分子生物学技术在产前诊断中的研究进展
【摘要】染色体病是由染色体数目异常或结构畸变引起的疾病，该病的早期诊断尤其是产前诊断，已成为人们研究疾病的焦点。现从传统的染色体核型分析技术、染色体荧光原位杂交技术、多色荧光原位杂交技术、比较基因组杂交技术，以及分子生物学技术等方面对染色体病在分子细胞遗传学这一领域的研究进展作一综述。
【关键词】产前诊断； 分子生物学；
产前诊断又称宫内诊断或出生前诊断,是指胎儿出生前应用多种检测手段,如影像学、生物化学、细胞遗传学及分子生物学等技术,对胎儿先天性缺陷或遗传性疾病进行诊断,是实现优生优育的重要措施之一。根据对胎儿出生前进行宫内诊断所采用的方法对母体或胎儿是否造成创伤性而将产前诊断技术分为有创性和无创性。有创性技术包括绒毛活组织检查、羊水穿刺、胎儿脐带血穿刺、胎儿镜检查及胚胎活检;无创性技术包括植入前遗传学诊断( PGD) 、胎儿细胞诊断、宫颈黏液冲洗、孕妇血清筛查及超声诊断。由于有创操作对孕妇和胎儿有感染、流产等潜在危害而不易为孕妇接受。传统的产前诊断途径采用胎儿细胞进行遗传学分析获得染色体核型。其有检测周期长、标本培养后易污染等缺点。随着分子生物学技术的迅猛发展，相应产生了分子细胞生物学的新技术，这些技术包括聚合酶链反应技术（PCR）、荧光原位杂交技术(荧光原位杂交技术(fluoreeence in situ hybridization，FISH)、引物源位标记技术(PRINS)、光谱核型分析(spectralkaryotyping，SKY)技术等。现将对这些分子生物学方法在产前诊断中的应用作以综述。
3. 引物原位标记技术(the primed in situ labeling)
3.1历史与发展
引物原位标记(primed in situ labeling，PRINS)技术是Koch等于1989年建立的DNA分析的新方法，是在染色体水平上利用常用寡核苷酸作为引物在间期细胞或染色体上原位合成DNA，在合成DNA的同时掺人生物素标记的核苷酸，通过抗生物素连接信号将特异的荧光染色体信号显示在相应的DNA扩增部位，反映该部位的特殊改变。PRINS技术在染色体病诊断研究中，可直接在问期核中进行，不仅能为判别易位、缺失等重排类型、来源和断裂点提供可靠的依据，而且能鉴别一些环状染色体、双着丝粒染色体及其他畸变染色体。自Koch建立PRINs技术以来，许多学者在此基础上根据研究目的不同建立起相应的PRINS技术。1993年，Terkelso等提出重复引物原位标记(repeat—ed PRINS)技术，通过重复的退火、延伸循环反应，以提高被检测的DNA信号强度。他们发现，信号强度比单纯PRINS技术提高15倍左右，又能保持反应的特异性，便于观察。1994年Hind kjaer等提出多色PRINS技术，在同一条染色体标本上，用不同特异性引物掺入不同的标记物分别进行多次PRINS反应，通过显色定位多个靶基因。1995年Pellestor等建立起来的快速PRINs技术采用温热循环，使退火和延伸反应温度可精确至0.1℃，使反应更快速，结果更准确。PRINS 技术不仅能检测重复序列，而且能检测低拷贝序列，从而可检测出用常规细胞遗传学技术难以检出的染色体微小区域(如染色体亚末端)的畸变。De—Vries等。研究了针对染色体亚末端的41个克隆探针及其相应的检测引物，使得利用PRINs技术特异性检测染色体亚末端成为可能，对染色体病的诊断水平有极大的补充与提高作用。PRINS技术因有许多独特优点而被认为是FISH技术的潜在替代者，是染色体病诊断的重要手段。
引物原位标记(primed in situ，PRINS)技术是继原位PCR之后而创建的分子细胞生物学新技术，用于细胞或染色体原位检测DNA或RNA。PRINS技术与传统的原位杂交和原位PCR 杂交技术相比较，具有快速、高效、简便等优点。传统的荧光原位杂交(FISH)技术需进行复杂的探针制备，价格昂贵，费时费力；原位杂交敏感性有限，至少20个拷贝的核酸序列才能检测；常规PCR在液相中进行，很难将扩增结果与组织形态学结果联系起来。PRINS技术克服了以上缺点，它可以同时获得细胞及细胞形态结构信息与分子信息，引物序列与普通PCR 相同，价格低廉，整个过程只需4～6 h即可完成。该法可应用于出生前、出生后或胚胎移植前综合症的临床诊断。
与FISH技术相比，PRINS技术有如下优点：(1)相对价廉：PRINS主要的研究材料寡核苷酸引物的合成与FIsH技术需要制备的复杂探针
相比是相当容易且价格低廉的。(2)特异性强：FISH技术检测中使用的探针在与第13、21号染色体杂交时，由于第13号和第21号染色体的靶序列有极高的同源性，2条染色体都会发生杂交反应，影响结果判断。而PRINS在进行延伸反应时，引物37末端一个碱基的错配即可阻止延伸反应的进行，由此保证了对待检DNA序列的高度特异性，即可分别对第13号和第21号染色体进行准确检测[6]。(3)准确性高：在PRINS 反应中，所用的引物没有被标记，只有与被检测的靶DNA序列互补的新合成的链被标记，由此可以减低背景信号，提高标记信号的特异性和准确性。PRINS的出现推动了染色体病诊断技术的发展。随着引物的设计、标记方法的提高，PRISN技术在不断完善，从而为染色体病的临床诊断开辟了一条新途径。
3.2 Prins的原理
Prins技术的基本原理是在保持组织细胞形态结构的基础上，依赖细胞膜和核膜的通透性，在细胞胞浆或核中进行原位标记特定DNA 或mRNA序列。以靶DNA或mRNA序列为模板，将含有寡核苷酸引物(未标记的探针)、生物素或地高辛等非同位素标记的脱氧核苷酸以及适量的DNA聚合酶或者RNA逆转录酶加到玻片上，在退火温度下已变性的DNA或mRNA与引物特异性结合并延伸，已标记的脱氧核苷酸掺入新合成的链中。通过相应的检测系统便可将已被标记的靶基因检测出来并显示其引物延伸的位置。Prins反应所需的引物一般按待测的靶基因的核苷酸序列设计而成，所以引物一般具有特异性。
3.3 Prins的类型
以起始物分类：Prins可分为以DNA为起始物的Prins和以RNA为起始物的Prins。以测试样品不同可分为组织切片Prins、外周血中期或间期细胞Prins、绒毛细胞Prins、羊水细胞Prins、孕妇外周血中胎儿细胞Prins等。以反应体系中标记脱氧核苷酸的原料不同可以分为直接Prins和间接Prins。
1、直接法Prins 其基本原理是在原位合成DNA或RNA的过程中掺入标记核苷酸，如掺入荧光标记物，延伸反应后可直接在荧光镜下观察反应结果，使该技术更为快速简便，其信噪比与间接法相似，但荧光信号易淬灭，不利于长期保存结果。
2、间接法Prins 间接法Prins的原理是将Prins技术与细胞免疫技术结合起来。用生物素或地高辛标记核苷酸，还要连接一个荧光标记抗体检测或连接碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，通过酶一底物显色系统显色，后者的实验结果易于长期保存。其本质是具有特异序列的引物遵循碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸片段结合而将其定位，有一个碱基的错配即可阻止延伸反应的进行，保证了延伸反应的高度特异性该技术具有染色本底低、分析时间短和信号强度高、不需克隆基因做探针等优点，其应用日益广泛，在产前诊断方面主要用于预测胎儿性别、诊断染色体病和诊断单基因遗传病等。
3.4在诊断染色体病中的作用
染色体病包括染色体数目异常和结构畸变。染色体数目异常占新生儿出生缺陷的95％以上，其中最常见的是21三倍体。Koch等[8]首先于1995年用Prins方法标记了除6、19、20号以外的全部人类染色体，检出了单倍体、三倍体、四倍体等染色体病。2003年，德国的Mennicke K[9]比较了Prins和Fish两种方法在产前诊断18号染色体数目异常，结果发现结果相似，正确率均大于95％，但Prins更快速，简便。2001年，我国学者刘福民等人用Prins 方法标记了绒毛细胞问期核21号染色体，诊断21号染色体数目异常获得成功。以后我国又有学者相继检出了18三倍体以及x、Y染色体数目异常。以上研究均证实，Prins方法在产前诊断染色体数目异常方面具有快速、准确、简便的特点。染色体结构畸变包括染色体缺失、易位等结构重排。Prins技术通过研究染色体显带、基因定位及核苷酸顺序来诊断染色体结构畸变。Pellstor等用Prins技术检测到13号染色体上发生的结构异常，直接检测到了罗伯逊易位和环状畸变，这是其他传统的细胞遗传学技术办不到的。
3.5诊断单基因遗传病
单基因遗传病是由于单个基因的缺失或突变引起的疾病。假肥大型肌营养不良(DMD)是小儿时期最常见的遗传性神经肌肉病。Harrel等[1妇于2001年用重复引物原位标记方法扩增了一个273bp的DMD基因，定位于外显子8，大大提高了检测低拷贝或单拷贝基因的敏感性，标志着细胞生物学技术又上了一个新的台阶。随着Prins技术的不断改进、完善，其在产前诊断方面的应用必将更加广泛，同时对细胞生物学及临床诊断学的发展起到促进作用。
