鸡新城疫抗体（NDV-Ab）酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清，血浆及相关液体样本中新城疫抗体（NDV-Ab）的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入新城疫抗体（NDV-Ab），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的新城疫抗体（NDV-Ab）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）浓度。
试剂盒组成：
试剂盒组成48孔配置96孔配置保存
说明书1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1个1个
酶标包被板1×481×962-8℃保存
标准品：1800ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存
样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心
20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备
用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标
准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1200ng/L，800ng/L，400ng/L，200ng/L，100ng/L。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。
2.批内与批间应分别小于9%和11%
检测范围：
70ng/L-1500ng/L
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月
Chicken NDV-Ab
FOR RESEARCH USE ONLY
Drug Names
Generic Name：Chicken NDV-Ab ELISA Kit.
Purpose
This kit allows for the determination of NDV-Ab concentrations in Chicken serum,blood plasma,and other biological fluids.
Principle of the assay
T he kit assay Chicken NDV-Ab level in the sample，use Purified antigen to coat microtiter plate wells,make solid-phase antigen,then add NDV-Ab to wells,Combined antigen which With HRP labeled,become antigen–antibody -enzyme-antigen complex,after washing Completely,Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of450nm.The concentration of NDV-Ab in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.
Materials provided with the kit
Materials provided with the kit 48determinations96determinations
Stora
ge
User manual11
Closure plate
membrane
22
Sealed bags11
Microelisa stripplate112-8℃Standard：1800ng/L0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Standard diluent 1.5ml×1bottle 1.5ml×1bottle2-8℃
HRP-Conjugate
reagent
3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Sample diluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen Solution
A
3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen Solution
B
3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Stop Solution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃
wash solution20ml×1bottle30ml×1bottle2-8℃Specimen requirements
1.serum-coagulation at room temperature10-20mins，centrifugation20-min
at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.
2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix10-20
mins,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.
3.Urine-collect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of
2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared, Centrifugal again.The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.
4.cell culture supernatant-detect secretory components,collect sue a
sterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.
remove supernatant,detect the composition of cells,Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）,Cell concentration reached1million/ml,repeated
freeze-thaw cycles,damage cells and release of intracellular components, centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant, If precipitation appeared,Centrifugal again.
5.Tissue samples-After cutting samples,check the weight,add PBS
（PH7.2-7.4）,Rapidly frozen with liquid nitrogen,maintain samples at 2-8℃after melting,add PBS（PH7.4）,Homogenized by hand or Grinders, centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant.
6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the
relevant literature,and should be experiment as soon as possible after the extraction.If it can’t,specimen can be kept in-20℃to preserve,Avoid repeated freeze-thaw cycles.
7.Can’t detect the sample which contain NaN3,because NaN3inhibits HRP
active.
Assay procedure
1.Dilute and add sample to Standard:set10Standard wells on the ELISA plates coated,add Standard100μl to the first and the second well,then add Standard dilution50μl to the first and the second well,mix;take out100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately.then add Standard dilution50μl to the third and the forth well,mix;then take out50μl from the third and the forth well discard,add 50μl to the fifth and the sixth well,then add Standard dilution50μl to the fifth and the sixth well,mix;take out50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well,then add Standard dilution50μl to the seventh and the eighth well,mix;take out50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well,add Standard dilution50μl to the ninth and the tenth well,mix,take out50μl from the ninth and the tenth well discard(add Sample50μl to each well after Diluting,(density:1200 ng/L,800ng/L,400ng/L,200ng/L,100ng/L)
2.add sample：Set blank wells separately(blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent,other each step operation is same). testing sample well.add Sample dilution40μl to testing sample well,then add testing sample10μl(sample final dilution is5-fold),add sample to wells, don’t touch the well wall as far as possible,and Gently mix.
3.Incubate:After closing plate with Closure plate membrane,incubate for30 min at37℃.
4.Configurate liquid:wash solution diluted20-fold with distilled water and reserve.
5.washing：Uncover Closure plate membrane,discard Liquid,dry by swing, add washing buffer to every well,still for30s then drain,repeat5times,dry by pat.
6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent50μl to each well,except blank well.
7.incubate：Operation with3.
8.washing：Operation with5.
9.color：Add Chromogen Solution A50ul and Chromogen Solution B to each well,evade the light preservation for15min at37℃
10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well,Stop the reaction(the blue color change to yellow color).
11.assay：take blank well as zero,Read absorbance at450nm after Adding Stop Solution and within15min.
Important notes
1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced
15-30minutes in the room temperature,ELISA plates coated if has not use up after opened,the plate should be stored in Sealed bag.
2.washing buffer will Crystallization separation,it can be heated the water
helps dissolve when dilute.Washing does not affect the result.
3.add Sample with sampler Each step,And proofread its accuracy frequently,
avoids the experimental error.add sample within5mins,if the number of sample is much,recommend to use Volley.
4.if the testing material content is excessively higher(The sample OD is
bigger than the first standard well),please dilute Sample(n-fold),Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.
5.Closure plate membrane only limits the disposable use,to avoid
cross-contamination.
6.The substrate evade the light preservation.
7.Please according to use instruction strictly,The test result determination
must take the microtiter plate reader as a standard.
8.All samples,washing buffer and each kind of reject should according to
infective material process.
9.Do not mix reagents with those from other lots.
Calculate
Assay
range
Take the standard density as the horizontal,
the OD value for the vertical,draw the standard
curve on graph paper,Find out the corresponding
density according to the sample OD value by the
Sample curve,multiplied by the dilution multiple,
or calculate the straight line regression equation
of the standard curve with the standard density
and the OD value,with the sample OD value in
the equation,calculate the sample density,
This chartis for reference only
70ng/L-1500ng/L
Storage and validity 1．Storage：2-8℃. 2．validity：six months.
2014年全国职业院校技能大赛 “鸡新城疫抗体水平测定”赛项规程 一、赛项名称 赛项编号：G-057 赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定 英语翻译：Detection of the antibody titer against the Newcastle disease virus 赛项组别：高职组 赛项归属产业：农业 二、竞赛目的 通过本项目竞赛，促进高职学生了解鸡新城疫抗体水平测定的内容，熟练掌握测定方法，提高检测水平，培养学生的团队合作能力，不断提升学生的职业能力；引领农业职业院校适应畜牧业行业现状及技术发展趋势，促进畜牧兽医专业建设与教学改革；推进学院与相关企业深度合作，更好地实现工学结合的人才培养模式，为畜牧兽医行业培养高素质技术技能型人才。 三、竞赛内容与时间 （一）竞赛内容 竞赛项目为鸡新城疫抗体水平测定（微量法）。测定方法参考《新城疫诊断技术》（GB/T16550—2008）标准，具体分为6个部分。竞赛总时间为180分钟。 1.试验器材准备（占总成绩的6%） 按照操作规程进行试验器材的准备，并进行标识，合理摆放。 2.配制1%鸡红细胞悬液（占总成绩的20%） 按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1%鸡红细胞悬液。 3.血凝（HA）试验（占总成绩的16%） 按照操作规程，用微量移液器在96孔V型血凝反应板上滴加稀
释液、新城疫标准抗原，充分混匀后倍比稀释，添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡和感作，正确判定抗原的血凝效价。 4.配制四单位病毒（占总成绩的15%） 根据HA试验测定结果，按照操作规程配制四单位病毒。 5.血凝抑制（HI）试验（占总成绩的16%） 按照操作规程，对10个被检血清进行血凝抑制试验操作，同时设新城疫标准阳性血清对照和阴性血清对照。 6.抗体滴度报告（占总成绩的27%） 按照操作规程正确读数，填写完成报告单。 （二）竞赛时间 四、竞赛方式 本赛项为团体赛。每组参赛学生2名，须为同校在籍学生。由各省、自治区、直辖市教育行政部门商农业行政部门，在本区域内设置畜牧兽医专业的涉农高职院校全日制在籍学生中（参赛选手年龄须不超过25周岁，即2014年7月1日前不满26周岁），经选拔组成1个代表队参加比赛，每队限报1名指导教师。本赛项本次竞赛不邀请
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
鸡新城疫抗体（NDV-Ab）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清，血浆及相关液体样本中新城疫抗体（NDV-Ab）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入新城疫抗体（NDV-Ab），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的新城疫抗体（NDV-Ab）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存 说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存 标准品：1800ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存 20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
新城疫的血凝和血凝抑制试验 高若开 一、实验目的 1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。 2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。 二、实验内容 1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原 2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体 三、实验原理 1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。 2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。 病毒颗粒 红细胞
四、实验材料 离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。 五、实验步骤 （一）抗凝剂的配制 将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。 （二）10%红细胞悬液的配制 1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。 2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。 3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。 4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。 5、2-6摄氏度储存，备用。 （三）血凝试验（HA) 1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul 生理盐水 抗体 抗原
实验一鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法 1．本次实验的目的和要求 掌握鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。 2．实验内容或原理 某些病毒（如新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象（）。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（）。 3．需用的仪器或试剂等 动物健康成鸡2-5 只，被检鸡15-25 只。 器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2 聚乙烯塑料管100、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。 药剂（1 ）浓缩抗原；（2 ）生理盐水或磷酸缓冲盐水（）；（3）细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤 （1）发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。 （2）诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4 倍以上升高，即有诊断意义。 （3）免疫机体抗体效价的测定： 3.鸡新城疫（）的和 （1 ）试验准备 ①抗原：一般以鸡新城疫n系或系冻干苗作为已知抗原，进行试验。 ②0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管（按每毫升血加 入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2 毫升做抗凝剂）内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内（保存液2份，血液1份）于4 C冰箱内可保存两周。 红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000 转／分钟，离心5-10 分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液（生理盐水）洗涤。再用离心机3000 转／分钟离心5-10 分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液（0.7 毫升红细胞泥加99 .3毫升稀释液）。 ③被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微 量法可用孔径2-3 毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。 ④稀释液：为灭菌的生理盐水。 ⑤红细胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠（）0.80克，柠檬酸（2H20）0.055克，
2018年全国职业院校技能大赛 拟设赛项规程 一、赛项名称 赛项编号:GZ－2０18011 赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定 英语翻译：Deteｃtioｎof the Aｎtｉbody agａiｎst Chicｋen Ne ｗCastｌe DｉsｅasｅViｒｕｓ 赛项组别:高职组 赛项归属产业：农林牧渔 二、竞赛目得 本赛项由学校、行业、企业共设，通过技能竞赛,能有效促进全国高职院校畜牧兽医类专业之间得交流，引领专业建设与课程改革；能进一步深化学校与企业之间得合作交流，加大行业人才队伍建设力度，提升行业产业发展水平.同时，通过本赛项得资源转化，可以向社会展示畜牧兽医类专业得师生风采与建设成果，提高专业得教学水平，提升人才培养质量。 三、竞赛内容 本赛项为鸡新城疫抗体水平测定（微量法），测定方法按《新城疫诊断技术》（GB／T１6550－2008）标准，竞赛时间为１80分钟.具体步骤及其分值如下: （一)试验器材准备(占总成绩得8％） 按照操作规程进行器材准备，要求器材选择正确、摆放有序，物品标识合理,桌面整洁等. (二)配制１%鸡红细胞悬液（占总成绩得1８%） 按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1％鸡红细胞悬液，
要求采血规范、熟练、采血量适量、离心机使用规范、洗涤次数及洗涤时间适宜、配制过程规范、1％鸡红细胞量适宜等。 (三）血凝试验(占总成绩得２0%) 按照操作规程,用微量移液器在９6孔V型血凝反应板１－12孔滴加稀释液、新城疫标准抗原,充分混匀，倍比稀释后，再次滴加稀释液,再添加１％鸡红细胞悬液，充分振荡混匀，静置感作适当时间后,正确判定抗原得血凝效价。要求微量移液器使用规范、倍比稀释操作规范、结果判定正确等。 （四）配制四单位病毒（占总成绩得10％) 根据血凝试验结果，按照操作规程配制四单位病毒。要求稀释倍数计算正确，稀释液体积加入得当、四单位病毒配制量适宜等。 (五)血凝抑制试验(占总成绩得20%） 按照操作规程，对20个被检血清进行血凝抑制试验操作,并设新城疫标准阳性血清对照、阴性血清对照；正确读取标准阴性血清、标准阳性血清及被检血清得结果，确定抗体滴度，完成报告。要求移液器使用规范、反应板各孔得稀释正确、感作时间得当、对照成立、结果判断正确等. (六)抗体滴度报告（占总成绩得24％) 按照操作规程，正确判定抗体滴度,完成报告.要求抗体滴度判读正确、报告方式正确、结果误差符合要求、场地整洁等。 四、竞赛方式 本赛项为团体赛。每组参赛学生2名，比赛由2名学生配合完成，参赛选手均为高职院校在籍学生,不得跨校组队。 竞赛安排上午、下午各一场(每场两个赛场）,竞赛场次由领队抽
多克隆抗体的制备方法 多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。 多克隆抗体的制备步骤 一、器材 剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。 二、试剂 生理盐水(或PBS) 弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA) 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA) 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3 三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 四、兔子的选择 兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。 五、免疫 用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。 注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。 免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。 免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。 六、取血： 免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。 前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。 最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下： 1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。 2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血)。 3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。 4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。 5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。 6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
蛋鸡抗体检测实验室建设方法 一、面积、台面、墙面 面积至少要有6平方，放置一张操作台（桌子，面要平，长1.5米，宽1米），一张凳子，墙用彩钢板隔开，制作一个门，保持空间独立。 二、器材 1、一台小高压锅，用于灭菌。 2、冰箱，用于盛放易耗品等。 3、离心机（5000转以下）一台，用于制作红细胞。 4、移液枪两把，一把为1毫升的，另一把为200微升的。 5、电子天平一台。 三、耗材 1、枪头，1毫升的及200微升的，各500个。 2、盛放枪头的盒子，两种规格，各5个。 3、Ependorf管100个，Ependorf管架2个。 4、葡萄糖瓶子10各。 5、量筒2个。 6、记号笔一支。 四、 血凝试验(HA) 定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA) 血凝抑制试验(HI) 定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。 用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 阿氏（Alsevers）液配制
新城疫的抗体检测 某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI ），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 一目的意义 1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定 2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低） 3流行病学调查 二试验仪器与试剂 1 试验仪器离心机、离心管两支、50ml 量筒一个、V 型微量反应板、微量加样器（移液 器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml 吸管1 支、胶头滴管两支、微量振荡器、 电热恒温培养箱、托盘天平。 2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5 H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、 3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。 三方法 1 病毒的血凝试验 1.13.8% 柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8 克溶于100ml 蒸馏水 或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121 C高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室 温后置4C冰箱中保存备用。 1.21%鸡红细胞制备过程：事先用5ml （或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为 所需血量的1/5）, 从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4 毫升血液, 以2000 转每分钟，离心5 分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10 倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5 次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4 C冰箱备用（一般可保存3天）。 1.3红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）： （1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25 微升，直至加到第十五孔（第一列12 孔，第二列3 孔）。 （2）取新城疫抗原液25微升加入第一孔中，充分混合后吸取25微升加入第二孔中，如此直至第14孔，混合后吸取25微升丢弃，第15孔不加病毒为对照。 （3）更换移液器前端的塑料吸头，每孔加已备的1%鸡红细胞液各25 微升（注意从后往 前加）。 （4）将反应板置微型震荡器上，振动混合1分钟，取下置37C恒温箱中作用30分钟后 开始观察结果，注意每五分钟观察一次，直至30 分钟，判定并记录结果。 判定结果如下： ++++——红细胞全部凝集，均匀分布于孔底。 ++ ---- 红细胞部分凝集，沉积于孔底呈小圆点状。 - ——红细胞全部不凝集，沉积于孔底呈圆点状。 以使红细胞全部凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的凝集效价。4单位病毒的确定，以 上述血凝价除以4即为4单位病毒，如血凝价为1:128，则1:128的0.1ml中有一个凝集单位，4 单位病毒为128/4=32 ，即1:32 为4 个凝集单位。
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。 免疫佐剂
2016年全国职业院校技能大赛高职组 “鸡新城疫抗体水平测定”赛项规程 一、赛项名称 赛项编号：GZ-108 赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定 英语翻译：Detection of the antibody titer against the Newcastle disease virus 赛项组别：高职组 赛项归属产业：农林牧渔 二、竞赛目的 本赛项由学校、行业、企业共设，是高职畜牧兽医专业的核心技能，通过技能竞赛有效促进学校建设并完善实验、实训平台，加强核心技能的训练，提升高职畜牧兽医专业的人才培养质量。同时，通过竞赛方式也有效促进学校与企业之间的合作交流，推动高职畜牧兽医专业教学改革和校企合作，共同培养畜牧兽医行业一线技能型人才。 三、竞赛内容 本项目为鸡新城疫抗体水平测定（微量法），测定方法按《新城疫抗体诊断技术》（GB/T16550-2008）标准，竞赛总时间为180分钟。具体步骤及其分值如下： （一）试验器材准备（占总成绩的8%） 按照操作规程进行器材准备，要求器材摆放有序，物品标识合理，桌面整洁等。 （二）配制1%鸡红细胞悬液（占总成绩的18%） 按照操作规程进行采血、离心、洗涤、配制1%鸡红细胞悬液，
要求采血规范、熟练、采血量适量、离心机使用规范、洗涤次数及洗涤时间适宜等。 （三）血凝试验（占总成绩的20%） 按照操作规程，用微量移液器在96孔V型血凝反应板滴加稀释液、新城疫标准抗原，充分混匀，倍比稀释后，添加1%鸡红细胞悬液，充分振荡混匀，正确判定抗原的血凝效价。要求微量移液器使用规范、倍比稀释操作规范、结果正确等。 （四）配制四单位病毒（占总成绩的10%） 根据血凝试验结果，按照操作规程配制四单位病毒。要求稀释倍数计算正确，稀释液体积加入得当、四单位病毒配制量适宜等。 （五）血凝抑制试验（占总成绩的20%） 按照操作规程，对20个被检血清进行血凝抑制试验操作，并设新城疫标准阳性血清对照、阴性血清对照；正确读取抗体滴度结果，完成报告。要求移液器使用规范、反应板各孔的稀释正确、感作时间得当、结果判断正确等。 （六）抗体滴度报告（占总成绩的24%） 按照操作规程，正确读取抗体滴度结果，完成报告。要求抗体滴度报告方式正确、场地整洁、结果误差小等。 四、竞赛方式 本赛项为团体赛。每组参赛学生2名，比赛由2名学生配合完成，每个团队限报1名指导教师。参赛选手均为高职院校在籍学生。本赛项本次竞赛不邀请境外代表队参赛。 竞赛安排上午、下午各一场，竞赛场次由领队抽签决定。竞赛场座位号由选手抽签决定，竞赛用设备、材料及实验动物与座位号对应。
附件： 2018年全国职业院校技能大赛 赛项申报书 赛项名称：鸡新城疫抗体水平测定 赛项类别：常规赛项?行业特色赛项□ 赛项组别：中职组□高职组? 涉及的专业大类/类： 方案设计专家组组长： 手机号码： 方案申报单位（盖章）：全国林业职业教育教学指导委员会方案申报负责人： 方案申报单位联络人： 联络人手机号码： 电子邮箱： 通讯地址： 邮政编码： 申报日期：2017年8月31日
2018年全国职业院校技能大赛 赛项申报方案 一、赛项名称 （一）赛项名称 鸡新城疫抗体水平测定。 （二）压题彩照 图1 新城疫抗体水平测定比赛现场 （三）赛项归属产业类型 农业 （四）赛项归属专业大类 51农林牧渔大类 二、赛项申报专家组 本赛项主要由本科及高职院校畜牧兽医及相关专业教师，农业科学院畜牧兽医研究所和企业技术骨干组成竞赛项目设计团队。竞赛项目设计团队成员及相关信息如表1。
表1 赛项申报专家组名单 三、赛项目的 本赛项考核的核心技能是鸡的采血方法、1%鸡红细胞悬液配制、血凝试验操作、四单位病毒配制、血凝抑制试验操作、抗体滴度报告撰写等技能。本赛项考核的核心知识是《动物微生物》、《兽医临床诊疗技术》、《动物传染病》等专业课程理论知识。 本赛项由学校、行业、企业共设，是高职畜牧兽医专业的核心技能，通过技能竞赛有效促进学校建设并完善实验、实训平台，加强核心技能的训练，提升高职畜牧兽医专业的人才培养质量。同时，通过竞赛方式也有效促进学校与企业之间的合作交流，推动高职畜牧兽医等专业教学改革和校企合作，共同培养畜牧兽医行业一线技能型人才。 四、赛项设计原则 （一）公开、公平、公正 本赛项筹备与实施的各环节均按规定要求科学组织，公开进行报名、审查，提前公布技术文件、比赛样题，合理设计竞赛规则、程序、标准，公开执行过程，严格命题、裁判回避制度等措施，确保比赛公平。赛项设计源于职业岗位具体要求、又能够展现通用性技术与选手能力；比赛过程在公平和不干扰比赛选手的前提下向社会开放，并邀请广播、电视、网络等媒体宣传报道，提高赛项知名度，促进职业技能大赛健康发展。 （二）关联职业岗位面广 鸡新城疫抗体水平测定是兽医临床衡量养殖场免疫状况、预警免疫缺陷、制定有效防疫方案的重要方法之一，是畜牧兽医专
教学实习内容 一．鸡新城疫的免疫检测 目的：系统掌握鸡新城疫的抗体检测技术。 实验材料：新城疫疫苗、待测鸡蛋、生理盐水、5%柠檬酸钠、1%鸡红细胞悬液、胶头滴管、注射器、锥形瓶、15ml离心管、试管、96孔V型板、离心机等 1.1%鸡红细胞悬液的制备 （1）每组采取3ml左右健康鸡静脉血，迅速注入装有约0.3-0.4ml抗凝剂的离心管内，轻轻颠倒混匀； （2）加入适量生理盐水，混匀，3000rpm*10min，吸弃上清液和红细胞沉淀上层的白细胞层 （3）加入适量生理盐水，重悬红细胞，3000rpm*10min，吸弃上清液。如此，重复3次。（4）量取红细胞沉淀的体积，用生理盐水配成1%的红细胞悬液，待用。 2.HA试验 1%红细胞 根据所用NDV液的凝集价，配制4单位病毒液。 3.HI试验 （1）待测卵黄样品的制备：用镊子敲破鸡蛋小头，将蛋清倒去，留蛋黄在蛋壳内；吸取0.5ml 生理盐水，放入小试管内；去掉部分蛋壳，用1ml注射器（不带针头）吸取蛋黄0.5ml，加到有生理盐水的试管内，混匀（避免其很多泡）待检。 （2）按照检测血清抗体的方法检测卵黄中的抗体。
被检鸡蛋卵黄 1%红细胞 （3）判定和记录所检测鸡蛋的卵黄抗体效价。 结果与分析 对所测得的结果进行分析，确定该鸡群目前的免疫状态，并对生产提出合理建议或给出科学指导。 分析并指出影响本实验结果的主要因素。 二．传染病的分子生物学检测——PCR检测（以PCV2为例） 1.DNA提取： 将猪肝脏称重后，按照1:3（W:V）的比例加入PBS，用组织研磨器研磨成组织悬液，反复冻融3次后8000 rpm离心5 min，取上清300 μL提取DNA。 取冻融、离心后的组织悬液/血清300μL，加入300 μL细胞裂解缓冲液和5 μL的蛋白酶K(20 mg/mL)，混匀，置50 ℃消化2 h，每隔30 min，剧烈震荡一次；加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀后，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；用酚：氯仿：异戊醇（25:24: l）重复抽提一次；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入2倍体积冰预冷的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠（pH 5.2），室温放置30 min 以沉淀基因组DNA；4 ℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；用75%乙醇1 mL 洗涤沉淀，4 ℃ 12 000 rpm 离心10 min后，弃去上清，自然晾干。用25 μL含RNaseA(20 μg/mL)的TE溶解DNA沉淀，直接用于检测病毒DNA或-20 ℃保存待测。 2.PCR检测： 将所提取的DNA用特异性引物进行PCR扩增检测组织中PCV2。 25 μL反应体系如下： 10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL 10 mmol/L dNTPs 2 μL 25 pmol/μL上下游引物各0.5 μL DNA模板 2 μL
***于2018年全国职业院校技能大赛 鸡新城疫抗体水平测定赛项比赛（报到）的通知 各省、自治区、直辖市教育厅（教委），新疆生产建设兵团教育局： 2018年全国职业院校技能大赛鸡新城疫抗体水平测定赛项（高职组）将于2018年5月25—28日在**学院举行，现将有关事宜通知如下： 一、报到时间 2018年5月25日全天至5月26日11:30前 二、报到地点 报到地点：指定入住酒店（详见“四、食宿及接站安排”）报到手续：各参赛队凭身份证、学生证、保险单领取参赛证件、赛项指南和参赛服装。
四、食宿及接站安排 1.住宿安排（费用自理） 2.用餐安排
各入住酒店均提供免费早餐，中晚餐由各参赛代表队自行安排；建议在入住酒店、学院食堂用餐，餐费自理；参赛队成员如对用餐有特殊要求，请务必在回执中注明。 3.接站安排 在以下每个接站点均安排专人接站，安排专用车辆迎送参赛师生前往报到酒店。接站点分别是： （1）高铁南平北站； （2）南平火车南站； （3）九峰大厦（福州长乐机场到南平大巴的终点站） 注：如乘飞机到福州长乐机场的参赛师生，建议先乘坐机场大巴前往福州火车站（车程约1小时），然后乘坐福州火车站至南平北站的高铁或动车（车程约40分钟）；或选择乘坐福州长乐机场到南平的定时大巴，终点在南平九峰大厦，车程大约3小时30分钟。 五、比赛内容 包括试验器材准备、配制1%鸡红细胞悬液、血凝试验、配制四单位病毒、血凝抑制试验、抗体滴度报告等6个方面内容。具体详见2018年全国职业院校技能大赛官网发布的“鸡新城疫抗体水平测定”赛项规程。 六、组队与报名
1．严格按照《2018年全国职业院校技能大赛参赛报名办法》和大赛执委会相关通知执行。 2．本赛项为团体赛,每队由2名选手组成。 3．不得跨校组队，同一学校报名参赛队不超过1支。每支参赛队限配2名指导教师，指导教师须为本校专职教师。 4．报名方式与程序按大赛执委会统一安排，进行网上报名。 七、赛事观摩 本赛项设计观摩区，实时直播竞赛现场实况，观摩人员在指定区域观赛。 八、其他注意事项 1.各参赛代表队须为参赛选手购买大赛期间的人身意外伤害保险。 2.由于接待能力所限，每队不超过5人。 3.参赛选手报到时需携带身份证、学生证和保险单，以便入住登记、核实参赛资格。 4.赛项所有信息都将发布于国赛网站，请随时关注：***https://www.doczj.com/doc/002431801.html,/。 5.各参赛院校务必于5月15日前将参赛回执表（见附件）的电子文档发送至大赛报到邮箱********@https://www.doczj.com/doc/002431801.html,，联系人：丁灵妍******** 附件：参赛回执表.docx 2018年全国职业院校技能大赛 高职组“鸡新城疫抗体水平测定”赛项执委会 赛项承办校：**学院（代章） 2018年5月8日
鸡新城疫抗体滴度的检测 （红血球凝集抑制法） 1 红细胞血凝与血凝抑制的原理 红细胞凝集的实质是红细胞膜上的特异性抗原(凝集原，agglutinogen)和相应抗体(凝集素，agglutinin)发生抗原抗体反应。当病毒的悬液中先加入特异性抗原，且这种抗原的量足以封闭病毒颗粒或其凝集素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其凝集素直接接触，这是红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制，也称为血凝抑制反应。新城疫病毒属于副黏病毒属，是最主要的红细胞凝集性病毒，具有神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，可使红细胞凝集。 2 实验材料 鸡新城疫抗原(NDV，南京天邦生物科技有限公司)；生理盐水；肝素钠；96 孔V 型微量血凝板；微量移液枪 3 红细胞凝集 3.1 1%鸡红细胞悬液的制备 取无免疫过的成年公鸡，翅静脉采血10~15 mL，肝素抗凝，2000 r/min 离心10 min，弃上清，注意要将血细胞泥表面的一层薄膜洗净。然后用血细胞泥5~10 倍的PBS洗涤，2000 r/min 离心10 min，弃上清，如此反复洗涤 3 次至上清液透明，弃上清液后得到红细胞泥。再用PBS配成1%鸡红细胞悬液（红细胞泥：PBS=1ml:100ml）。4℃保存，不超过5d。 3.2 红细胞凝集(4 单位抗原的滴定)
在96 孔微量血凝板上，从左到右每空各加50 μL 生理盐水，另加一排作为重复。再向每排的第 1 孔加入50 μL 新城疫抗原，依次向后倍比稀释直至第11 孔，第12 孔作为对照，无抗原液。然后向每孔加入1%鸡红细胞悬液50 μL，将微量板振荡混匀20~30 次（于微型振荡器上震荡1 m in），置于37℃温箱感作30 min 后每5 min 观察一次，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果。 结果观察：将反应板倾斜45 度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动着为沉淀，表明红细胞未被凝集或不完全被病毒凝集；如果红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。以100%凝集的抗原最大稀释孔位该抗原的血凝价，即1 个凝集单位；从该孔向前移2 孔的抗原稀释度作为4 单位抗原的稀释度。 抗原应稀释的倍数=血凝滴度÷4 (若血凝价为26，病毒抗原应稀释倍数为24（16），即16ml生理盐水+1ml抗原即为4个单位血凝单位的病毒抗原)。 4 红细胞凝集抑制 在96 孔微量血凝板上，从左到右每孔中各加50 μL 生理盐水，再向每排的第 1 孔加入50 μL 待测血清，依次向后倍比稀释直到第10 孔，然后向每孔加入50 μL 4 单位抗原，振荡混匀20~30 次，置于37℃温箱感作20 min。取出再向每孔中加入1%鸡红细胞悬液50 μL，振荡混匀20~30 次，置于37℃温箱感作20 min 后每5 min 观察一次。
实验二多克隆抗体的制备 实验目的和要求： 1、掌握多克隆抗体制备方法 2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定 实验内容： 1、猪链球菌（ 2、7、9型）分型血清制备 2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定 实验方法和步骤： （一）相关免疫血清的制备 2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体 1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组 2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免 3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL 5、分离血清之后，-20℃保存备用 （二）琼脂扩散实验： 材料和试剂 1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液 巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。 2、1%预复琼脂（或琼脂糖） 1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。 3、1%琼脂糖凝胶 1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。 4、抗原及相应免疫血清。 操作步骤 1．预复琼脂玻板的制备
将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。 2．凝胶板的制备 溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。 3．免疫扩散及结果观察 将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。湿盒于25℃中，一般保温24～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。 4．免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。 （三）标本的保存 为了保存标本，可染色处理，步骤如下： 1用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。 2 浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。 3打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。 4用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背景无色为止，干燥保存。也可用0.1～0.5%考马斯亮蓝（10～20%醋酸配制）染色5～15min，再用10～20%醋酸脱色至背景无色，干燥保存。 实验结果 讨论