华中科技大学发酵工程第二章工业用微生物菌种

2. 菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计
含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）
样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现）
菌种分离
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌பைடு நூலகம்
未培养微生物
定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法
二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌
筛选方法：
▪ 固体培养筛选
铺菌法 复印平板法
液体培养筛选
抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
▪ 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
A
μ
B
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
连续富集培养技术分离菌株的优点
分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； 培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
最常用的工业微生物
酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
最常用的工业微生物
结果有两种可能：
获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株
寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
本章内容
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才
有筛选意义。
最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例 抗生素产生菌的筛选 药理活性化合物产生菌的筛选 生长因子产生菌的筛选 多糖产生菌的筛选
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件