医学微生物学实验指导
皖南医学院微生物学和免疫学教研室
2006年5月
微生物学实验的目的与要求
医学微生物学的实验课是本课程学习中的重要环节。
医学微生物学实验课的目的：在于使学生加深和巩固对讲课内容的明白得和体会，并在系统学习理论的基础上，使学生学习并把握微生物学的差不多操作技术，培养独立摸索的能力，为今后的临床实践及科学研究工作打下良好的基础。
为了提高实验课的成效，应做到以下几点：
一、每次实验前作好预习，明确实验目的，内容，操作中注意点及其理论依据，幸免或减少错误发生。
二、在实验过程中，应持严肃认确实科学态度，并要注意合理地分配和利用时刻。
三、在微生物学的整个实验过程中，应严格加强“无菌观念”的培养和训练。
四、实验结果须真实记录，进行分析，得出结论。如实验结果与理论不符，应探讨缘故，训练科学思维的能力。实验完成后，要写出实验报告。
微生物学实验室规则
微生物学实验的对象大多是病原微生物，因此必须严格贯彻“无菌观念”，防止实验中自身感染和环境污染是微生物学实验室的最重要原则。
一、尽量不带个人一辈子活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。
二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。
三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及躯体其他暴露部位。
四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情形，应赶忙报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。
五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后赶忙投入已预备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。
六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。
七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。
实验一自然界与人体的微生物检查
实验目的：
了解微生物在空气、物体表面及正常机体表面的分布，增强消毒及无菌操作的观念。
实验材料：
一般琼脂平板、无菌棉棒、无菌生理盐水、蜡笔、酒精灯。
实验内容：
一、空气中微生物的检查：
取无菌一般琼脂平板一只，打开后暴露在空气中，30分钟后盖好，置37℃温箱孵育24小时，观看各种菌落的特点。
二、皮肤、粘膜及其它物品表面微生物的检查：
取一般琼脂平板一只，用蜡笔在皿底玻璃上划分四区，将标签纸贴于正中，分不注明皮肤、粘膜、硬币或钢笔等字样。然后反转，打开平板：
1、用手指在注明“皮肤”处琼脂上轻轻擦拭。
2、把沾取了无菌生理盐水的湿棉棒在管壁上挤干水，擦拭咽部或鼻腔粘膜，然后轻轻抹在“粘膜”处琼脂上。
3、分不取硬币或钢笔等物在相应区域内抹擦。
盖好平板，置37℃温箱内孵育24小时后，观看菌落的生长情形。
实验报告：
观看与记录结果。
实验二油镜的使用
实验目的：
熟悉显微镜的使用方法。
实验材料：
标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。
实验原理：
使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜专门小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观看不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的
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图1 油镜的原理示意图
实验方法：
1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，阻碍观看造成污染。
2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采纳直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调剂集光器和光圈以获得最适亮度。染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度专门强。
3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。
4、低倍镜找出标本的范畴，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观看并缓慢转动粗调剂器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调剂器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调剂器转动至物象完全清晰为止。
5、观看完毕，取下标本片，赶忙用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一洁净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
6、显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形，集光器下降，反光镜推平，光圈关上，归还显微镜室。
实验三细菌的差不多形状和专门结构
实验目的：
把握细菌的差不多形状和专门结构。
材料及方法：
一、细菌的差不多形状（示教）
1、球菌：葡萄球菌，革兰氏染色阳性。
2、杆菌：大肠杆菌，革兰氏染色阴性。
3、弧菌：霍乱弧菌，革兰氏染色阴性。
二、细菌的专门结构（示教）
1、荚膜：肺炎球菌，成双排列，菌体四周不着色的透亮圈即是荚膜所在处。经荚膜染色后，菌体与背景出现紫色，荚膜为无色。
2、鞭毛：伤寒杆菌，菌体四周有周鞭毛。经鞭毛染色后，菌体和周鞭毛均呈紫色。
3、芽胞：破伤风杆菌，菌体细长，顶端可见一正圆形芽胞。经芽胞染色后，菌体为蓝色，芽胞为红色。
实验报告：
1、绘图讲明各种形状细菌的大小、形状、排列方式，并注明染色性及放大倍数。
2、绘图讲明细菌的专门结构，并注明染色性及放大倍数。
实验四基础培养基的制备
培养基是依照微生物生长繁育时对营养物质的需要而配制的营养制品，含有营养物质及适宜的酸碱度，经灭菌后使用。
常用的培养基按用途分为：基础培养基、营养培养基、鉴不培养基、选择培养基及厌氧培养基。按物理性状分为固体、半固体和液体三种。
实验目的：
了解常用的液体、固体、半固体培养基的成分、制备方法和用途。
实验材料：
牛肉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、0.1mol/lNaOH溶液、酚红指示剂、蒸馏水等。
实验方法：
一、肉汤培养基
1、将鲜牛肉除去筋膜和脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎，以每500g碎牛肉加1000ml蒸馏水的比例混合后，置4℃冰箱过夜。
2、次日取出浸泡物倒入容器内煮沸半小时，使肉渣凝固，也可煮沸一小时不经冰箱过夜。
3、用纱布和脱脂棉过滤，除去肉渣，即成肉浸汁。加入1%蛋白胨及0.5%氯化钠，加热溶解并用蒸馏水补足蒸发失去的水分。
4、待冷至50℃左右时，调该溶液的pH至7.4~7.6。校正pH的方法为：①取三支与标准比色管（pH7.6）相同的空比色管，其中一管内盛放蒸馏水5ml；
