实验三：两条序列比对与多序列比对
实验目的：
学会使用MegAlign，ClustalX和MUSCLE进行两条序列和多条序列比对分析
实验内容：
双序列比对是使两条序列产生最高相似性得分的序列排列方式和空格插入方式。两条序列比对是生物信息学最基础的研究手段。第一次实验我们用dotplot方法直观地认识了两条序列比对。但是dotplot仅仅是展示了两条序列中所有可能的配对，并不是真正意义上的序列比对。这里介绍进行两条序列比对的软件-MegAlign。
多序列比对是将多条序列同时比对，使尽可能多的相同（或相似）字符出现在同一列中。多序列比对的目标是发现多条序列的共性。如果说序列两两比对主要用于建立两条序列的同源关系，从而推测它们的结构和功能，那么，同时比对多条序列对于研究分子结构、功能及进化关系更为有用。多序列比对对于系统发育分析、蛋白质家族成员鉴定、蛋白质结构预测、保守模块的搜寻等具有非常重要的作用。我们这节课主要学习多条序列比对的软件-ClustalX, MUSCLE。
一、MegAlign
DNASTAR公司的Lasergene软件包是一个比较全面的生物信息学软件，它包含了7个模块。其中MegAlign可进行两条或多条序列比对分析。
1. 两条序列比对
1.1 安装程序
解压DNASTAR Lasergene软件压缩包，双击Lasergene710WinInstall.exe文件，按照默认路径安装软件到自己电脑上。
1.2 载入序列
a.点击开始－程序－Lasergene－MegAlign，打开软件。
我们首先用演示序列（demo sequence）学习软件的使用。演示序列所在位置：C:\Program files\ DNASTAR\ Lasergene\ Demo Megalign\ Histone Sequences\。
b. 点击主菜单File—Enter sequence－选择序列所在文件夹，选择序列tethis21.seq和tethis22.seq，点击Add，这两条序列将出现在右侧selected sequences框中（Figure 3.1），选择完毕点击Done回到程序页面。
Figure 3.1 载入序列
此时程序窗口分为三部分，最左侧较窄的是sequence name，中间显示的是序列起始位置，最右侧显示序列末尾部分，可以通过拖动窗口底部滚动条，查看序列其它部分（Figure 3.2）。若想改变字体显示方式，点击主菜单OPTIONS，选择Font改变字体，选择Size改变字号大小。若要移除序列，选中sequence name的序列名，右击，选clear。
Figure 3.2 载入序列后（注意标注的绿色箭头，即为坐标位置）
1.3 设定序列比对位置
MegAlign允许使用者选择序列的一部分进行比对分析，例如，可以根据GenBank格式的序列中Features部分关于编码区（CDS）位置的描述，设定只对此编码区进行分析。
a. 点击最左侧Sequence Name框中的第一条序列tethis，然后选择主菜单OPTIONS
－Set sequence limits－from feature table。（Figure 3.3）此时根据feature内容，出现四个可以选择的片段，第一个为全长，从序列起始到末尾（1-906），其它三个则只包括序列的一部分，选择最后一个Histone H2B-1—CDS，点击Change the Reset，点击OK，同样对第二条序列进行上述操作，回到主界面工作区，此时窗口中的序列起始和终止位置已经发生了变化。（Figure 3.4）
Figure 3.3 利用Feature Table选择序列特定部分
Figure 3.4 选择序列特定部分
b. 我们还可以通过设定序列坐标进行部分序列比对，首先选定序列，选择主菜单
OPTIONS－Set sequence limits－by coordinates，输入起始和终止位置坐标来选择部分序列进行分析。
注意：只有genbank格式的序列才可以Set sequence limits from feature table，fasta格式的序列因为没有feature那一项内容，只可以Set sequence limits by coordinates。
1.4 进行两条序列比对
如果输入两条序列后不设置序列起始和终止位置，默认是全长序列进行比对。
按住Shift选择序列tethis21和tethis22，然后点击主菜单Align-One pair，由于目前输入的是核酸序列，此时有两个选项，Wilbur-Lipman Method和Martiner NW Method。如果输入的是蛋白质序列，这两个选项将是灰色，只能用Lipman-Pearson Method进行比对。Wilbur-Lipman Method是一种以word为单位的（word-based）启发式局部比对方法；Martiner NW Method是一种改进了的全局动态规划算法。Lipman-Pearson Method是序列相似度搜索软件Fasta的比对算法，也是一种以word为单位的快速启发式算法。选择其中一个，出现比对参数设定窗口（Figure 3.5），选择默认参数不做更改，直接点击OK即可。
Figure 3.5 Wilbur-Lipman比对方法参数设定
这时出现一个新窗口，即为比对结果。可以选择OPTION-size，放大字号观察比对结果。可以看到在窗口上部显示的是比对方法名称，所用参数，两条序列各自的起止位置，相似度值，比对结果中空位数目，长度和一致序列的长度。随后就是比对结果部分，其中第一行是第一条序列，它上面的v70是标尺，其中的“V”的位置对应的是第一条序列的第70个核苷酸所在位置；第三行是第二条序列，它下方的数字同样对应该序列位置坐标；中间那行是根据两条序列比对结果中匹配部分推断出来的一致序列（consensus sequence），错配或空位显示为空白（Figure 3.6）。
Figure 3.6 Wilbur-Lipman方法比对结果
