）－培养瓶培养－（酶）消化处理－接种－扩大培养－种子细胞液氮保存－取出细胞种子－种子解冻复活培养－扩大培养－接种－大规模培养－产物分离纯化－产品。
技术平台及特点：
主要是以搅拌式生物反应器悬浮培养（70％以上）作为通用技术平台, 平台工艺的特点是采用无血清培养（50％以上）和成熟的流加和灌流工艺。
悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压) ,终产物(乳酸和氨) 毒性累积和必需营养物的添加等。设计适应细胞生长的无血清培养基,控制营养物的添加,减少产物消耗积累是解决问题的有效手段。
对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被减少, 另外在培养液中添加剪切保护剂。
贴壁细胞生产工艺,最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培养系统,并可提供最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。最佳的工艺设计是高密度连续灌流培养。
流加培养和灌流培养是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式。
五、为什么要研究不同宿主菌对目的蛋白表达的影响？是怎样进行研究的？
由于不同载体提供的不同增强子和启动子都有自己特异的结合蛋白，而只有能为它们提供这些蛋白的宿主菌才能使目的基因得到更好的表达。此外，不同大肠杆菌的不同种和亚种
所含有的宿主蛋白酶种类和数量不同，对表达的产物会有不同程度的降解作用。故宿主菌的选择是不可忽视的，必须对重组质粒在不同宿主菌中表达目的蛋白的差异进行研究，即需研究不同宿主菌对目的蛋白表达的影响。
将重组质粒分别转化不同的宿主菌，在相同条件下培养至一定的细胞密度（如OD600为0.5—0.6）后立即在相同条件下诱导目的基因表达（如42℃诱导5h），收集菌体，裂解后进行SDS-PAGE分析。检测其表达含量和表达总量，选择表达量最大的宿主细胞。
六、为什么要进行基因工程菌生长的测定？是怎样进行的？
外源基因在宿主细胞内的表达要利用宿主细胞的能源和资源，并引起宿主细胞不同程度的代谢超负荷。外源基因的导入往往干扰细胞生长，导致宿主细胞生长速率减慢，甚至使细胞死亡。因此在基因工程菌构建过程中，应该就基因工程菌的生长规律进行研究，以考察宿主细胞承载外源重组体的能力，为最终宿主菌的确定提供依据。
将基因工程菌与宿主菌在相同条件下培养，分别测定并绘制其生长曲线。若生长曲线相近，说明重组质粒的导入对宿主菌的生长规律影响不大，转入的外源基因未明显增加宿主菌的代谢负担，该宿主菌接受及承载外源基因的能力强，最终可以选用该宿主菌；若生长曲线相差较大，则要重新选择宿主细胞。
七、为什么要对发酵条件对目的蛋白的表达影响进行研究？需考察哪些发酵条件？
需考察：培养基、接种量、培养温度、溶解氧、诱导时机、pH值等对目的蛋白表达的影响。
八、为什么要进行重组质粒的稳定性研究？是怎样进行研究的？
工程菌的质粒稳定性是放大生产的重要前提。质粒的不稳定性主要表现在两个方面：一是重组质粒丢失，即分离稳定性低；二是由于分子内和分子间的重组而发生的重排、缺失、插入，导致重组质粒中外源DNA片断的丢失，即结构稳定性低。质粒的稳定性直接影响到基因工程菌发酵产物的产量和质量以及生产周期。故需进行重组质粒的稳定性研究。
将工程菌繁殖一定代数（如100代）后，考察质粒丢失率，如质粒丢失率为0，说明重组质粒分离稳定性良好；同时，考察传代的工程菌诱导时有无目的蛋白的表达，如均有目的蛋白的表达且其表达量始终保持在一个比较稳定的范围内（如20％～40％），说明外源片段没有丢失，重组质粒结构稳定性好。
分离稳定性研究：可将工程菌液稀释涂布于不含抗生素的培养基中，待菌落长成后，挑选100个菌落点接于含抗生素的培养基中，待其长成菌落，记录生长的菌落数，如接近100个，说明质粒分离稳定性较好。
结构稳定性研究：将培养一定代数的工程菌进行诱导，表达目的基因，测定其产物表达量（含量和总量），如表达量一直较稳定，说明质粒的结构稳定性较好。
选择 ABC分子印迹可以应用于下列哪些方面：模拟抗体，生物传感器的构建，手性药物的分离，新药的构建 ABD酶促反应的特点包括：催化效率高，酶的催化活性不受调节和控制，专一性强，反应条件温和 ABCD体细胞基因治疗常用的靶细胞主要有：造血干细胞成纤维细胞肌细胞、肾细胞肝细胞、淋巴组织 B世界上第一个基因工程药物是：人白细胞干扰素INFa 重组人胰岛素人鼠源性单克隆抗体尿激酶 C下列不属于脂类药物的是：胆酸固醇灵芝大豆异黄酮 C下列能够产生抗体的细胞是：肝细胞，巨噬细胞，浆细胞，血红细胞 ABCD下列属于细胞代谢过程中的生理活性物质的是：维生素，植物激素，抗生素，生物碱 C下列属于细胞工程内容的是：染色体改造的理论和技术，酶改造的理论和技术，细胞融合的理论和技术，有关产物提取纯化的理论和技术 ABD工业上下列哪些是使用大肠杆菌生产的：谷氨酸脱羧酶，天门冬氨酸酶，丙酮酸脱羧酶，青霉素酰化酶 D被称为药剂学鼻祖的是：张仲景，希波克拉底，华佗，格林 AB造血生长因子的作用是：促进骨髓造血细胞分化，促进骨髓造血细胞增殖和定向成熟，动员祖细胞从骨髓移动到外周血，促进血液生产和血液循环 D下列不属于按分子大小分离的方法是：有超滤法，凝胶过滤法，超速离心法，沉淀法 ABCD下列可以作为生物药物的是：氨基酸及其衍生物，酶与辅酶，糖类，细胞生长因子 D基因工程中，载体的本质是：DNA，RNA ，蛋白质，DNA或RNA ABCD能够用作蛋白质药品冷冻干燥保护剂的是：糖类/多元醇，表面活性剂，氨基酸、盐和胺，聚合物 ABC才才下列属于酶反应器的是：鼓泡塔反应器，填充床反应器，流化床反应器，淤浆反应器
第二章生物药物概论 一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。 主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。 特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。 （2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。 （3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。 分类： 按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。 按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。 按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。 二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。 工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法： 冷冻法，-40℃；②有机溶剂脱水法；③防腐剂保鲜，多用于液体）。 2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数，注意温度、变性剂等因素）。 3、生物药物的分离纯化：（1）蛋白质类药物的分离纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。 试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。2、不破坏活性成分。 3、利于后续预处理。 4、对环境影响较小，有利于回收和处理。 5、对设备要求不高。 6、成本较低。 7、最好对人体无害。 第三章基因工程制药 一、基因工程制药的主要工艺过程。 获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装 二、什么是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？ 目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。 获取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；⑸逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。 基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到一定数量。
一：选择题 1、酶的主要来源是( C) A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/ 植物细胞与 组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指(A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素( EPO)基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：( E) A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用 B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定 C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：( D) A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达 C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达 D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产 物的功能B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和(安全性鉴定)。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A. 糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇( PEG)诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相 对分子量大，促进融合率高B、PEG的浓度高，促进融合率高C、PEG 的相对分子量小，促进融合率高D、PEG的最佳相对分子量为 4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物 为糖基化蛋白质B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D 、表达产物为天然产物 13、人类第一个基因工程药物是：(A) A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗 14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C) A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C 、鼠源性单克隆抗体D、单域抗体 15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)
第一章绪论 填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白 质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药 物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为 三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海 洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制 药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物 发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初 级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶 反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技 术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红 霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重 组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强， 疗效高，不足之处是稳定性差，分离 纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和 疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？ 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治 人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在 以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生 产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因 工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模 型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更 准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基 因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药 该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技 术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢 产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满 足人类健康方面的需求。 （3）发酵工程制药 发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改 进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。 第二章基因工程制药 填空题 1. 基因工 程药物制造的主要步骤是：目的 基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目 的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检 验。 1. 生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创 造一些条件，借助某些微生物、 植物或动物来生产所需的医学药 品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术 或其它生物新技术研制的蛋白 质或核酸来药物称为生物技术药 物。 3. 生物药物 生物技术药物是重组产品概念在 医药领域的扩大应用，并与天然 药物、微生物药物、海洋药物和 生物制品一起归类为生物生物药 物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什 么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段 的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征 是酿造技术，所得产品的结构较 为简单，属于微生物的初级代谢 产物。代表产品如酒、醋、乙 醇，乳酸，柠檬酸等。
1. 生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件， 借助某 些微生物、植物或动物来生产所需 的医药品。 2. 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 3.疫苗：是指将病原微生物(细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支 原体、衣原体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。 4.反义核酸：包括反义DNA分子，或由部分RNA和部分DNA形成的RNA-DNA 嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。 5.载体分为：质粒载体和λ噬菌体载体。①质粒载体涉及三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点、几种质粒载体（克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体）②λ噬菌体载体：常用于构建基因组文库和cDNA 文库。λ噬菌体载体通常分为插入型载体和置换型载体，插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入，置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必需序列插入载体。 6.目的基因常用的制备方法：化学合成法、PCR法、基因文库法、cDNA 文库法。 7.基因工程药物制造程序：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。 8.基因工程菌的培养过程:（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件（温度、pH、培养基组分及C/N），分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。（2）培养罐操作：确定培养参数、控制方案及顺序。基因工程菌的培养方式:（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2)连续培养： 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、 稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性(5）分批培养:DO-Stat 法： 调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在 20%，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat 法： 控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。 控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。9.基因工程菌发酵工艺的影响因素:（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶解氧的影响（5）诱导时机的影响（温度、氧、营养）（6）pH的影响（细胞生长期、外蛋白表达期）（7）诱
2018年生物技术制药习题及答案 一、选择填空题 1. 酶的主要来源是什么? 微生物生产。 2. 第三代生物技术是什么? 基因组时代。 3. 基因治疗最常用的载体是什么? 质粒载体和λ噬菌体载体。 4. 促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么? 因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化, 人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。 5. 菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸?
菌体生长所需能量 (大于) 菌体有氧代谢所能提供的能量时, 菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 6.cDNA 第一链所合成所需的引物是什么? cDNA 第一条链合成所需引物为 PolyT 。 7. 基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么? 表达产物的功能。 8. 为了减轻工程菌代谢负荷,提高外源基因表达水平可采取什么措施? 将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。 9. 根据中国生物制品规定要求,疫苗出厂需要经过哪些检验? 理化检定、安全检定、效力检定。 10. 基因工程药物化学本质是什么? 蛋白质。
11.PEG 诱导细胞融合? PEG 可能与可能与临近膜的水分相结合, 使细胞之间只有微笑空间的水分被 PEG 取代, 从而降低了细胞表面的极性,导致双脂层的不稳定,使细胞膜发生融合。 12. 以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物,产物位置是什么? 胞内、周质、胞外。 13. 人类第一个基因工程药物是什么? 重组胰岛素。 14. 动物细胞培养的条件是什么? 温度 :哺乳类 37昆虫 25~28, ph7.2~7.4,通氧量:使 co2培养箱,不同动物比例不同。防止污染, 基本营养物质:三大营养物质维生素, 激素, 促细胞生长因子, 渗透压:大多数 260~320。 15. 不属于加工改造抗体的是什么? 单域抗体。 16. 第三代抗体是什么?
生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记： 年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：
生物技术制药考试题复 习 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
一：选择题 1、酶的主要来源是（C） A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植物细胞与组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指 (A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：（E） A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用? B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定? C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒? B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：（D） A、Poly?A B、PolyC C、PolyG D、PolyT E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达? C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达? D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易? 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内
1.生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等 （3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物 （4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？ （1）分子结构复杂 （2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高 （4）稳定性差 （5）基因稳定性 （6）免疫原性 （7）体内的半衰期短 （8）受体效应 （9）多效性 （10）检验的特殊性 3.生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基 因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产 工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物 （3）抗体工程制药 （4）酶工程制药 （5）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有： ①目的基因的克隆， ②构造DNA重组体， ③构造工程菌， ④目的基因的表达， ⑤外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件
生物技术制药 第一章绪论 药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科 ★生物技术与生物技术药物的概念 生物技术药物的分类 ?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片) ?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物 ?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性 ?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 ?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 ?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 ?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药 蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性 临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学 真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响 基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性 基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 ?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 ?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 ?酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ?1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量?影响限制性内切酶反应的因素： ?DNA样品的纯度： ?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 ?酶切反应的温度 ?DNA的分子结构 ?反应缓冲液组成 ?反应时间、反应体积等
生物技术制药考试题复 习 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
一：选择题 1、酶的主要来源是（C） A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植物细胞与组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指 (A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：（E） A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用? B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定? C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒? B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：（D） A、Poly?A B、PolyC C、PolyG D、PolyT E、发夹结构
7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达? C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达? D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易? 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D、表达产物为天然产物? 13、人类第一个基因工程药物是：(A)
一、名词解释：每个概念5分，共50分 1. 生物技术制药 生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。 2. 基因表达 基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。 3. 质粒的分裂不稳定 通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。一般情况下具有质粒的细胞(即P ＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。 4. 补料分批培养 发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。 5. 人-鼠嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。 6. 悬浮培养 非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。 7. 贴壁培养 也称为细胞贴壁，贴壁后的细胞呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞的培养必须采用这种方法。 8. 固定化酶 不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。 9. 双功能抗体 将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。 10. 组织工程 应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 11抗体：由B细胞接受刺激后分化为浆细胞产生的能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
生物技术制药知识点纲要 生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。 生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。 生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。 生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。 基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术； 细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件； 发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。 生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。 第三代生物技术是海洋生物技术 我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作 现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术 ⑺现代微生物发酵技术 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术 现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面： ①基因操作技术日新月异，不断完善。 ②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。 ③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。 ④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。 ⑤转基因植物和动物取得重大突破 ⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。 ⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向， ⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。
第一章、绪论 1. 生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，称为生物技术药物。 3. 生物药物：指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 4. 现代生物药物四大类型：⑴应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂； ⑵基因药物 ⑶来自动物、植物和微生物的天然药物； ⑷合成与部分合成的生物药物。 5. 生物药物功能用途分类：⑴治疗药物，⑵预防药物⑶诊断药物。 6. 生物技术制药的特征：⑴高技术⑵高投入⑶长周期⑷高风险⑸高收益 7. 生物技术在制药中的应用：⑴基因工程制药：①基因工程药物品种的开发、②基因工程疫苗、③基因工程抗体、④基因诊断与基因治疗、⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型、⑥应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物、⑦基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用、⑧利用转基因动、⑨植物生产蛋白质类药物 ⑵细胞工程制药：①单克隆抗体技术、②动物细胞培养 ⑶酶工程制药 ⑷发酵工程制药 8. 我国生物技术制药现状和发展前景（自己阐述观点）
第二章基因工程制药 1．基因工程生产哪些药：⑴免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。⑵细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。⑶激素，如胰岛素、生长激素、心钠素⑷酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2. 利用基因工程技术生产药品的优点在于： ⑴利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。 ⑵可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。 ⑶利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。 ⑷内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程读起进行改造。 ⑸利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 3. 上游阶段：是研究开发比不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。上游阶段的工作主要咋实验室内完成。 4. 下游阶段：是从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。下游阶段是将实验室成果产业化、商品化。 5. 制备基因工程药物的基本过程：获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装 6. 宿主菌应该满足以下要求：⑴具有高浓度、高产量、高产率；⑵能利用易得廉价原料； ⑶不致病、不产生内毒素；⑷发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑸容易进行代谢调控；⑹容易进行重组DNA技术；⑺产物容易提取纯化 7. 宿主细胞分为两大类：⑴原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；⑵真核细胞：酵母、丝状真菌 8. 表达载体必须具备以下条件（特点）： ⑴载体能够独立地复制 ⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应位于启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。 ⑷应具有阻遏子，使启动子收到控制，只有当诱导时候才能进行转录。 ⑸应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有反义的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。 ⒐密码子的偏爱性：在基因组中把使用频率高的同义密码子称为主密码子或偏爱密码子。此现象被称为密码子偏爱性 ⒑融合蛋白：由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，称为融合蛋白。 ⒒酵母的复制序列的几种不同载体：⑴YEp类（酵母附加体质粒） ⑵YRp类（酵母复制型质粒） ⑶YCp类(酵母着丝粒质粒) ⑷Yip类（酵母整合型质粒） ⒓基因工程菌的不稳定性：基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。
生物技术制药课后习题 by xx Yua n 1生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽, 蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等 （3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物 4）合成与部分合成的生物药物2、生物技术制药具有什么特征? （1）分子结构复杂 （2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高 （4）稳定性差 （5）基因稳定性 （6）免疫原性 （7）体内的半衰期短 （8）受体效应 （9）多效性 （10）检验的特殊性 3、生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基 因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产 蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产 物 （3）酶工程制药 （4 ） 发酵工程制药 4、基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有： 目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5、影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些? （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率： a、启动子的强弱
b、核糖体的结合位点 c、S D序列和起始密码的间距 d、密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢付荷 （5）工程菌的培养条件 6、质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。 提高质粒稳定性的方法如下： （1）选择合适的宿主细菌 2）选择合适的载体 （3）选择压力 （4）分阶段控制培养 （5）控制培养条件 （6）固定化 7、影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数? 影响因素： (1)培养基 (2)接种量 (3)温度 (4) 溶解氧 (5) 诱导时机的影响 (6) 诱导表达程序 (7) PH值 &什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？ 高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH（4）温度（5）代谢副产物 实现高密度发酵的方法： （1）改进发酵条件：a培养基b、建立流加式培养基c、提高供养能力 （2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a阻断乙酸产生的主要途径b、对碳代谢流 进行分流c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 9、分离纯化常用的色谱分离方法有哪些？它们的原理是什么？ 方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。 （1）离子交换色谱IEC :是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换 剂
生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。、 ②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等 反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。 化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。
1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽， 蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？ （1）分子结构复杂（2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性 （7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性 （10）检验的特殊性 3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体， 基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢 产物 （3）酶工程制药（4）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件 6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力 （4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化 7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？ 影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧 （5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值 8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？ 高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法： （1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力 （2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌