重楼总皂苷提取分离及其对人胃癌细胞BGC823的抑制作用

其 中 ７ ％乙醇 部 位 滤 液 ６ ℃减 压 回 收 ， 滤 液 水 浴 蒸 干 后 真 ０ ０ 将
空 干燥 即得 重 楼 总 皂 苷 。将 重楼 总皂 苷 配 制 成 ２ ０ ｇ ０ｍ ／ ｍＬ的 溶液 ， 方法 同重 楼 醇 提 物 。
基金项 目： 育部 高校博士点专项 （０ ８３ ５ ０ ７ ； 教 ２ ０ ０ １０ ０ ） 南京市卫 生局 医药卫生科￣ 南京市医学科技发展 项 目（Ｋ Ｏ １ ） Ｚ ＸＩ０ １
附属 鼓 楼 医院 肿 瘤 中心 实 验 室 保 存 ）接 种 于 完 全 培 养 液 中 ．
３ 恒 温 、％Ｃ ： ７ ５ Ｏ 、饱 和 湿 度 培 养 箱 中生 长 ，～ ｄ消 化 传 代 １ ２３ 次 。取 对 数 生 长期 细胞 用 于 细 胞 毒 实验 。 采 用 本 实 验 室 通 过 正 交 实 验 优 选
１ 细 胞株 ． ４
人 胃低 分 化 腺 癌 细胞 株 Ｂ Ｃ ２ （ 南 京 大 学 Ｇ ８３ 由
肿瘤 细胞 增殖 、 导凋亡 等作 用 ， 中以重 楼皂苷 Ｉ 肿 瘤活 性 诱 其 抗 最 强 ． 究最 为广 泛Ｈ。有效 部 位是 中药 研究 的一种 新 的思路 ， 研 ＿ ｑ
其 既去 除 了中药 及其 复方 的杂 质 ． 保 留了化 学成 分相 近 、 效 又 功
Ｂ Ｃ２ Ｇ ８ ３细胞 增 殖 的影 响
取 对 数 生 长 期 的人 胃低 分 化 腺 癌
Ｂ Ｃ２ Ｇ ８ ３细 胞 ． 以每 孔 ６Ｏ ｌ 度 活 细 胞 接 种 于 ９ 加 ．ｘ Ｏ 密 ６孔 板 ， 培 养 ２ｈ弃 培养液 ， 入 含药物 的培养基 （ 组 浓度设立 ３ ４， 加 每 个 复 孔 ） 药 物 终 浓 度 分 别 为 ２ 、２５ ６２ 、． 、＿ 、 。 ５ ｌ．、 ． ３１ １ ６ ５ ３ ５ ０７ １ ／ ．同 时 设 立 只 加 完 全 培 养 液 的 空 白 对 照 组 。 置 于 ． ｘ ｍＬ ８ｇ ３ ０ ５ Ｏ 饱 和 湿 度 的 培 养 箱 培 养 ４ ｈ后 每 孔 加 入 ２ ７ｃ、％Ｃ ８ ｏ
限 公 司 ）Ｏｙ ｕ 倒 置 显 微 镜 （ ，ｌ ｍｐ ｓ 日本 Ｏ Ｙ Ｕ Ｌ ＭＰ Ｓ公 司 ）低 速 ，
溶解 ， 按体 积 比 １１ 入 ＤＩ １ 孑 树 脂 拌 样 ， 干后 上样 于 ：加 Ｏ 大 Ｌ 蒸
Ｄ０ １ １型 大 孔 吸 附 树 脂 ． 以 ５ ７倍 柱 体 积 的 纯 水 、０ ～ ４ ％乙 醇 、
离 心 机 （ 京 医 用 离 心 机 厂 ）Ｅ Ｌ ０ 自动 酶 标 仪 （ 国 Ｂｏ ７ ％乙醇 、０ 北 ， Ｘ ８０ 美 ｉ— ０ ９ ％乙 醇依 次洗 脱 ， 速 ：Ｂ ｆ ， 集 各 梯 度 滤 液 ， 流 ２ Ｖａ 收 ｌ Ｔ ｋ 公 司 ）Ｃ ： 养 箱 （ ｅ ，Ｏ 培 日本 Ｓ Ｎ Ｏ公 司 ） 超 净 工 作 台 （ Ａ Ｙ ， 苏 州 净 化 设 备 有 限公 司 ） 。 １ 主要 试 剂 Ｒ Ｍ １４ － ３ Ｐ Ｉ６０培养 液 （ 国 Ｇ Ｂ Ｏ公 司 ）新 生 美 ＩＣ ，
细胞 ４ ｈ的半 数 抑 制 浓度 （ ５ 分 别 为 （． ＋ ． ）（．１ ０ ３ 、 １ ７ ０Ｏ ） ／Ｌ ８ Ｉ０ Ｃ） ８ ３ ０３ 、２ ￣ ． ） （． ￣ ．１ ｇ 。在 ３１ 、．５ １．１ ／ Ｌ浓度 下 重楼 ６ ０ ６ ０ ９ ｍ ． ６ 、２ ｘ ｍ ３ ２ ５ｇ 醇提 物组 集落 形 成抑 制 率 为 ３ ． ％、３ ７ １０ ， 重楼 总皂 苷 组在 各 浓 度 范 围 内均 无 集 落形 成 。 结论 ： ０８ ４ ５ ． ％、０ ％ 而 ２ 重楼 总 皂 苷 对
一
小 牛 血 清 （ 州 民海 生 物 公 司 ）０ ５ 兰 ，． ％胰 蛋 白 酶 （ 国 Ｓｇ ａ ２ 美 ｉｍ 公 司 ）Ｍ， ’ 国 Ｓｇ ａ公 司 ）Ｄ Ｏ（ 海 凌 峰 公 司 ， 析 ， Ｉ（ ｔ美 Ｉ ｉｍ ， ＭＳ 上 分 纯 ）Ｄ ０ ， １ １型 大孔 吸 附树 脂 （ 海 振 光 树 脂 厂 ） 无 水 乙醇 （ 上 ， 南 京 化 学 试 剂 厂 ）其 他 试 剂 均 为分 析纯 。 ，
１ 实 验 材 料
１１ 药材 ．
重 楼 ． 地 四Ｊ ， 自重 庆 重 楼 中药 饮 片 厂 有 限 产 Ｉ’ Ｉ购
公 司 ， 号 １０ ０ ； 楼 皂 苷标 准 品 Ｉ， 自南京 泽 朗 医药 科 批 ０ ４ １重 购
技 有 限公 司 ， 度 ≥９ ％。 纯 ８
１ 主 要仪 器 Ｒ ０ 型 旋 转 蒸 发 器 （ 海 申顺 生物 科 技有 ． ２ ５１ 上
需 浓 度 ． Ｍ Ｏ终 浓 度 ≤Ｏ １ Ｄ Ｓ ．％。 ２２ 重楼 总 皂 苷 的 制 备 ． 称 取 适 量 重 楼 醇 提 物 用 ８ ％乙 醇 ０
探 索 重楼 抗肿 瘤 天然 有 效部 位— — 总 皂苷 的 提取 分 离方 法 ， 并 ６ ℃过 夜 ， 取药 材粉 末 １０ 。加 ８ 量 ８ ％乙醇 热 回流 提 ０ 称 ０ｇ 倍 ０ 从 而 进一 步评 价重 楼总 皂苷 提取 分离 工艺 和临 床应用 价值 。
簿嬲
重楼总皂苷提取分离及其对人胃癌细胞 Ｂ Ｃ ２ Ｇ ８ ３的 抑 制 作 用
吴夏 慧 薛 娇 胡文静 禹立霞 钱 晓萍 刘 宝瑞 （ 南京 大 学医学 院附属鼓 楼 医院 ， 苏南京 ２ ０ ０ ） 江 １ ０ ８
摘 要 目的 ： 步探 索重 楼 总 皂苷 的 提 取 分 离方 法 ， 通过 比较 重楼 总皂 苷 与 重楼 醇提 物 、 楼 皂 苷 Ｉ对人 胃癌 细 初 并 重
图 １ 重 楼 醇 提 物 、 楼 总皂 苷 、 重 重楼 皂 苷 Ｉ 用 ４ ｈ后 作 ８
Ｂ ＧＣ８ ３细 胞 的 形 态 变 化 （ ２ ｏ） ２ ×ｏ
枝 花 的干燥 根茎 ， 清热 解毒 、 止痛 、 定惊 之 功效 ， 具有 消肿 凉肝
主治疔疮痈肿 、 咽喉肿痛 、 毒蛇咬伤、 跌扑伤痛 、 惊风抽搐等症田 。
实验 室 前期 研究 表 明 ， 重楼 复 方及 重 楼 醇提 物对 肿 瘤 生长 有 良 好 的抑制 作用 １。 ２ 同时 ， 内外大 量文 献报 道重 楼皂 苷具 有抑 制 － ３ ］ 国
人 胃癌 Ｂ Ｃ ２ 胞 生 长抑 制 作 用显 著 优 于 重楼 醇提 物 ， 弱 于 重楼 皂苷 Ｉ， 二 者 Ｉ５数 值 接 近 且 均较 低 ， 而 肯 定 重 Ｇ ８ ３细 稍 但 Ｃｏ 从
楼 总 皂苷 提 取 分 离 工 艺和 临床 应 用 潜 能 。
关键 词 重楼 皂 苷 中图 分 类 号
Ｂ Ｃ２ Ｇ ８ ３细胞 细胞 增 殖 病 理 学 体 外 实验 文献 标 识 码 Ａ 文 章 编 号 １ ７ — ９ Ｘ（ ０ １ ０ — ０ ４ ０ ６ ２ ３ ７ ２ １ ）８ ０ ８— ３
Ｒ ８ ．１． ２ ２ ０５ ７
中药重 楼 （ ｈｚｍａＰ ｒ ｉ 为百 合科植 物 云南 重楼 或 七 叶 Ｒ ｉ ａｉ ｓ ｏ ｄ）
（ Ｋ ０ ０５ Ｙ Ｋ ９ ９ ） Ｙ Ｋ ９９ ，Ｋ ００７ ；
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中； 压｛ ５
２３ Ｍ１ｒ法 比较 重楼 醇 提 物 、 重楼 总 皂 苷 、 重 楼 皂 苷 Ｉ对 － －
少 ， 部 分 细 胞 变 圆皱 缩 ， 壁 漂 浮 ， 重 楼 醇 提 物 组 肿 瘤 细 大 脱 而 胞 形态 改变 不 明显 。以 ６ ５ ｇ ． １／ ２ ｘ ｍＬ浓 度 作 用 时 ， 重楼 总皂 苷 、 重 楼 皂 苷 Ｉ组 肿 瘤 细 胞 形 态 相 似 ， 碎 裂 成 沙 粒 状 ， 重 楼 即 而 醇 提物 组 部 分 肿 瘤 细 胞 变 圆皱 缩 ， 沙 粒 状 改 变 。 无
Ｍ 溶 液 ， 继 续 培 养 ４ 丌 ｈ后 ，弃 上 清 ， 每 孔 加 入 Ｄ Ｏ ＭＳ
１０Ｌ ， 型 混 合 器 震 荡 １ｍ ｎ 充 分 溶 解 结 晶后 ， 自 动 酶 ５１ 微 ． Ｌ ０ ｉ， 用 标 仪双波长 （７／３ｎ ５ ０６ ０ ｍ） 测 定 各 孔 的 光 密 度 值 （ｐ ｃｌ ｏｔ ａ ｉ ｄ ｎｉ ， Ｄ值 ） 按 公式 计 算 肿 瘤 细胞 增 殖 抑 制 率 ： ｅｓｙ Ｏ ｔ 。 抑 制 率 （ ＝ １ 实验 组 ０ 值／ 照 组 Ｏ ％） （一 Ｄ 对 Ｄ值 ） １Ｏ ×０ ％ ２４ 集 落 形 成 实验 ［ 取 对 数 生 长期 的人 胃低 分化 腺 癌 细 胞 ． ７ １ Ｂ Ｃ ２ ， Ｉ０： 密 度 活 细 胞 接 种 于 ２ Ｇ ８ ３ 以 Ｏ ／Ｌ ￣ ４孔 板 ， 养 ２ ｈ 弃 培 ４， 培 养 液 ， 入 含 药 物 的 培 养 基 （ 组 浓 度 设 立 ３个 复 孔 ）药 加 每 ， 物 终 浓 度 分 别 为 １．、． 、．３，ｍＬ 同 时设 立完 全 培 养 液 ２ ６２ ３１ｐ ／ ， ５ ５ ｇ 的 空 白对 照组 。 物作 用 ４ ｈ 弃 上清 ， 完 全 培养 液 ， 续 培 药 ８， 换 继 养 ７ ， 上 清 ， ９ ％酒 精 固 定 ， 晶紫 染 色 ， 显 微 镜 下 计 ｄ弃 经 ５ 结 在 数含 ５ ０个 细 胞 以 上 的集 落 。按 下 式 计 算 集 落 形 成 抑 制 率 ：
类 似 的药 效成 分群 。 合 中药 多 成 分 、 符 多靶 点 、 多效 应 的 作用 特 ２ 实 验 方 法 点 ， 提 取 分 离工 艺 相 对单 体 化 合 物 简单 ， 于研 发 和 临 床 应 ２１ 重 楼 醇 提 物 的 制 备 且 便 ．
用 。 于重楼 良好 的抗 肿瘤 活性 和有 效部 位研 究 的优势 ， 鉴 本实 验 比较 重楼 总皂苷 与其 醇提 物 、 重楼 皂苷 Ｉ 体外 直接 细 胞毒作 用 ， 的重 楼 醇 提 物 制 备 方 法 。将 重 楼 粉 碎 过 二 号 筛 ， 于 干 燥 箱 置 取 ３次 ， 次 ２ ， 滤 ， 液 减 压 浓 缩 ， 滤 液 水 浴 蒸 干 后 真 每 ｈ抽 滤 将 空 干 燥 制 得 干 浸 膏 。 将 重 楼 醇 提 物 用 Ｄ Ｓ 溶 解 定 容 至 ＭＯ ２ ０ ／ ， ３ ０ ｒ ｎ离 心 １ｍ ｎ 取 上 清 ， ０ ２ ｍ 微 孔 ０ｍｇ ｍＬ 以 ０ ０／ ｍｉ ５ ｉ， 过 ． ２ 滤 膜 过 滤 除 菌 ，℃冰箱 保 存 ， ４ 临用 时 用 完 全 培 养 液 稀 释 成 所
胞 Ｂ Ｃ２ Ｇ ８ ３生长 抑 制作 用 评价 重楼 总皂 苷提 取 分 离工 艺和 临床 应 用价 值 。 法 ： 用 热 回 流提 取 法得 到重 楼 醇提 物 ． 经 方 采 再
大孔 吸 附树 脂 分 离得 到 重楼 总皂 苷 。 用噻 唑 蓝 染 色 法（ Ｔ法 ） 集 落 形成 实验 。 采 ＭＴ 和 比较 重楼 总 皂 苷 与 重楼 醇提 物 、 重楼 皂 苷 Ｉ结 果 ： 重楼 总皂 苷 、 楼 醇 提 物 、 楼 皂 苷 Ｉ作 用 于 人 胃癌 Ｂ Ｃ ２ 重 重 Ｇ ８３
集 落 形成 抑 制 率 （ ＝ １ 实验 组 集 落形 成 数 ， 照 组 集 ％） （ 一 对
落 形 成 数 ） ｌ０ ｘ Ｏ ％
■ ＿ ＿ ■ ＿ ■
Ａ重 提物３３ｇ Ｌ Ｂ重 楼醇 ．￣／ 组 １ ｍ 楼总皂苷３ ３ｇ Ｌ组 Ｃ重楼皂苷Ｉ． ￣／Ｌ ． ￣／ １ ｍ １ ｇ 组 ３３ ｍ Ｄ重 提物６５ｇ Ｌ Ｅ重楼总皂苷６ ５￣ Ｌ组 Ｆ重楼皂苷Ｉ． ￣／Ｌ 楼醇 ． ￣／ 组 ２ ｍ ．ｐ／ ２ ｍ ２ ｇ 组 ６５ ｍ