蛋白质双向电泳及质谱技术

增加样品溶解性的手段
•变性剂 变性剂
– 改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展 改变氢键结构， – 尿素、硫尿 尿素、
•表面活性剂 表面活性剂
– 溶解疏水基团 – 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去 、非离子去污剂 离子去污剂 和 、 污剂CHAPS等 污剂 等
pH 10
固定pH 梯度 梯度(IPG)示意图 固定 示意图
丙烯酰胺单体 酸缓冲基团： 酸缓冲基团：COOR 碱缓冲基团： 碱缓冲基团： NH3+
CH2 = CH-C-NH-R O
聚丙烯酰胺凝胶
梯度及窄pH梯度 宽pH梯度及窄 梯度 梯度及窄
• 宽pH梯度用于： 梯度用于： 梯度用于
全部蛋白(确定感兴趣蛋白 全部蛋白 确定感兴趣蛋白 的大致位置) 的大致位置
• 固体杂质
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、 – 过滤
样品的溶解
• 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一 成功分离蛋白质的最关键因素之一 • 溶解的目标
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏， 各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降） 中出现新的蛋白点， 中出现新的蛋白点 相应的表示单个多肽的点的强度会下降） – 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等 溶解方法必须允许可能干扰 分离的盐、脂类、 分离的盐 物质的去除 – 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态
– 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白， 才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。 才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
• IPG胶条的 范围 胶条的pH范围 胶条的
– – – – 预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
样品液的准备
标准液： 标准液： 试剂 8M 尿素 50mM DTT 或2mM TBP 4% CHAPS 0.2%两性电解质载体 两性电解质载体 0.0002%溴酚蓝 溴酚蓝 ddH2O
用量
24g 尿素加入 25mL H2O 385mg DTT或 500uL 或 200mM TBP原液 原液 2g 见下表 100uL 0.1% 原液 定容至50mL 定容至
• 盐
– 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 使胶条导电能力增强， – 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮 透析；胶体过滤；
• 离子去污剂
– 如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 ， – 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如 的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton 丙酮沉淀；将含 的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如 ， X-100，NP-40等的缓冲液中并使 等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25% 终浓度＜ ， 等的缓冲液中并使 终浓度
IPG 胶条支架
IPG 胶条 定位
泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内 泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入 胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素： 胶条对蛋白载样量的影响因素： 胶条对蛋白载样量的影响因素
• 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 • 样品的复杂度
蛋白质双向电泳及质谱 技术
大连理工大学 refine
蛋白质双向电泳技术
Fra Baidu bibliotek
双向电泳简介
2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千 是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千 种蛋白质的技术 。 第一向—等点聚焦 第一向 等点聚焦(IEF) 等点聚焦
– pH梯度载体 梯度载体 – pI
第二向—十二烷基硫酸钠 第二向 十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE) 十二烷基硫酸钠
– 极端分子量蛋白的处理
• 小于 小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带 对流混合， • 大于200kD的蛋白，变性为多肽 大于 的蛋白， 的蛋白
固定pH梯度 固定 梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)胶条的制备 梯度 胶条的制备
梯度器
A
酸 碱
塑料支持膜
D
B
E
C
F
pH 3
• 窄pH梯度用于： 梯度用于： 梯度用于
提高分辨率 增加载样能力以检测、 增加载样能力以检测、分析 更多蛋白
IPG 胶的重泡涨及上样
2-DE 样品 重泡涨溶液
重泡涨溶液： 重泡涨溶液：
8M 2% 2% 0.28% 微量 尿素 NP-40 或 CHAPS IPG缓冲液 (两亲性电解液 两亲性电解液) 缓冲液 两亲性电解液 DTT 溴酚蓝
– 液氮冷冻
• 去污剂降解(酵母、霉菌) 去污剂降解 酵母、霉菌 酵母
– 降解缓冲液 含尿素和去污剂 降解缓冲液(含尿素和去污剂 含尿素和去污剂) – SDS(应在 应在IEF前去除 前去除) 应在 前去除
• 酶降解(植物、细菌、真菌) 酶降解 植物、细菌、真菌 植物
– 溶菌酶 细菌 溶菌酶(细菌 细菌) – 纤维素酶，果胶酶 植物 纤维素酶，果胶酶(植物 植物) – 溶壁酶(酵母 溶壁酶 酵母) 酵母
破碎
富集
按溶解度分级
溶解
除杂
样品的破碎
原则－ 原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式 的蛋白降解 样品的来源
易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌 温和
方法
剧烈
温和破碎法
• 渗透压冲击 培养的细胞) 渗透压冲击(培养的细胞 培养的细胞
– 低渗液中的悬浮细胞
• 反复冻融法 细菌) 反复冻融法(细菌 细菌
– SDS作为变性剂和助溶剂 作为变性剂和助溶剂 – 分子量
双向电泳的基本原理与流程示意
两性电解质
pH 9 聚丙烯酰胺
样品
-
等点聚焦 (第一向) 第一向)
pH 3
+
第二向
分子量
SDS-PAGE
pH 梯度 梯度(pI)
双向电泳具体步骤
• 样品制备
– 缓冲液的配制
• IPG条重泡涨及上样 条重泡涨及上样 • 第一向：IEF 第一向： • IPG条平衡 条平衡
– 其他固体杂质
DNA/RNA的去除 的去除
• 样品中含核酸的不利影响
– 能被银染色法染色 – 在凝胶酸性部分产生水平条纹 – 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀 凝胶酸性端时， 当样品到达 凝胶酸性端时
• 去除方法
– – – – 蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 处理 超声(机械破坏 机械破坏)、 超声 机械破坏 、超高速离心 DNA/RNA抽提 苯酚 氯仿 抽提(苯酚 氯仿) 抽提 苯酚/氯仿
– 平衡缓冲液Ⅰ(还原 平衡缓冲液Ⅰ 还原 还原) – 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化 巯烷基化) 平衡缓冲液Ⅱ 巯烷基化
• 第二向：SDS-PAGE 第二向： • 胶条染色 • 成像及图像分析
为什么要进行样品制备 ？
目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质 个蛋白质 目前双向电泳一般只能分辨到 万种以上。 点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到 万种以上。 ，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上 待研究样本(如临床样本 常是各种细胞和组织混 待研究样本 如临床样本)常是各种细胞和组织混 如临床样本 而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。 杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。
•还原剂 还原剂
– 使变性蛋白进一步伸展溶解 – 含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB) 或 巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯 含自由巯基的 巯基乙醇
•起载体作用的两性电解质 起载体作用的两性电解质
– 到达平衡位置形成 梯度，“运载”电流、pH 到达平衡位置形成pH梯度 梯度， 运载”电流、 – 捕获样品中少量盐分 – 浓度应小于0.2％（ ，浓度过高会使IEF的速度降低 的速度降低) 浓度应小于 ％（w/v，浓度过高会使 ％（ 的速度降低
样品制备原则
1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，
– 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（ 白）。 – 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（ 解等）。 解等）。 – 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 – 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白， 检测性。 检测性。 – 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。
剧烈破碎法
• 超声破碎 细胞悬浮液) 超声破碎(细胞悬浮液 细胞悬浮液
– 需以冰冷却避免过热
• 弗式细胞压碎器 弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物 ，
– 细胞在剪切力作用下破碎
• 研磨 固体组织，微生物) 研磨(固体组织，微生物 固体组织
– 液氮中将固体组织磨成细粉末
IPG 用两亲性电解液的组成
两亲性电 两亲性电 IPG 胶 解液范围 解液浓度 pH 范围 (w/v) 3-10 3-10 40% 4-7 4-6 40% 40% 5-7 3-6 3-5 40% 4-6 40% 5-8 5-8 40% 7-10 7-9 40% 8-10 20% 样品溶液 样品溶液 体积 体积 (/5ml) (/5ml) 25µl 250 µ l 12.5 µ l 125 µ l 12.5 µ l 125 µ l 25 µ l 250 µ l 12.5 µ l 125 µ l 25 µ l 250 µ l 12.5 µ l 125 µ l 25 µ l 250 µ l
2 最大限度减少样品的损失
– – – – 低温保存样品(一般需低于 ℃ 低温保存样品 一般需低于-86℃) 一般需低于 尽量缩短处理时间 除盐， 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。
样品制备流程及注意事项
预处理
(清洗等 清洗等) 清洗等
样品制备注意事项
• 蛋白质水解
– 低温 – Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质 碱 – 蛋白抑制剂
• 特殊样品的制备
– 低丰度蛋白的分离
• 预分级 • 窄pH胶(<2个pH单位 胶 个 单位) 单位
– 强碱性蛋白 如核糖体)的处理 强碱性蛋白(如核糖体 的处理 如核糖体
• 预处理富集 • 特殊pH梯度的 胶条（ 特殊 梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦 梯度的 胶条 － 、 或 ）
第一向： 第一向：等点聚焦
1. 放置电极垫 (?) 2. 200 V 3. 500 V 维持 维持 1.5h
支架盖
电极垫
1.5h 1500vh 36000vh
IPG 胶条 电极
4. 1000 V 梯度上升 5. 8000 V 梯度上升 (?)
电压
时间
IPG 胶条的平衡
其他杂质的去除
• 脂质
– 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI – 丙酮沉淀
• 多糖
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、 – TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯 苯酚沉淀；超速离心和高 、硫酸铵或醋酸铵 甲苯 苯酚沉淀；超速离心和高pH 甲苯/苯酚沉淀
• 样品研磨器 用于少量样品的处理) 样品研磨器(用于少量样品的处理 用于少量样品的处理
– 用于精确样品
• 珠磨法 胞悬液，微生物) 珠磨法(胞悬液，微生物 胞悬液
– 通过磨珠研磨破坏细胞壁
样品的沉淀
• 作用
– 去除杂质 – 浓缩样品 – 抑制蛋白酶活性
对于疏水性特别强的蛋白 如膜蛋白
– 硫脲 – SDS – 新型两性表面活性剂(如磺 新型两性表面活性剂 如磺 基甜菜碱) 基甜菜碱
• 关键-可溶性 关键 可溶性
– 获得可以重新溶解的蛋白
• 常用方法
– – – – – 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇 甲醇/苯酚抽提 醋酸铵 甲醇 苯酚抽提
样品中杂质的去除
• 去除原则
– – 尽量不丢失蛋白 减少蛋白的修饰
• 杂质的主要种类
– – – – DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂