鸽过氧化物还原酶基因的克隆与进化分析

1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆与序列分析
郑艳;管艺飞;刘长江
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2006(034)012
【摘要】以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因dhaT,并将该基因克隆到pMD19-T Simple载体.基因序列分析表明,dhaT基因全长为1 158bp,与GenBank上已发表基因序列的同源性达99%,氨基酸同源性为100%.
【总页数】2页(P2650-2651)
【作者】郑艳;管艺飞;刘长江
【作者单位】沈阳农业大学食品学院食品生物技术实验室,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学食品学院食品生物技术实验室,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学食品学院食品生物技术实验室,辽宁,沈阳,110161
【正文语种】中文
【中图分类】Q554
【相关文献】
1.编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达 [J], 张晓梅;唐雪明;诸葛斌;沈微;饶志明;方慧英;诸葛健
2.1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与原核表达 [J], 李红梅;陈佳;李琳;徐斐
3.丁酸梭菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J],
杨登峰;韦宇拓;黄日波
4.克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 周文广;黄日波
5.克雷伯肺炎杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因克隆及表达条件研究 [J], 曲荟锦;王凤寰;田平芳;谭天伟
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

某大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 钙泵即钙通道蛋白，可以对生物膜内外Ca2＋进行跨膜转运。

（）答案：错误解析：钙泵介导直接消耗ATP的主动运输，逆浓度梯度将Ca2＋由胞质（低浓度）泵入内质网或者细胞外（高浓度）。

而钙通道介导是被动运输，不消耗能量，顺浓度梯度协助扩散Ca2＋进入胞质。

2. 为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。

（）答案：错误解析：电子显微镜可采用负染色，只染背景而不染样品，光学显微镜可以对标本进行化学染色使反差增大。

3. 磷脂极性头部是带正电荷的，因此它可以直接与带负电荷的氨基酸残基直接相互作用。

（）答案：错误解析：磷脂极性头部是带负电荷的，它可以直接与带正电荷的氨基酸残基直接相互作用，与带负电荷的氨基酸残基作用时，需通过Ca2＋、Mg2＋等阳离子为中介。

4. 单细胞生物不存在细胞分化的现象。

（）答案：错误解析：同多细胞生物一样，单细胞生物也存在细胞分化现象，也涉及一系列基因的特异表达。

5. P选择蛋白与P钙黏蛋白中的P的含义是相同的。

（）[中山大学2008研]答案：错误解析：P选择蛋白的P表示的是血小板，P钙黏蛋白的P源自于胎盘。

这些命名表示了最初发现它们的细胞类型。

6. 溶酶体发挥活性的最pH范围是5～6。

（）[北京师范大学2007研]答案：错误解析：溶酶体发挥活性的最pH范围是5左右。

7. 动物细胞胞质中一般具有中间丝蛋白库。

（）答案：错误解析：中间丝蛋白位于细胞核内。

8. 将光驱动的质子泵噬盐菌菌紫质（bacteriorhodapsin）与ATP合成酶置于同一脂质体中，在光照下可由ADP和磷酸产生ATP。

（）[南京师范大学2008研]答案：正确解析：9. 叶绿体的核酮糖二磷酸羧化酶是由16个亚基组成的聚合体，其中8个大亚基是核基因编码的。

植物过氧化物酶同工酶的研究进展顾雯雯;胡亚婷;韩英;卞涵佳;罗兵;孙海燕;万能;杨志刚;沈宗根【摘要】过氧化物酶(Peroxidase,POD)是植物体内广泛存在的氧化还原酶,在植物体内具有多种同工酶.POD同工酶具有种属、器官以及发育阶段特异性.它作为遗传标记广泛应用于植物的品种鉴定、遗传多样性分析、植物抗病性分析等方面.该研究综述了植物POD同工酶检测技术的研究进展以及POD同工酶的应用,提出进一步研究植物POD同工酶的建议.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)034【总页数】3页(P12011-12013)【关键词】植物;过氧化物酶同工酶;研究进展【作者】顾雯雯;胡亚婷;韩英;卞涵佳;罗兵;孙海燕;万能;杨志刚;沈宗根【作者单位】常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟215500;苏州市五月田有机农业科技有限公司,江苏吴江215216;吴江市平望战友葡萄专业合作社,江苏吴江215221;苏州市五月田有机农业科技有限公司,江苏吴江215216;常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟215500;常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟215500;常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟215500;常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟215500;常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟215500【正文语种】中文【中图分类】S188过氧化物酶(Peroxidase，POD)是植物体内广泛而大量存在的、活性较高的一种氧化还原酶。

它能催化植物体内多种反应，参与光合作用、呼吸作用、抗病作用、植物生长等众多生理活动。

POD在植物体内具有多种同工酶。

在植物不同的组织器官、不同的生长发育时期、不同的生理状态(如病虫害、逆境胁迫等)和不同品种中，POD同工酶的活性和数目变化都很大。

POD同工酶能够在很大程度上反映植物生长发育的特点、生物代谢状况、适应外界环境能力以及品种之间的遗传差异［1］。

超氧化物歧化酶的研究进展学生：杨青青生命科学院10级研究生摘要：超氧化物歧化酶是一种广泛存在于生物体内各个组织中的重要金属酶，是一种能够特异性清除机体代谢过程中产生的自由基的抗氧化酶，近年来成为化学、生物学、医学、日用化工、食品科学和畜牧兽医学等多个学科领域研究的热点。

深入研究SOD及其与机体内铜、锌、铁、锰等元素代谢的关系，不仅有着重要的理论意义，而且具有重要的实用价值。

本文将从其来源、种类和分布、结构和理化特性、作用机理及生理功能、SOD基因的克隆和表达、分离纯化、制备开发应用等方面进行综述，并探讨和分析了目前存在的问题及应用前景，旨在为超氧化物歧化酶的研究、开发、应用提供参考。

关键词：超氧化物歧化酶；基因克隆；蛋白表达；分离；纯化；应用Research Advances in Superoxide DismutaseStudent: Yang Qing-Qing10 graduate student, School of life science, Shanghai University Abstract:Superoxide dismutase is an importance metal enzyme of widely various tissues in vivo, which is an antioxidant enzymes can specifically remove free radicals produced during metabolism and has been an inquiring hot spots in many fields such as chemistry, biology, medicine, daily chemical industry, food science and animal husbandry and veterinary science and so on in recent years. It not only has an important theoretical significance but is of an important practical value to study the relationship between SOD and the elementary metabolism of cup rum (Cu), zine (Zn), ferrum (Fe) and manganese (Mn). This article will not only summarize from its source, type and distribution, structure and physicochemical properties, function mechanisms and physiology functions, SOD gene cloning and expression, purification development applications but also analyze and discuss the problems and prospects of the future aiming at providing reference for the research, development and application of SOD.Key words: Superoxide dismutase; Gene cloning; Protein expression; Isolation; Purification; Application前言氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都是直接或间接由氧转化而成的。

中国水产科学 2016年7月, 23(4): 791-799 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2015-10-26; 修订日期: 2015-12-16.基金项目: 国家863计划项目(2012AA10A411); 国家自然科学基金项目(41176151, 41276177); 福建省种业创新与产业化工程资助项目(2014S1477-10); 福建省自然科学基金项目(2014J05041, 2014J07006).作者简介: 张晗晗(1991–), 女, 硕士研究生, 主要从事坛紫菜遗传育种研究. E-mail: zhanghanhan9213@ 通信作者: 谢潮添, 教授. E-mail: ctxie@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2016.15403坛紫菜谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及表达特征张晗晗, 徐燕, 纪德华, 陈昌生, 许凯, 谢潮添集美大学 水产学院, 福建 厦门 361021摘要: 谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)是植物活性氧(ROS)清除酶促系统的重要成员之一, 在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。

本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis )为研究材料采用RACE 技术克隆获得了一条坛紫菜的GPX 全长基因序列, 命名为PhGPX (GenBank 收录号: JX673908)。

该基因序列全长1027 bp, 包含555 bp 的开放阅读框, 所编码的多肽包含184个氨基酸, 分子量为19.9 kD, 等电点为8.76。

多序列比对和系统进化树分析结果表明PhGPX 属于植物GPX 基因家族成员。

基因表达水平的qPCR 分析结果表明PhGPX 基因在坛紫菜叶状体和丝状体世代中的表达水平没有显著差异; 高温胁迫不同时间水平下, PhGPX 基因的表达水平呈现为先上调后下调的趋势; 不同失水胁迫条件下, PhGPX 基因的表达不受低水平的失水胁迫影响, 但可被高水平(>40%)的失水胁迫所抑制, 且在复水30 min 后仍然无法恢复失水胁迫前的水平。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(１):３９￣４６ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ唐跃辉ꎬ赵雨凡ꎬ蒋心言ꎬ等.麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(１):３９￣４６.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０１.００４麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析唐跃辉ꎬ㊀赵雨凡ꎬ㊀蒋心言ꎬ㊀张英颖ꎬ㊀王㊀寒ꎬ㊀包欣欣ꎬ㊀范雨杰ꎬ㊀李㊀彤(周口师范学院生命科学与农学学院ꎬ河南周口４６６００１)收稿日期:２０２３￣０９￣０２基金项目:河南省高等学校重点科研项目(２４Ａ１８００２９)ꎻ河南省周口师范学院大学生创新创业训练计划项目(２０２２１０４７８０３８㊁２０２２１０４７８０４０)作者简介:唐跃辉(１９８５－)ꎬ男ꎬ河南许昌人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事植物基因克隆与功能研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｈｔａｎｇ２００５＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因与植物的生长和对环境胁迫的抗性密切相关ꎬ被认为是作物改良的关键因子ꎮ在本研究中ꎬ我们通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术从麻风树中克隆了１个ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因ꎬ命名为ＪｃＨＤＺ２８ꎮＪｃＨＤＺ２８基因包含１个８８２ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码１个含有２９３个氨基酸的蛋白质ꎮ氨基酸序列分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８含有高度保守的同源结构域和亮氨酸拉链(ＬＺ)基序ꎮ表达模式分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因在种子中的相对表达量最高ꎬ且盐胁迫下调该基因的表达ꎮ亚细胞定位分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因编码１个核定位蛋白ꎮ过表达ＪｃＨＤＺ２８基因增加了转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性ꎬ且在盐胁迫条件下ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥ꎬ相对电导率显著高于野生型拟南芥ꎬ非生物胁迫相关基因在转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥中的表达也显著低于在野生型拟南芥中的表达ꎮ本研究结果可以为进一步阐明ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因ＪｃＨＤＺ２８在麻风树生长发育和响应非生物胁迫中的功能提供理论依据ꎮ关键词:㊀麻风树ꎻＪｃＨＤＺ２８ꎻＨＤ￣Ｚｉｐꎻ盐胁迫ꎻ转基因拟南芥中图分类号:㊀Ｓ５１１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０１￣００３９￣０８ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ＴＡＮＧＹｕｅ￣ｈｕｉꎬ㊀ＺＨＡＯＹｕ￣ｆａｎꎬ㊀ＪＩＡＮＧＸｉｎ￣ｙａｎꎬ㊀ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ￣ｙｉｎｇꎬ㊀ＷＡＮＧＨａｎꎬ㊀ＢＡＯＸｉｎ￣ｘｉｎꎬ㊀ＦＡＮＹｕ￣ｊｉｅꎬ㊀ＬＩＴｏｎｇ(ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＡｇｒｏｎｏｍｙꎬＺｈｏｕｋｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｏｕｋｏｕ４６６００１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｇｅｎｅｓｏｆＨＤ￣Ｚｉｐｆａｍｉｌｙａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄａｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ.ＩｎｔｈｅｓｔｕｄｙꎬｗｅｃｌｏｎｅｄａＨＤ￣ＺｉｐｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ｕｓｉｎｇＲＴ￣ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄｎａｍｅｄＪｃＨＤＺ２８.ＴｈｅＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｅｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ８８２ｂｐꎬａｎｄｅｎｃｏｄｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ２９３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪｃＨＤＺ２８ｃｏｎｔａｉｎｅｄａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｈｏｍｏｌｏｇｕｓｄｏｍａｉｎａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ(ＬＺ)ｍｏｔｉｆ.ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｓｅｅｄｓꎬａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄａｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ.Ｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓａｌｓｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｗｉｌｄｔｙｐｅ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＨＤ￣ＺｉｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅＪｃＨＤＺ２８ｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒ￣ｃａｓＬ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ꎻＪｃＨＤＺ２８ꎻＨＤ￣ＺｉｐꎻｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎻｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ９３㊀㊀非生物胁迫如干旱㊁高温㊁低温㊁氧化胁迫㊁高盐等都会降低作物产量ꎬ给农业生产造成重大的经济损失ꎮ为了适应这些极端环境条件ꎬ植物在生理㊁代谢㊁形态和分子水平上进化出复杂的调控机制ꎬ通过激活或者抑制胁迫相关基因的表达使得植物在这些极端条件下能够更好地生存[１]ꎮ研究结果表明ꎬ一些转录因子如ＭＹＢ㊁ＮＡＣ㊁ＨＤ￣Ｚｉｐ㊁ＡＰ２/ＥＲＦ㊁ＷＲＫＹ㊁ｂＺＩＰ等家族成员参与调控植物生长发育和逆境胁迫的调控[１￣６]ꎮＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白是植物特异性转录因子ꎬ具有１个由６１个氨基酸组成的高度保守的同源结构域(ＨＤ)ꎬ以及１个与ＨＤ的羧基端紧密相连的亮氨酸拉链(ＬＺ)元件ꎮＨＤ负责特异性ＤＮＡ序列结合ꎬ调控下游基因的转录ꎮＬＺ元件协助ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白特异性识别目标ＤＮＡ序列ꎬ起到二聚化的作用[１ꎬ７]ꎮ植物ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子最先在玉米中被发现ꎬ编码１个涉及叶片发育的ＨＤ￣ＺｉｐＩ类的转录因子[７]ꎮ之后ꎬＨＤ￣Ｚｉｐ基因在不同的植物中被发现ꎬ并通过构建这类基因的功能缺失突变体或功能获得突变体对其功能进行了研究ꎬ结果表明ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白在植物生长发育和逆境胁迫的调控中扮演重要的角色[６￣８]ꎮ例如ꎬＴａＨＤＺｉｐｌ￣２正调控小麦花期和穗的发育[９]ꎻｏｓｈｏｘ３３突变体通过改变ＧＳ１和ＧＳ２的表达呈现出叶片衰老的表型[１０]ꎻＡｔＨＢ１２是一种潜在的关键调节因子ꎬ参与植物叶片发育的调节[１１]ꎮ除此之外ꎬ许多研究结果表明ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白也参与调节植物对非生物胁迫的响应[１２￣１３]ꎮ提高ＴａＨＤＺｉｐＩ￣５基因的表达水平增强了转基因小麦对干旱胁迫和冷胁迫的抗性[１２]ꎻ提高ＯｓＨＯＸ２４基因的表达水平增强了转基因水稻抗旱㊁抗盐能力[１３]ꎻ玉米ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因Ｚｍｈｄｚ１０通过调控干旱胁迫相关基因的表达正调控转基因拟南芥对干旱胁迫的响应[１４]ꎮ尽管许多物种ＨＤ￣Ｚｉｐ基因家族成员已被克隆并进行功能分析ꎬ然而ꎬ麻风树中参与生长发育和胁迫调控的ＨＤ￣Ｚｉｐ基因仍然有待挖掘和进一步研究ꎮ麻风树又名小桐子ꎬ由于其具有生长快㊁适应性强㊁耐贫瘠㊁耐干旱㊁耐盐碱㊁种仁含油量高等特点成为生产生物柴油的明星物种ꎬ越来越引起科学家的重视[１５]ꎮ因此ꎬ本研究拟从麻风树中挖掘响应盐胁迫的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因并对其调控的分子机制进行研究ꎬ以期为麻风树耐盐品种的培育提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与胁迫处理试验材料为麻风树自交系品种ＧＺＱＸ０４０１和拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０ꎮ选取６叶期麻风树的根㊁茎㊁叶㊁花和授粉后３５ｄ的种子进行ＪｃＨＤＺ２８基因组织特异性表达分析ꎮ盐胁迫试验ꎬ对６叶期麻风树直接浇灌１５０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＮａＣｌ溶液ꎬ选取胁迫处理０ｈ㊁２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ的第４片叶ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因序列分析麻风树ＪｃＨＤＺ２８序列和该基因在别的物种中的同源基因均来自于ＮＣＢＩ(美国国立生物技术信息中心)ꎬＪｃＨＤＺ２８在拟南芥中的同源基因来自ＴＡＩＲ数据库ꎮ采用ＤＮＡＭＡＮ９.０软件进行蛋白质氨基酸序列分析ꎮ１.３㊀ＪｃＨＤＺ２８基因亚细胞定位以麻风树叶片ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术克隆获得不含终止密码子的ＪｃＨＤＺ２８编码序列ꎬ随后将其连接到ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体构建ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ融合表达载体ꎮ将构建好的ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体和ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体通过聚乙二醇(ＰＥＧ)介导转入拟南芥原生质体细胞ꎬ在共聚焦扫描显微镜(ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８)上获得定位样品的荧光图像ꎮ聚乙二醇介导的转化和原生质体制备参照文献[１６]的方法进行ꎮ１.４㊀基因克隆与转基因植株构建以麻风树叶片ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术克隆获得ＪｃＨＤＺ２８基因的全长编码序列ꎬ测序后ꎬ将测序正确的序列连接到ｐ１３０１载体ＫｐｎＩ和ＸｂａＩ的酶切位点之间ꎬ构建３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ｐ１３０１植物表达载体ꎮ然后通过ＧＶ３１０１介导的花序浸染法将３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ｐ１３０１载体转化到拟南芥中获得转基因植株[１４]ꎮ通过潮霉素㊁β￣葡萄糖苷酸酶(ＧＵＳ)染色和ＲＴ￣ＰＣＲ确定有效ＪｃＨＤＺ２８转基因植株用于后续试验研究ꎬ以期为麻风树耐盐品种的培育提供理论依据ꎮ１.５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因植株盐胁迫分析首先用潮霉素将野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株种子消毒ꎬ４ħ暗处理２ｄ后ꎬ将拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０(ＷＴꎬ野生型)和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株种０４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期子点播到１/２ＭＳ和含有１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ的１/２ＭＳ培养基中ꎬ置于２２ħ生长间中生长(１６ｈ光照/８ｈ黑暗)ꎬ２０ｄ后观察表型ꎮ１.６㊀生理指标分析选用盐胁迫处理１５ｄ的野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株叶片进行相对电导率和脯氨酸含量测定ꎮ相对电导率的测定方法参照文献[１４]ꎬ脯氨酸含量测定方法参照文献[１７]ꎮ１.７㊀ＲＮＡ提取和定量ＰＣＲ分析ＲＮＡ采用ＴＲＩｚｏｌ试剂进行提取ꎬ采用ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆转录酶试剂盒合成第一链ｃＤＮＡꎬ具体操作方法参照试剂盒使用说明书进行ꎮ采用ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ试剂盒和ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０定量ＰＣＲ仪进行ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎮ基因相对表达量采用２－әәＣｔ方法进行计算ꎮ本研究所用引物信息见表１ꎮ表１㊀本研究所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ基因㊀㊀㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀目的ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＧＣＧＧＴＣＣＣＲ:ＣＧＡＡＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＴＧ基因表达量检测Ｐ５ＣＳ１Ｆ:ＧＣＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＴＲ:ＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡ基因表达量检测ＳＮＡＣ１Ｆ:ＧＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＡＴＧＣＲ:ＣＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡ基因表达量检测ＡｔＣＡＴＡＦ:ＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＧＲ:ＴＧＧＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡ基因表达量检测ＬＥＡ３Ｆ:ＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＣＲ:ＣＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＴＣ基因表达量检测ＪｃＡｃｔｉｎＦ:ＴＡＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＲ:ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣ内参基因ＡｔＡｃｔｉｎ２Ｆ:ＧＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＧＲ:ＡＡＣＣＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＡ内参基因ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＲ:ＴＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧ编码区序列片段克隆ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＲ:ＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣ亚细胞定位片段克隆２㊀结果与分析２.１㊀ＪｃＨＤＺ２８基因的生物信息学分析设计特异性引物ꎬ以麻风树叶ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ克隆获得ＪｃＨＤＺ２８基因编码区序列ꎬ测序并通过ＮＣＢＩ比对ꎬ结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因编码区序列(ＣＤＳ)全长８８２ｂｐꎬ编码２９３个氨基酸ꎮ我们进一步通过ＤＮＡＭＡＮ软件对ＪｃＨＤＺ２８及其与在别的物种中的同源基因的相似性进行了分析ꎬ结果表明ꎬ麻风树ＪｃＨＤＺ２８蛋白与拟南芥㊁玉米和水稻中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族成员高度同源ꎬ且均含有高度保守的ＨＤ和ＬＺ基序(图１)ꎮ２.２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因的表达模式分析为了进一步研究ＪｃＨＤＺ２８在植物生长发育中的作用ꎬ我们使用ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析了ＪｃＨＤＺ２８基因在根㊁茎㊁叶㊁花和种子中的表达模式ꎬ结果表明ꎬ在所有被检测的器官中都检测到ＪｃＨＤＺ２８的表达ꎬ且ＪｃＨＤＺ２８基因在生殖器官(花和种子)中的相对表达量较高(图２ａ)ꎮ我们进一步检测了ＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫下的表达模式ꎬ结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ的相对表达量均显著低于盐胁迫０ｈ的相对表达量ꎬ且盐胁迫２４ｈ的相对表达量相比盐胁迫６ｈ㊁１２ｈ有所提高(图２ｂ)ꎮ该结果进一步表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因也许在植物响应盐胁迫中起重要的调控作用ꎮ２.３㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白的亚细胞定位为了检测ＪｃＨＤＺ２８蛋白的亚细胞定位ꎬ我们构建了３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ融合表达载体ꎮ随后将构建好的质粒连同３５Ｓ::ＧＦＰ质粒一起转化到拟南芥原生质体细胞ꎬ在共聚焦扫描显微镜上获得定位样品的荧光图像ꎮ结果(图３)表明ꎬ３５Ｓ::ＧＦＰ质粒在所有细胞中都可以检测到荧光信号ꎬ然而ꎬ１４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＦＰ质粒只在细胞核中检测到了明亮的绿色信号ꎮ这些结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８蛋白定位于细胞核中ꎮＯｓｈｏｘ１表示水稻中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎻＺｍｈｄｚ２５表示玉米中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎻＡｔＨＢ２表示拟南芥中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎮ图１㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白质氨基酸序列分析Ｆｉｇ.１㊀ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｐｒｏｔｅｉｎａ:ＪｃＨＤＺ２８基因组织特异性表达ꎻｂ:ＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫条件下的表达模式分析ꎮ∗∗表示在盐胁迫２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ与０ｈ相比差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因表达模式分析Ｆｉｇ.２㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ２.４㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥表型分析为了进一步研究ＪｃＨＤＺ２８基因的功能ꎬ我们构建了过表达转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥植株ꎮＲＴ￣ＰＣＲ结果表明ꎬ检测到ＪｃＨＤＺ２８基因在转基因株系中高表达ꎬ在野生型中没有检测到表达(图４ａ)ꎮ表型分析结果表明ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８不影响拟南芥地上部分生长发育(图４ｂ)ꎮ开花时间统计结果表明ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因植株开花时间与野生型相比没有显著差异ꎬ表明过表达ＪｃＨＤＺ２８不影响拟南芥开花时间(图４ｃ)ꎮ这些结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因不影响转基因拟南芥地上部分的生长和发育ꎮ２.５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥盐胁迫抗性分析ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明盐胁迫抑制ＪｃＨＤＺ２８基因的表达(图２ｂ)ꎬ因此我们推测ＪｃＨＤＺ２８也许参与植物对盐胁迫的响应ꎮ为了证明这个假设ꎬ我们进２４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期图３㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白亚细胞定位分析Ｆｉｇ.３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｐｒｏｔｅｉｎａ:ＪｃＨＤＺ２８基因在野生型拟南芥和转基因拟南芥中的表达情况ꎻｂ:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株表型分析ꎻｃ:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株开花时间统计ꎮＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ图４㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥表型分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ一步检测了野生型和转基因植株对盐胁迫的抗性ꎮ我们将消毒后的野生型和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株直接点播到１/２ＭＳ和含有１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ的１/２ＭＳ培养基中生长２０ｄꎮ结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转基因拟南芥植株大小明显小于野生型拟南芥植株大小ꎬ叶片白化更严重(图５ａ)ꎬ存活率极显著低于野生型拟南芥(图５ｂ)ꎮ生理指标测定结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转基因拟南芥植株叶片相对电导率极显著高于野生型拟南芥(图５ｃ)ꎬ脯氨酸含量极显著低于野生型拟南芥(图５ｄ)ꎮ这些结果表明ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８降低了转ＪｃＨＤＺ２８基因植株对盐胁迫的抗性ꎮ２.６㊀盐胁迫条件下非生物胁迫相关基因表达为了进一步阐明ＪｃＨＤＺ２８调控拟南芥响应盐胁迫的分子机理ꎬ我们通过ｑＲＴ￣ＰＣＲ技术检测了ＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡＴＡ㊁ＬＥＡ３㊁Ｐ５ＣＳ１等胁迫相关基因的表达ꎮ结果表明ꎬ在正常生长条件下ꎬＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡ￣ＴＡ㊁ＬＥＡ３㊁Ｐ５ＣＳ１在野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥植株中的相对表达量没有显著差异ꎬ然而ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ这些基因在转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南３４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析芥植株中的相对表达量显著低于在野生型拟南芥中的相对表达量(图６)ꎮ这些结果表明ꎬ盐胁迫条件下ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８增加转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性也许是通过改变这些非生物胁迫相关基因的表达引起的ꎮａ:野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在正常生长和盐胁迫(１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)条件下的生长分析ꎻｂ:成活率分析ꎻｃ:相对电导率分析ꎻｄ:脯氨酸含量分析ꎮＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ∗∗表示在盐胁迫条件下转基因植株与野生型植株相比差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥对盐胁迫的抗性分析Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ图６㊀盐胁迫条件下相关基因的表达水平Ｆｉｇ.６㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ４４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期３㊀讨论ＨＤ￣Ｚｉｐ基因是植物特异性转录因子基因ꎬ这些转录因子基因在植物生长发育(如胚胎发生㊁分生组织调控等)和非生物胁迫(如高盐㊁干旱等)过程中发挥重要的作用[１]ꎮ尽管许多ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因在拟南芥㊁水稻和别的物种中的功能已经被阐述ꎬ但是ＨＤ￣Ｚｉｐ基因在大戟科尤其是麻风树中的研究较少ꎮ在本研究中ꎬ我们克隆了麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因(１个ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因的成员)并分析了该基因的功能ꎬ在拟南芥中超表达ＪｃＨＤＺ２８增加了转基因植物对盐胁迫的敏感性ꎮ前人研究结果表明ꎬ超表达ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因能够改变转基因植物对非生物胁迫的抗性[１２￣１５]ꎮ在水稻中ꎬ过表达ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因增加了转基因水稻对非生物胁迫的敏感性[１５]ꎮ与此相似ꎬ在本研究中ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在盐胁迫条件下的植株大小和存活率均低于野生型拟南芥ꎮ前人研究结果表明ꎬ当植物遭遇非生物胁迫的时候ꎬ其体内的一些生理指标迅速变化使得植物能够更好地应对这些极端环境条件[１２￣１４]ꎮ因此ꎬ生理指标可以用来衡量植物对非生物胁迫的抗性ꎮ相对电导率是植物遭受逆境胁迫时其细胞膜损伤程度的重要评价因子[１５]ꎮ本研究结果表明ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在盐胁迫条件下的相对电导率极显著高于野生型拟南芥ꎬ该结果进一步表明ꎬ盐胁迫对转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥细胞膜的破坏程度显著高于野生型拟南芥ꎮ脯氨酸能够用来作为稳定剂降低高盐㊁干旱等极端环境胁迫对植物的危害[１６￣１７]ꎮ本研究结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥叶片脯氨酸的含量显著低于野生型拟南芥ꎬ该结果进一步表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ脯氨酸也许是一个导致转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥具有更高敏感性的因子ꎮ以上结果进一步表明ꎬ盐胁迫对转基因拟南芥的破坏程度显著高于野生型拟南芥ꎮ除了上述生理指标外ꎬ转基因植物对盐胁迫敏感性的增加也归因于非生物胁迫响应基因的下调表达[１８]ꎮ例如ꎬＨｓｆＡ３ｓ通过降低非生物胁迫响应基因的表达增加了转基因植物对盐胁迫的敏感性[１８]ꎮ与此类似ꎬ在我们的研究中ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ一些非生物胁迫应答基因(ＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡＴＡ㊁ＬＥＡ３和Ｐ５ＣＳ１)在转基因拟南芥中的相对表达量显著低于在野生型拟南芥中的相对表达量ꎮ综上ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８降低了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性可能是因为降低了非生物胁迫相关基因的表达ꎮ本研究结果将有助于我们进一步了解ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因ＪｃＨＤＺ２８在麻风树中的生理功能ꎮ参考文献:[１]㊀ＬＩＹＸꎬＹＡＮＧＺＲꎬＺＨＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｓｏｆＨＤ￣ＺＩＰｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｌａｎｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１３:１０２７０７１.[２]㊀沈㊀丹ꎬ杨㊀莉ꎬ胡㊀威ꎬ等.柑橘胁迫响应基因ＷＲＫＹ４７的克隆与表达分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(１):１２９￣１３８. [３]㊀董舒超ꎬ凌嘉怡ꎬ赵丽萍ꎬ等.转录因子调控番茄抗旱性研究进展[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２３ꎬ５１(９):９￣１６.[４]㊀ＪＩＡＯＭＹꎬＺＨＡＮＧＪꎬＣＨＥＮＧＷＷꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡＰ２/ＥＲＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｏｆＥｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].３Ｂｉｏｔｅｃｈꎬ２０２３ꎬ１３(７):２５９.[５]㊀ＷＡＮＧＨＬꎬＣＨＥＮＧＸꎬＹＩＮＤＭꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅ￣ｓｅａｒｃｈｏｎｐｌａｎｔＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏｅｘｔｅｒｎａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＩｓｓｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２３ꎬ４５(４):２８６１￣２８８０.[６]㊀ＪＯＯＨꎬＢＡＥＫＷꎬＬＩＭＣＷꎬｅｔａｌ.Ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｓｏｆｂＺＩＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ２２(１):４￣１５. [７]㊀ＡＲＩＥＬＦＤꎬＭＡＮＡＶＥＬＬＡＰＡꎬＤＥＺＡＲＣＡꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒｕｅｓｔｏｒｙｏｆｔｈｅＨＤ￣Ｚｉｐｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ１２(９):４１９￣４２６.[８]㊀ＬＩＺＱꎬＺＨＡＮＧＣꎬＧＵＯＹＨꎬｅｔａｌ.Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ￣ｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅＨＤ￣Ｚｉｐｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒｅｇｕ￣ｌａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏａｂｏｒｔｉｏｎｉｎｇｒａｐｅｓ(ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ.)[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１８:７４４.[９]㊀ＫＯＶＡＬＣＨＵＫＮꎬＣＨＥＷＷꎬＳＯＲＮＡＲＡＪＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｈｏｍｅ￣ｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴａＨＤＺｉｐＩ￣２ｆｒｏｍｗｈｅａｔｒｅｇｕｌａｔｅｓｆｒｏｓｔｔｏｌｅｒａｎｃｅꎬｆｌｏｗｅｒｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｓｐｉｋｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｒ￣ｌｅｙ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１６ꎬ２１１(２):６７１￣６８７.[１０]ＬＵＡＮＷＪꎬＳＨＥＮＡꎬＪＩＮＺＰꎬｅｔａｌ.ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＯｓＨｏｘ３３ꎬａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｃｌａｓｓⅢｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙꎬａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａ￣ＬｉｆｅＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓꎬ２０１３ꎬ５６(１２):１１１３￣１１２３.[１１]ＨＵＲＹＳꎬＵＭＪＨꎬＫＩＭＳꎬｅｔａｌ.Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｈｏｍｅｏｂｏｘ１２(ＡＴＨＢ１２)ꎬａｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｐｒｏｔｅｉｎꎬｒｅｇｕｌａｔｅｓｌｅａｆｇｒｏｗｔｈｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１５ꎬ２０５(１):３１６￣３２８.[１２]ＹＡＮＧＹＦꎬＬＵＡＮＧＳꎬＨＡＲＲＩＳＪꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌａｓｓＩｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴａＨＤＺｉｐＩ￣５ｉｎｃｒｅａｓｅｓｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｆｒｏｓｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１８ꎬ１６(６):１２２７￣１２４０.５４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析[１３]ＴＡＮＧＹＨꎬＷＡＮＧＪꎬＢＡＯＸＸꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＨＤ￣ＺＩＰｇｅｎｅｓｉｎｐｈｙｓｉｃｎｕｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＪｃＨＤＺ１６ｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９８.[１４]ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥＡꎬＫＨＵＲＡＮＡＪꎬＪＡＩＮＭ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｈｏｍｅｏｂｏｘｇｅｎｅｓꎬＯｓＨＯＸ２２ａｎｄＯｓＨＯＸ２４ꎬａｎｄｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＨＯＸ２４ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１６ꎬ７:６２７. [１５]ＺＨＡＯＹꎬＭＡＱꎬＪＩＮＸＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｍａｉｚｅｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ(ＨＤ￣Ｚｉｐ)ＩｇｅｎｅꎬＺｍｈｄｚ１０ꎬｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｂｏｔｈｒｉｃｅａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ５５(６):１１４２￣１１５６.[１６]ＡＢＤＵＬＬＡＲꎬＣＨＡＮＥＳꎬＲＡＶＩＮＤＲＡＰ.ＢｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓ:ａｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉ￣ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ３１(１):５３￣６４.[１７]ＬＩＵＫＱꎬＴＡＮＧＹＨꎬＴＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.ＥｃｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷＲＩＮＫＬＥＤ１ｉｎｒｉｃｅｉｍｐｒｏｖｅｓｌｉｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｕｔｒｅｔａｒｄｓｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０２２ꎬ１７(８):ｅ０２６７６８４. [１８]ＷＵＺꎬＬＩＡＮＧＪＨꎬＷＡＮＧＣＰꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｌｙＨｓ￣ｆＡ３ｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃｏｎｆｅｒｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｓａｌｔｓｅｎ￣ｓｉｔｉｖｉｔｙｖｉａａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｐｒｏｌｉｎｅｃａｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙꎬ２０１８ꎬ６９(８):２００５￣２０２１.(责任编辑:陈海霞)６４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期。

《白花丹参HDR基因的克隆和功能分析及无抗生素筛选标记转化体系的建立》一、引言白花丹参是一种重要的药用植物，具有广泛的药理作用和医疗价值。

随着分子生物学技术的发展，基因克隆和功能分析成为了研究白花丹参的重要手段。

本文旨在探讨白花丹参中过氧化氢酶（过氧化氢分解还原酶，HDR）基因的克隆与功能分析，以及无抗生素筛选标记转化体系的建立，以期为白花丹参的遗传改良提供理论基础和实践依据。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的白花丹参材料采自自然环境下的野生植株。

实验中使用的试剂、酶、载体等均为市售产品，符合实验要求。

2. 方法（1）HDR基因的克隆通过PCR技术，从白花丹参基因组DNA中扩增出HDR基因，使用引物设计软件设计特异性引物，然后利用琼脂糖凝胶电泳及测序验证基因序列。

（2）HDR基因的功能分析采用生物信息学方法，对HDR基因的编码序列进行预测，分析其结构域、功能域及保守序列等。

同时，通过构建过表达和沉默载体，在植物细胞中进行功能验证。

（3）无抗生素筛选标记转化体系的建立采用基因枪法或农杆菌介导法将目的基因导入白花丹参中，建立无抗生素筛选标记的转化体系。

通过观察转化后植株的生长状况、基因表达情况等，筛选出稳定遗传的转基因植株。

三、实验结果1. HDR基因的克隆与序列分析成功克隆出白花丹参HDR基因，经测序验证，其序列正确。

生物信息学分析表明，该基因编码的蛋白质具有典型的过氧化氢酶结构域，具备过氧化氢分解还原酶活性。

2. HDR基因的功能分析通过对HDR基因进行过表达和沉默处理，发现该基因在植物抗逆、抗病等方面具有重要作用。

过表达HDR基因的植株表现出较强的抗逆性，沉默该基因的植株则表现出对逆境的敏感性。

这表明HDR基因在白花丹参中具有重要功能。

3. 无抗生素筛选标记转化体系的建立通过基因枪法或农杆菌介导法将目的基因导入白花丹参中，成功建立了无抗生素筛选标记的转化体系。

在转化后的植株中，观察到部分植株表现出稳定的遗传性状和良好的生长状况。