2014年第33卷第12期CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS・3329・
化工进
展
不同区域污水处理厂活性污泥中微生物菌落结构分析
杨倩1，蒋阳月1，王小军1，陈英文1，沈树宝1，石利利2，刘济宁2（1南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京210009；2环境保护部南京环境科学研究所，江苏南京210042）摘要：结合纯种分离纯化和变性梯度凝胶电泳法（DGGE）分析了中国不同区域污水处理厂的曝气池中活性污泥的微生物群落结构及差异性。其中，可培养微生物经纯化后对16s rDNA片段进行PCR扩增并测序，在Blast中分析后构建系统发育树。分离培养得到的89种细菌大部分属于β-变形菌门（Bataproteobacteria）、γ-变形菌门（Gamaproteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。DGGE分析表明所有活性污泥样品中的菌种丰富度都很高，不同的样品中存在很多相同的条带，是属于所有活性污泥中共有的优势菌群，说明不同的活性污泥系统具有高度的生物相似性；每个地区的样品中也都含有自己的特异条带。并且同一地区活性污泥的相似性大于不同地区活性污泥的相似性，主要与各地区不同的自然经济环境和人们的生活习惯相关。
关键词：活性污泥；微生物群落；菌种鉴定；变性梯度凝胶电泳
中图分类号：X508文献标志码：A文章编号：1000–6613（2014）12–3329–08
DOI：10.3969/j.issn.1000-6613.2014.12.033
Diversity of bacterial groups in activated sludge samples from different
areas of China
YANG Qian1，JIANG Yangyue1，WANG Xiaojun1，CHEN Yingwen1，SHEN Shubao1，SHI Lili2，
LIU Jining2
（1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing210009，Jiangsu，China；2Nanjing Institute of Environmental Sciences，MEP，Nanjing210042，Jiangsu，China）Abstract：The diversity of bacterial groups in activated sludge samples received in different sewage treatment plants from different areas of China was investigated by combining with traditional pure culture technique and degeneration gradient gel electrophoresis(DGGE)approach.After the colonies were sequenced，the obtained sequence results by Blast analysis were used to construct the phylogenetic tree.Most bacteria were affiliated with the Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria and Firmicutes.The DGGE patterns showed that there were many common bands in all systems，suggesting the high similarity of bacterial communities in different systems.Meanwhile，there were also specific bands in each sample.Also，the similarity in the same area is greater than that in different areas，which is mainly related to different natural and economic environment and people’s living habits.
Key words：activated sludge；bacterial groups bacterial identification；DGGE
活性污泥法处理废水是用生物法处理废水的最主要方法。活性污泥是处理废水的核心，主要包括各种类型的微生物，如细菌、原生动物、真菌、后生动物、病毒和藻类等，其中细菌约占总微生物种群的95%，并在废水处理过程中起到关键作用[1]。对活性污泥中微生物菌群的研究能够从微观上分析活性污泥处理废水的机理，并且可以有效分析污水处理厂运行过程中出现的诸多问题，如污泥膨胀[2-3]
收稿日期：2014-03-21；修改稿日期：2014-04-03。
基金项目：国家自然科学基金青年基金（21106072）、环保公益性行业科研专项（201309028）及国家863计划（2013AA06A308）项目。
第一作者：杨倩（1986—），女，硕士研究生。联系人：陈英文，博士，副教授。E-mail ywchen@。
化工进展2014年第33卷・3330・
等。因此，活性污泥的微生物群落分析是生物法处理废水的研究重点。在20世纪80年代之前主要以传统的分离培养法为主，如显微镜观察微生物形态、纯种分离纯化、菌落计数等[4-8]，但是培养基选择的不同会导致生长微生物的差异，并且环境中的很多细菌很难通过培养而得到[9]，因此严重影响对菌群结构的分析。另外有研究表明，活性污泥中只有1%～15%的微生物为可培养微生物[10]，因此传统培养法只能获悉活性污泥的部分信息。随着生物分子学技术的发展，基于16S rRNA为主要基石的聚合链式反应（PCR）技术、克隆文库技术、荧光原位杂交（FISH）等免培养的分子生物学技术逐步应用于环境微生物的分析中[11-15]。其中聚合链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）法能够避免传统微生物分离培养的缺陷，且操作简单快捷，广泛应用于环境微生物多样性检验和动态分析中[16-21]。不少研究者用PCR-DGGE法分析了不同运行工艺或不同处理对象的活性污泥之间的差异性，如Abd等[22]分析了两种不同运行工艺的活性污泥的微生物群落组成及动态变化，Nico Boon等[23]比较了处理不同产业废水的活性污泥的菌群差异性，但是对于不同区域活性污泥的差异性报道却很少。
中国地大物博，南北跨度较大，不同区域的自然环境和人文经济情况也相差巨大。本工作结合纯种分离纯化和变性梯度凝胶电泳法等手段，对中国从南方至北方不同区域的污水处理厂的活性污泥中的细菌群落特征和多样性进行分析，揭示其地域差异性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源及试剂
活性污泥样品分别采集自广州、南京、沈阳地区的市政污水处理厂的曝气池末端，各污水处理厂的运行工艺和取样时间见表1。所有样品用无菌采样袋盛装并放入冰盒内保存运回实验室，样品保存在−20℃用于DNA提取。
细菌的培养用LB（Luria-Bertani）培养基，其成分为：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化钠10.0g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。
1.2测定项目和方法
1.2.1活性污泥可培养微细菌数量
采用稀释平板法测定活性污泥中细菌的数量，按照GB4789.2—1994《中华人民共和国国家标准
表1各城市污水处理厂基本情况
地区污水处理厂
实际污水处理量
/万m3·d−1
处理工艺取样时间南京
CD20A2/O2013.3.27
CB30Unitanks2013.4.27
JXZ64A/O2013.4.27
JN4A2/O法氧化沟2013.4.27广州DTS15A2/O2013.5.31 LD20A2/O2013.5.31
LR20A2/O2013.5.31沈阳SSW30浮动填料工艺2013.9.12 XNH40BAF2013.9.12注：A2/O—Anaerobic-Anoxic-Oxic，生物脱氮除磷；Unitanks—交替式生物处理池工艺；BAF—Biological aeratedfilter，曝气生物滤池。
食品卫生微生物学检验菌落总数测定》和SN 0168—92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》进行菌落数测定。
1.2.2活性污泥可培养细菌鉴定
在上述LB培养基上，根据菌落形态、颜色等特征的差异性挑出不同的可培养细菌，每一种菌分别挑取少量，重新在平板培养基上进行三区划线分离，将平板倒置在37℃培养箱中培养。待菌株长好后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物细胞。若有杂菌，须再次进行分离纯化，直到获得纯培养，然后采用16S rRNA基因序列分析技术进行鉴定。16S rDNA片段的扩增，采用引物27F（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R （5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）。PCR扩增体系为25μL，2×Master Mix12.5μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，DNA模板1μL(15ng)，无菌超纯水9.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，共29个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳验证后，送去南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
1.2.3活性污泥DNA提取及PCR扩增和变性梯度凝胶电泳
活性污泥样品经离心后，沉淀部分使用UltraClean TM Soil DNA Isolation试剂盒（Mo BIO Laboratories）提取DNA，然后用1%的琼脂糖凝胶
