蛋白提取（所有操作在冰上进行）
1.裂解
1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）
取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀
2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液
体与组织比例为20：1），冰上静置10min
2.匀浆
先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min
3.离心（在基础4楼416室）
1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量
超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min
3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中
4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）
将样品转移至2~3个0.5mlAP管中
加上样缓冲液，100℃变性10min
仪器屏幕：
5.保存
变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用
WB实验步骤
1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对
齐，以免漏胶。
2.配制分离胶
1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）
2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）
3.灌胶
沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止
4.水封
立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min
5.浓缩胶的配制（5%）
6.电泳（电泳液最多使用两次）
1)安装电泳装置
低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）
2)点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）
3)
连接电泳仪
电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳 先调电压至70mV ，跑约20min 。（Mark 跑开，分出彩带即可） 再调电压至120mV ，跑约60min 。（不能跑过下面的玻璃板）
注：Mark 的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡 7. 转膜（转移液可用3-4次）
1)
剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）
2) 剪PVDF 膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF 膜），然后用甲醇活化10s 以上
3)
“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）
4) 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动） 5)
打开开关，调节电流至100mA ，转膜2h （恒流）盆中加满冰 转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色 8.
封闭 1)
配制5%脱脂奶粉： 2.5g 脱脂奶粉
50mlTBST 2)
将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min （转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）
9. 一抗 1)
用TBST 配，每一格加5ml TBST ，再分别加入抗体 抗体的量： 2) 膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上） 3)
4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）
10. 洗脱
用TBST 在皿中洗脱，摇床10min 每次，洗三次。 11. 二抗
1)
用3%的脱脂奶粉 1.5g 的脱脂奶粉 50mlTBST 2)
每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1μl
注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗 3)
膜分别加入小格，慢摇1-2h （常温）
12. 洗脱
用TBST 在皿中洗脱，摇床10min 每次，洗三次。 13. 显影：
U 盘
A 液，
B 液（显影液。4℃保存）
200μl 枪+枪头（黄） 膜（置于皿中）
1)
开机后自动预冷，温度降到
1-20℃才可 2) 显影液现配现用（A 液：B 液=1：1）
3) 膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上
4)
先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s （影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。
5)
每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U 盘
试剂配方：
