细菌DNA提取的方法

CTAB法提取细菌总DNA
先用试剂盒提取DNA，未成功则采用此方法。

（1）将供试细菌纯培养后接入LB液体培养基，28℃震荡培养24h，取振荡培养LB液体细菌培养物，10000r/min离心10min，收集菌体装入1.5ml的离心管中。

（2）每30mg菌体加1mL菌体裂解液悬浮沉淀，加溶菌酶（50mg/mL）5μL，混匀，37℃保温20min。

（3）加RNase(10mg/mL)5μL，37℃保温30min。

（一般PCR这步可省略）
（4）加蛋白酶K（20mg/mL）20μL，混匀，65℃保温1h。

（5）用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，12000r/min 离心10min，取上清于另一离心管，重复抽提一次。

（6）用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12000r/min 离心10min，取上清于另一离心管。

（7）加0.1V醋酸纳溶液（pH 5.2）和2V无水乙醇，混匀，-20℃沉淀1-2h。

（8）4℃ 12000r/min 离心10min，收集沉淀，70% 乙醇洗涤沉淀2次，干燥后溶解于适量的TE中，-20℃保存备用。

细菌dna提取方法及原理嘿，咱今天就来讲讲细菌 DNA 提取这档子事儿哈！你知道不，细菌那小小的身体里可藏着大大的秘密呢，而要把这些秘密给揪出来，就得靠提取它们的 DNA 啦！提取细菌 DNA 呢，就好像是一场和小细菌的“战斗”。

首先，咱得把细菌给“逮住”，让它们乖乖地待在那儿。

这就好比要抓住一群调皮的小孩子，得有合适的办法才行。

然后呢，就是要打破它们的“保护壳”，也就是细胞壁啦。

这细胞壁就像是小细菌的“盔甲”，得想办法给它弄开。

那怎么弄开呢？这就有不同的办法咯！就像你开门有钥匙，撬门有工具一样。

可以用一些化学试剂呀，就像给细菌来个“温柔的攻击”，让细胞壁慢慢变软、破裂。

或者用物理的方法，比如给它们来点小小的“震动”，让细胞壁扛不住就破啦。

等细胞壁破了，DNA 就露出来啦。

这时候，就像找到了宝藏一样兴奋呢！但是别急，这还只是开始。

接下来，要把 DNA 从其他乱七八糟的东西里分离出来。

这就好像在一堆沙子里找金子，得仔细点、耐心点。

提取细菌 DNA 的原理呢，其实也不难理解。

就好比你要从一堆杂物里找出你最喜欢的那个玩具，得知道那个玩具的特点呀。

DNA 也有它自己的特点，咱就是根据这些特点来把它给找出来的。

想象一下，细菌就像一个小小的“宝藏盒子”，而 DNA 就是盒子里最珍贵的宝贝。

咱要做的就是打开盒子，把宝贝拿出来，还不能弄坏了其他东西。

这可不是一件容易的事儿呀，但科学家们就是有办法做到！在这个过程中，每一步都得小心谨慎。

就像走钢丝一样，稍有不慎可能就前功尽弃啦。

而且不同的细菌可能还需要不同的方法，就像不同的锁得用不同的钥匙开一样。

提取出来的 DNA 用处可大啦！可以用来研究细菌的特性呀，看看它们为什么会这样、那样。

还可以用来诊断疾病呢，就像医生通过检查找到病因一样。

总之呢，细菌 DNA 提取这事儿啊，看似简单，实则暗藏玄机。

得有耐心、有技巧，还得有点小智慧。

就像一场有趣的冒险，等你真正掌握了，就会发现其中的乐趣和神奇啦！怎么样，是不是对细菌 DNA 提取有了更深的了解呀？哈哈！。

提取dna的方法及原理提取DNA的方法及原理DNA是生物体中的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。

提取DNA是研究基因组学、遗传学等领域的重要基础工作。

本文将介绍几种常用的DNA提取方法及其原理。

1. CTAB法CTAB法是一种经典的DNA提取方法。

其原理是利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）与DNA结合形成离子对，然后通过盐溶液的浓度差异，使DNA从溶液中沉淀出来。

该方法适用于提取植物细胞中的DNA。

2. 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种常用的DNA提取方法。

其原理是利用DNA在酚相中溶解，而其他细胞组分则在氯仿相中溶解，通过酚/氯仿两相的分离，从而将DNA分离出来。

该方法适用于提取动物细胞和细菌等样品中的DNA。

3. 硅胶柱法硅胶柱法是一种高效、纯化度较高的DNA提取方法。

其原理是利用硅胶柱上的硅胶颗粒与DNA之间的亲和性，将DNA吸附在硅胶颗粒上，然后通过洗涤、离心等步骤，将DNA从硅胶颗粒上洗脱下来。

该方法适用于提取各种样品中的DNA。

4. 磁珠法磁珠法是一种基于磁性颗粒的DNA提取方法。

其原理是将带有亲和基团的磁性颗粒与DNA结合，然后通过磁力的作用，将颗粒和DNA一起沉淀下来，最后通过洗涤等步骤，将DNA从颗粒上洗脱下来。

该方法具有快速、高效的特点，适用于高通量的DNA提取。

以上是几种常用的DNA提取方法及其原理。

不同的方法适用于不同类型的样品和实验需求。

在实际操作中，可以根据具体情况选择合适的方法进行DNA提取。

同时，为了保证提取到的DNA质量和纯度，还需要注意提取过程中的一些关键步骤，如细胞破碎、蛋白质酶处理、DNA沉淀等。

DNA的提取是基因研究和遗传学研究的重要步骤，通过合适的提取方法可以获取到高质量的DNA样品，为后续的实验和分析提供可靠的基础。

随着技术的不断进步，提取方法也在不断改进和优化，为科学研究提供更多的可能性。

CTAB法提取细菌Total DNA原理CTAB法原理CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。

易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点:有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。

缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。

2.氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；降低表面张力，从而减少气泡产生；另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

DNA提取原理和方法样本处理是DNA提取的第一步，主要目的是将样本处理成适合提取DNA的形式。

不同的样本需要不同的处理方法。

例如，从动物组织中提取DNA时，可能需要粉碎组织样本，使得细胞更容易破碎，从而释放DNA。

而从细菌培养液中提取DNA时，则需要先离心去除其他细胞组分，然后使用溶解酶破坏细胞壁。

细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一、细胞破碎的目的是释放DNA分子，使其能够在后续步骤中被分离和纯化。

常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解破碎。

机械破碎是使用物理力量（例如，搅拌、磨碎、超声波等）来破坏细胞壁，从而释放细胞内的DNA。

化学破碎是使用化学物质（例如，洗涤剂、酸、碱等）来破坏细胞壁和细胞膜，从而释放DNA。

酶解破碎是使用特定酶（例如，蛋白酶、胰酶等）来降解蛋白质和核酸，从而破碎细胞。

核酸纯化是DNA提取的核心步骤，其目的是将DNA与其他细胞组分（如蛋白质、RNA、杂质等）分离。

核酸纯化的方法有很多种，常见的包括酚-氯仿提取法、离心柱纯化法和磁珠纯化法。

酚-氯仿提取法是最常用的DNA纯化方法之一、该方法先使用酚提取样品中的核酸，然后使用氯仿去除蛋白质。

离心柱纯化法是使用离心管柱进行分离和纯化，其中DNA结合到离心柱上的固相载体上，而其他细胞组分则被洗脱。

磁珠纯化法是使用表面被修饰的磁珠与DNA结合，并使用磁场来分离和纯化DNA。

DNA提取完成后，需要对提取得到的DNA进行测量。

DNA的浓度和纯度测量是判断DNA质量的重要指标。

常用的测量方法包括比色法、荧光分光光度法和凝胶电泳法。

比色法是使用特定的染料与DNA结合，并通过比色读数来测量DNA的浓度。

荧光分光光度法是使用荧光分光光度计来测量DNA与DNA结合染料的荧光强度，进而计算DNA浓度。

凝胶电泳法是将DNA经过电泳分离，然后使用负载荧光染料或核酸染料在凝胶中可视化DNA，从而判断其浓度和纯度。

总之，DNA提取是从生物样本中分离和纯化DNA的重要步骤。

4、加入150μL5mol/L的KAC，颠倒，冰置20min，10000*10。
5、取上清于另一EP，加等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，12000*5。
6、取上清于另一EP，加等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，12000*5。
7、加入等体积异丙醇（沉淀DNA），温和混匀，-20℃，1h。
8、12000*3，弃上清，得沉淀，加入1ml70%乙醇，12000*2，自然干试剂
作用
KAC和乙醇
沉淀DNA，中和碱
Tris-HCl+EDTA（TE）
抑制DNA酶活性
SDS
破膜，结合蛋白质
酚：氯仿：异戊醇
去蛋白质
醋酸安
沉淀蛋白质，中和NaOH
异戊醇
减少泡沫，易于分相
1、取5ml菌液，离心去上清，加入50μL ddH2O悬浮，沸水浴煮20min，速度液氮冷冻，反复2次。
2、65℃预热细胞提取液（100mmol/L的Tris-HCl，ph8.0；5mmol/L的EDTA，500mmol/L的NaCl；1.25%SDS；1%β-硫基乙醇）。
3、加入500μL细胞提取液，颠倒，65℃，时间为0.5h，每10min颠倒一次。

细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与 蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可 以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质 变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
三、操作步骤
1、细菌 37℃ 过夜培养，取1ml培养物 12000rpm 室温离心 1min。
2、沉淀物加入180ul TE缓冲液，充分重悬细菌；再加入20ul 50mg/ml溶菌酶，混匀后于 30℃温育10min。 3、12000rpm 离心 5min, 弃上清后加入200 ul Buffer BTL，漩涡震荡悬浮细胞。 4、加入25ul 蛋白酶K溶液，振荡器混匀，于55℃温育30min，每隔10min 漩涡震荡一次。 5、加入220ul Buffer BDL，颠倒混匀，于65℃温育10min。 6、加入220ul 无水乙醇，以最大速度漩涡震荡20s。 7、转移样品至DNA 纯化柱中，纯化柱下端安装2ml收集管,12000rpm离心1min使DNA结 合在纯化柱上，弃去收集管。 8、将DNA纯化柱安装到新的2ml收集管中，加入500ul Buffer HB，12000rpm离心1min， 弃去滤液。

改进SDS-CTAB方法提取细菌基因组具体步骤1.将待检测菌株接种于3 mL LB或BHI培养基中37℃培养过夜2.取1.5 mL上述菌液于2 mL离心管10,000~15,000 rpm，离心10~15 min，去上清，若所得菌体过少可重复此步骤一次3.加入564 μL TE缓冲液pH 8.0重悬菌体，此时不得涡旋，上下颠倒离心管几次使其混合均匀，然后37℃放置10~60 min。

4.加入30 μL 10%~20% SDS混合均匀、不得涡旋，置于37℃条件反应1~2h，使悬液相对清澈有粘性为止。

5.加入100μL 5M NaCl混合均匀、不得涡旋，65℃反应2 min。

然后加入80μL CTAB/NaCl，混合均匀、不得涡旋，65℃反应10 min。

（注：在加入CTAB/NaCl之前,必须用5M NaCl充分混匀裂解产物且CTAB/NaCl溶液加之前得先预热至65℃，并且吸取时移液器枪头应去除尖端）6.加入等体积约800 μL氯仿/异戊醇24:1充分混匀，10,000 rpm离心5 min。

离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液A，至新的2 mL 离心管中。

7.加入等体积约800 μL酚/氯仿/异戊醇25:24:于上清液A中充分混匀，15,000 rpm离心5 min。

离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液B，至新的2 mL离心管中。

8.加入等体积约800 μL氯仿/异戊醇24:1于上清液B中，充分混匀10,000 rpm离心5 min。

离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液C，至新的2 mL离心管中。

9.加入0.7倍体积约560 μL异丙醇至上清液C以沉淀DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为DNA。

常温静置5~60 min后，12,000~15,000 rpm常温离心15~30 min。

可见DNA团集于离心管壁边上。

然后小心去除异丙醇，避免碰到DNA团。

10.加入500μL70%乙醇后上下颠倒离心管几次以洗涤DNA团，再常温12,000~15,000 rpm离心15~30 min。

dna粗提取方法DNA粗提取方法DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物体的基因遗传物质，对于研究基因组学、进化学以及疾病诊断等方面具有重要意义。

DNA粗提取是从生物样本中提取出DNA的一种常用方法，本文将介绍DNA粗提取的步骤和相关注意事项。

一、实验前的准备工作在进行DNA粗提取前，需要准备以下实验材料：1. 细胞样本：可以是人体组织、细菌、植物组织等；2. 细胞裂解液：包括裂解液缓冲液和蛋白酶K等；3. 蛋白沉淀剂：如氯化钠、聚乙二醇等；4. 离心管、离心机、超声波仪等实验设备。

二、DNA粗提取步骤1. 细胞裂解：将细胞样本加入细胞裂解液中，通过机械或化学方法使细胞壁破裂，释放出细胞内的DNA。

2. 蛋白沉淀：加入蛋白沉淀剂，与DNA结合的蛋白质会沉淀到底部，形成蛋白质沉淀物。

3. DNA沉淀：将上述混合液离心，离心后，DNA会沉淀到离心管的底部形成DNA沉淀物。

4. 洗涤：将DNA沉淀物用乙醇洗涤，去除杂质。

5. 干燥：将洗涤后的DNA沉淀物在通风处晾干，使其变为干燥的DNA固体。

三、注意事项1. 实验操作过程中应注意无菌操作，避免外源性DNA的污染。

2. 细胞裂解液的选择应根据具体实验目的进行优化，以获得高质量的DNA。

3. 实验过程中应控制温度，避免DNA的降解。

4. 保存提取得到的DNA时，应避免阳光直射，存放在低温干燥的环境中，以防止其降解。

5. 实验操作中应注意个人安全，避免接触有毒物质和腐蚀性液体。

DNA粗提取方法是提取DNA的常用方法之一，它能够快速、高效地从生物样本中提取出DNA，为后续的分子生物学研究提供了重要的基础。

然而，需要注意的是，DNA粗提取方法提取得到的DNA质量较低，适用于一些对DNA纯度要求不高的实验，如PCR反应等。

对于一些对DNA质量要求较高的实验，如测序、限制性酶切等，需要使用更为精细的DNA提取方法。

DNA粗提取是一种常用的DNA提取方法，通过简单的步骤可以从生物样本中提取出DNA。

dna提取方法
DNA提取是分离和纯化细胞内的DNA分子的过程。

以下是常用的DNA提取方法：
1. 经典的酚-氯仿提取法：将细胞裂解并溶于酚-氯仿溶液中，通过离心分离DNA上清液和蛋白质/ RNA/酚相，然后分别用异丙醇沉淀和洗涤 DNA，最后用缓冲液溶解 DNA。

2. 盐溶解法：将细胞裂解并使用盐水缓冲溶解 DNA，然后离心去除蛋白质和碎细胞碎片。

最后，通过异丙醇沉淀 DNA，洗涤和溶解 DNA。

3. 磁珠法：利用表面修饰的磁珠、离心和磁场来分离和纯化DNA。

磁珠上会吸附 DNA，然后用缓冲液洗涤和溶解 DNA。

4. 硅胶柱法：利用硅胶膜在碱性条件下与 DNA 结合，然后用缓冲液洗涤和溶解 DNA。

5. 腐蚀酶法：通过腐蚀细胞壁和细胞膜来释放细胞内 DNA，然后离心去除细胞渣。

最后，通过异丙醇沉淀 DNA，洗涤并溶解 DNA。

这些方法都可以从不同来源（如细菌、动植物组织和血液）中提取 DNA，以便分析、克隆或测序。

提取的 DNA 可用于分子生物学研究、犯罪鉴定、基因组学研究等各种应用。

细菌基因组DNA提取实验标签：细菌基因组DNA 提取细菌基因组DNA提取可以：（1）获得细菌基因组DNA；（2）作为PCR模板；（3）用于测序、遗传信息分析等。

实验方法细菌基因组DNA试剂盒提取法实验方法原理本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术，结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DNA 的目的。

适合于从1.0×109细菌中获得多至20 μg 的基因组DNA。

用于PCR、Southern 印迹分析、RAPD、RFLD 等分子生物学实验。

实验材料细菌培养物试剂、试剂盒细菌基因组DNA试剂盒仪器、耗材DNA 制备管小量滤器离心管实验步骤一、试剂盒组成、贮存、稳定性1. 说明书，耗材：DNA 制备管，小量滤器，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。

2. RNase A：50 mg/ml，室温保存。

3. 溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml，-20℃密闭贮存。

4. Buffer S：细菌原生质制备液，加入RNase A 后，4℃密闭贮存。

5. 0.25M EDTA：室温密闭贮存。

6. Buffer G-A：裂解液，室温密闭贮存。

7. Buffer G-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。

8. Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。

9. Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。

10. Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。

11. Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。

12. Buffer W2 concentrate：去盐液。

使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。

可用100%乙醇或95%乙醇。

13. Eluent ：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、实验准备1. 第一次使用时，在Buffer W2 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。

dna的粗提取方法DNA的粗提取方法DNA是生物体内最基本的遗传物质，对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。

因此，DNA的提取方法也成为了科学研究中的一项重要技术。

下面将介绍一种简单易行的DNA粗提取方法。

材料准备1. 10% SDS溶液：称取10克SDS加入100毫升去离子水中，混合均匀后加热至70℃左右，搅拌至SDS完全溶解即可。

2. 0.5M EDTA溶液：称取186.1克EDTA加入500毫升去离子水中，调节pH至8.0。

3. 1M Tris-HCl缓冲液：称取121.14克Tris-HCl加入1000毫升去离子水中，调节pH至8.0。

4. NaCl溶液：称取58.44克NaCl加入1000毫升去离子水中，搅拌均匀后过滤灭菌。

5. 蛋白酶K：用去离子水将蛋白酶K稀释至10mg/ml浓度。

6. 高锰酸钾：用去离子水将高锰酸钾稀释至0.1%浓度。

7. 95%乙醇：用去离子水将95%乙醇稀释至70%浓度。

8. 细胞样品：可以是动物组织、细菌、真菌等样品。

步骤步骤一：制备细胞裂解液1. 取适量的细胞样品，用PBS缓冲液洗涤3次，去除细胞外的杂质。

2. 向含有10% SDS的裂解液中加入适量的蛋白酶K，搅拌均匀后在60℃水浴中孵育2小时。

3. 将孵育后的裂解液加入相同体积的高锰酸钾溶液中，搅拌均匀后再加入相同体积的4M NaCl溶液中，轻轻摇晃混合即可。

步骤二：沉淀DNA1. 将上述混合溶液离心10分钟，收集上清液至新离心管中。

2. 向上清液中滴加等体积的冷乙醇（70%），轻轻摇晃后放置于-20℃冷冻库中保存至少30分钟以上。

3. 将离心管取出，离心10分钟，倒掉上清液，将沉淀用无菌去离子水洗涤3次。

步骤三：纯化DNA1. 将沉淀加入含有0.5M EDTA的去离子水中，搅拌均匀后放置于60℃水浴中孵育30分钟。

2. 在孵育过程中，制备1M Tris-HCl缓冲液，并调节pH至8.0。

3. 孵育结束后，向上述溶液中加入相同体积的1M Tris-HCl缓冲液，轻轻摇晃混合均匀。

大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌，其基因组DNA的提取非常重要，可以用于进一步的分子生物学研究。

本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。

一、大肠杆菌基因组DNA的提取基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法：1. 培养大肠杆菌：从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL，加入含有适量抗生素（如氨苄青霉素或巴龙霉素）的LB培养基中。

以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时，直到菌体适量生长。

2.收集菌体：离心培养物，将上清液去除，保留细胞沉淀。

3.溶菌：使用适当的溶解液（如0.2MNaOH/1%SDS溶液），彻底悬浮菌体，并在65℃下孵育5分钟。

4.中和反应：向菌液中加入3M的钾酸溶液，通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。

6.洗涤：用70%乙醇洗涤DNA沉淀。

去除乙醇，使菌体中的盐等杂质完全去除。

7. 溶解：用 TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）或纯水溶解DNA沉淀。

如果需要更高浓度的DNA，可使用低TE溶液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。

荧光定量PCR（qPCR）是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定量分析PCR产物的技术。

下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR试验设计：试验目的：测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。

试验步骤：1.制备PCR反应体系：根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。

将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配：- 模板DNA：5 ng-引物（正向和反向）：0.2μM-qPCR反应缓冲液：根据厂家推荐的浓度加入适量-dNTP混合液：0.2mM-热启动酶：根据厂家推荐的浓度加入适量- ddH2O：适量2.设计合适的PCR程序：-预热：95℃，5分钟-循环：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒（重复30-40个循环）-最终延伸步骤：72℃，10分钟-保存在4℃下待用3.实施定量PCR试验：-根据样本中DNA浓度的不同，选择适当的试管和引物。

细菌总DNA提取方法100412 溶液制备：母液：1）1.0M Tris-HCl, 称取60.57g Tris（Tris Amino），溶于500ml ddH2O中，用HCl调整pH8.0；2）0.5M EDTA，称取37.32g EDTA-Na，溶于100ml ddH2O中，用NaOH调整pH8.0。

STE buffer（pH8.0）：100mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；高压灭菌，4℃保存。

TE buffer(pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

取5ml 1mol/L Tris-HCl母液，1ml 0.5mol/L EDTA母液，置于400ml的ddH2O中，然后定容到500ml，高压灭菌后，4℃保存备用；实验步骤：1、取1ml 液体培养的菌体（Gram-negative or Gram-positive bacteria），离心8000 rmp 2min；（肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp 10min，以沉淀细胞）2、弃上清，用400ul STE buffer 清洗两次，每次离心8000 rmp 2min（肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp 10min，以沉淀细胞）3、弃上清，加入200ul TE buffer悬浮沉淀；4、加入100ul Tris饱和酚（Tris-saturated phenol，pH8.0）; 振荡器振荡60-120S，以裂解细胞；注：M. MB200振荡120S, E.coli振荡60S.5、4℃，离心13000rmp 5min，以将水相（aqueous phase）从有机相（orangic phase）中分离出来；6、取160ul上层水相，转移至另一个1.5ml Ep管中；7、加入40ul TE buffer，以达到200ul体积，再与100ul 氯仿（chloroform）混合，可用1ml 移液抢吹打；8、4℃，离心13000rmp 5min；9、用氯仿抽提裂解液，直到白色的界面（white interface）消失，重复2-3次；10、将160ul上层水相移入一干净的1.5ml的Ep管中；11、加入40ulTE buffer，5ul RNase（10mg/ml），37℃保温10min；12、加入100ul氯仿，混匀，4℃，离心13000rmp 5min；13、将150ul上清水相移入另一个1.5mlEp管中，-20℃保存。

基因组dna的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习基因组DNA的提取方法，掌握DNA提取实验的基本步骤和技巧。

二、实验原理DNA提取是生物学中最基础的实验之一，其目的是从细胞或组织中分离出DNA。

DNA提取的原理是利用化学试剂破坏细胞膜和核膜，使细胞内部的DNA裸露出来，并通过特定方法纯化出来。

三、实验材料1. 细菌培养液2. TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）3. 蛋白酶K溶液（20 mg/mL）4. 洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0）5. 氢氧化钠（NaOH）溶液（0.2 M）6. 氯化钾（KCl）溶液（1 M）7. 高盐缓冲液（5 M NaCl, 1 M Tris-HCl, pH 8.0）8. 等体积异丙醇9. 离心管10. 微量离心管四、实验步骤1. 取细菌培养液0.5 mL，离心10分钟，将上清液倒掉。

2. 加入0.5 mL TE缓冲液和20 μL蛋白酶K溶液，室温下孵育10分钟。

3. 加入0.6 mL洗涤缓冲液，混匀后离心1分钟。

4. 倒掉上清液，加入0.2 mL氢氧化钠溶液，轻轻颠倒混匀，室温下孵育5分钟。

5. 加入0.3 mL氯化钾溶液，轻轻颠倒混匀后离心1分钟。

6. 将上清液转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀后放置于-20℃冷冻箱中保存至少30分钟。

7. 离心10分钟后将上清液倒掉，并用70%乙醇洗涤沉淀一次。

8. 将沉淀用TE缓冲液重悬即可。

五、实验注意事项1. 实验过程中要注意无菌操作。

2. 操作过程中要避免DNA的降解和污染。

3. 实验前应做好必要的准备工作，并按照步骤进行操作。

六、实验结果通过本实验，成功提取出了细菌的基因组DNA，并经过浓度检测和质量检测，证明提取的DNA质量较好，可以用于后续实验。

七、实验总结本次实验通过对基因组DNA的提取方法进行学习和实践，掌握了基本的操作技巧和注意事项。

细菌总DNA提取：
(1) 12,000 r/min离心1 min收集足够对数生长期菌体；
(2) 如果是革兰氏阳性菌，加50 μL 100 μg/mL的溶菌酶打散菌体于37°C保温2-3 h；如果是革兰氏阴性菌，此步骤省略；
(3) 加500 μL裂解液（配方：40mM Tris-HCl ;1mMEDTA ;20mM
NaAc ;1% SDS ，pH 8.0 ），用移液器迅速吹吸以悬浮和裂解细胞；
(4) 加200 μL 5 mol/L NaCl颠倒混匀，12,000 r/min离心10 min；
(5) 吸取上清液补加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1）抽提两次，12,000 r/min离心10 min；
(6) 小心吸取上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇颠倒混匀，置-20°C冰箱5 min。

(7) 12,000 r/min离心15 min，弃上清液；
(8) 用70 %乙醇洗涤沉淀；
(9) 离心将残留液体甩到管底，用移液器吸干净，再自然晾干，不宜过于干燥；
(10) 用25μL ddH2O或TE Buffer溶解沉淀。

留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留
量。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。
4.3 核酸的鉴定
{完整性鉴定} 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢， 如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提 示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条 带，可能是DNA污染。
4.1 破裂细胞壁
（2）非机械法 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents） 实验室常用的方法是采用酶溶破解法来 破裂细菌细胞壁
取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀, 加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1 小时 加入740μl5mol/LNaCl,再加入 512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟
பைடு நூலகம்
5.2 CTAB/NaCl法
加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min 离心5分钟,保留上清。
核酸的鉴定和保存
4.1 破裂细胞
主要是破裂细胞壁。 细菌的细胞壁厚度因细菌种类不同而有所差别。 革兰氏阳性菌细胞壁较厚，有15-50层肽聚糖、磷 壁酸和少量蛋白质；革兰氏阴性菌细胞壁相对较 薄，肽聚糖仅2-3层，容易破裂
4.1 破裂细胞壁
常用破裂细菌细胞壁的方法： （1）机械法： 高压匀浆破碎法（homogenization） 振荡珠击破碎法 (Shaking Bead) 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）