枯草芽孢杆菌的研究进展摘要枯草芽孢杆菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的革兰氏阳性杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物的体表，细胞壁不含内毒素，没有致病性，具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分泌到培养基中，是一些重要工业酶制剂的生产菌[1]。
在营养缺乏的条件下，枯草芽孢杆菌停止生长，但同时加快代谢作用，产生多种大分子的水解酶和抗生素，并诱导自身的能动性和趋化性，从而恢复生长。
在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子，具有较强的抗逆性。
作为革兰氏阳性细菌的典型代表，对于其生理、生化、遗传及分子生物学的研究已有40多年的历史。
近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。
关键词：枯草芽孢杆菌；启动子；绿色荧光蛋白；载体；表达；异源基因1 枯草芽孢杆菌基因组研究枯草杆菌有以下一些优点: ①非致病性，不具有热源性脂多糖和细胞内毒素，具有较好的生物安全性，炭疽杆菌和蜡样芽孢杆菌除外，多数芽孢杆菌对人畜无害[2]；②遗传学特性先进，很多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体；转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA[3]。
③较强的蛋白分泌能力，当分泌蛋白跨过细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中，使回收和纯化目的蛋白较为简单[4]。
④良好的发酵基础和生产技术。
枯草杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶以及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等。
枯草杆菌能在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。
细胞的生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。
⑤细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷壁质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。
2 枯草芽孢杆菌基因表达特性2.1 多σ因子原核基因的转录主要由RNA聚合酶完成。
该酶由5个亚基组成，二个α亚基、一个β亚基、一个β′亚基和一个Sigma（σ）因子。
5个亚基组成全酶，除去σ因子为核心酶（E）。
σ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后σ因子就不起作用了［5］。
12.2 启动子的特征迄今发现枯草杆菌启动子主要有两种方式：一是单个启动子，具有单个启动子的基因，大多数在快速生长时期表达；另一为复合启动子，它包括串联启动子和重叠启动子。
有如下特征：①不同类型的两个启动子重叠；②两个启动子有不同的转录起始位点或相同的起始位点；③启动子可能受时序调节。
这类启动子在枯草杆菌感知外界环境的变化、时序调节、孢子形成和萌发等诸多生命现象中发挥重要作用[6]。
2.3 终止子在大肠杆菌中根据转录终止是否依赖Rho蛋白因子而分为两类，而在芽孢杆菌基因转录的终止方面，只有少数几个基因如spoOA、gnt和trp操纵子等得到很好的研究[7]。
它们的终止区都有一个富含GC的对称序列，基因转录是在一串T碱基前终止的。
有证据表明，枯草杆菌使用的终止子在结构和序列特征上与大肠杆菌相似。
而且也发现大肠杆菌在枯草杆菌中同样起作用。
2.4 芽孢杆菌mRNA的核糖体连接位点(RBS)与其他原核生物一样，枯草杆菌的RBS也涉及到SD序列、SD序列与起始密码间的间隔区以及起始密码子。
芽孢杆菌中最常见的典型序列是“GGAGG”，而大肠杆菌的为“AAGGA”。
在芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为AUG，但也发现有些基因中是GUG。
目前，尚不十分清楚不同起始密码子的应用对翻译效率有什么影响［8］。
2.5 蛋白的外分泌大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一层细胞膜，因而可以大量分泌蛋白至培养基中。
通过计算机分析，枯草杆菌有将近300个N端具有信号肽用来跨膜的蛋白。
不过用来表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁表层蛋白等。
3 枯草芽孢杆菌的重组表达载体目前报道用作宿主表达克隆基因的有：枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、耐碱的芽孢杆菌、病原菌炭疽芽孢杆菌，以及独立与芽孢杆菌的短短芽孢杆菌［9］。
选择不同的芽孢杆菌作宿主，一般都有着极强的应用研究的目的。
3.1质粒载体在枯草芽孢杆菌中，早期质粒载体主要来自其他革兰氏阳性细菌，特别是来自金黄色葡萄球菌的质粒，其中使用广泛的有Pub110、Pc164、pE194等[10]。
它们的主要优点在于分子量小，有唯一的酶切位点，较高的拷贝数，适合筛选的抗性标记。
3. 2 噬菌体不少噬菌体可用作芽孢杆菌的表达载体，如Φ105噬菌体、sppl噬菌体等，其中Φ105噬菌体应用较多，其基因组约为39.2 kb，利用鸟枪法（shotgun experiment）可方便地分离感兴趣的DNA片段。
3.3染色体整合载体采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服芽孢杆菌质粒不稳定性的一个有效途径。
这种质粒的构成包括大肠杆菌质粒复制起点，一个用于选择的抗性标记（如Kan、Em、Cm）以及一两段与枯草芽孢杆菌染色体具有一定同源性的序列，亦称交换臂。
4 枯草芽孢杆菌外源蛋白的分泌表达4.1 信号肽和信号肽酶通常，来自枯草杆菌的分泌蛋白能转运到大肠杆菌的周质腔中，而来自大肠杆菌分泌蛋白的信号肽很少能在枯草杆菌中起作用。
表明枯草杆菌分泌元件对信号肽结构有特殊要求。
4.2 蛋白质的分泌表达在枯草杆菌中，由于其α-淀粉酶和一些蛋白酶被大量分泌到培养基中，因此这些酶基因的表达和分泌元件常被用来构建分泌载体。
4.3 蛋白质分泌的机制近几年，对枯草杆菌蛋白分泌机理的认识取得了较大的进步。
许多与分泌有关的元件被鉴定，并发现其中一些成分与大肠杆菌分泌元件有很高的同源性，存在功能上的互补，如枯草杆菌的SecA、SecE 和SecY能分别替代大肠杆菌的SecA、SecE 和SecY行使同样的作用[11]。
4.4 蛋白分泌的影响因素3枯草杆菌有强的分泌蛋白的能力，但对一些外源蛋白的分泌经常是低效率。
影响因素很多，归纳为以下五点：①有效分子伴侣的缺乏影响蛋白的分泌。
前体蛋白分泌之前必须被折叠成适合转运的构象，而折叠过程需要分子伴侣和其他靶因子来完成。
对于某些外源蛋白，由于与其发生有效相互作用的分子伴侣的缺乏，使之不能正确折叠，而在胞质中形成包涵体。
②信号肽酶对某些前体蛋白加工能力影响其分泌。
信号肽的切除是蛋白从细胞膜释放的必要条件，而一些信号肽酶的合成受到时序调节，使得某些外源蛋白的分泌量受时序控制，从而与信号肽酶的合成一致。
③连接在膜外促蛋白折叠因子PrsA 的数量影响外源蛋白的高分泌[12]。
④蛋白酶的降解导致外源蛋白低产率。
⑤细胞壁成为某些蛋白的分泌屏障。
枯草杆菌厚的细胞壁是一个交叉连接的半孔状结构，主要由肽聚糖和阴离子(如磷壁酸、糖醛酸磷壁质) 多聚体组成。
虽然一些蛋白能自由通过细胞壁，但是一些大的蛋白分子，特别是那些表面带正点荷的蛋白分子可能被细胞壁滞留，不能释放到培养基中，或仅有少部分分泌到培养基中。
这些影响因素针对不同的目的白，各自所起的作用不同［13］。
5 枯草芽孢杆菌外源蛋白的细胞内表达对于枯草杆菌表达外源蛋白得研究主要集中在分泌表达，而对其胞内表达的研究涉及较少。
实验发现，胞内表达载体与分泌表达载体的唯一区别就是没有编码信号肽的序列。
现在，许多高效表达载体的获得，为实现外源蛋白的胞内表达创造了条件。
6 枯草芽孢杆菌研究中存在的问题和发展方向6.1 自身蛋白酶的分泌蛋白酶的分泌是枯草杆菌作为表达宿主的限制因素之一。
研究发现在枯草杆菌中已发现至少有27 种胞外蛋白酶。
这些蛋白酶受时序调节，没有底物专一性。
当外源蛋白分泌表达后，容易被蛋白酶降解，从而大大降低产率。
6.2 质粒的不稳定性外源蛋白在枯草芽孢杆菌中高效表达的另一制约因素是质粒在枯草芽孢杆菌中通常不稳定性。
这些不稳定可以分成两大类[14]。
6.2.1 分离型不稳定性。
分离型不稳定性是指整个质粒从细胞中丢失。
质粒保持稳定需要正确的拷贝数控制，因为ssDNA 质粒上没有加par 基因座。
par功能是在细胞分裂时主动把质粒拷贝分配到各子细胞。
没有par 功能，子细胞中的质粒就靠随机分配，如果质粒拷贝数发生波动，就会导致分离型不稳定性［15］。
6.2.2 结构型不稳定性质粒结构型不稳定的机制可分为两类：模板选择的差错；断裂重接中的差错。
解决的办法有：①利用多个调控基因和诱导等方法控制外源基因的表达；②将克隆基因整合到染色体上，随染色体的复制而复制。
是克服枯草杆菌质粒不稳定的一种有效途径。
对于外源蛋白表达的研究枯草芽孢杆菌还远远落后于大肠杆菌，但其在表达和分泌活性蛋白方面则要明显优于大肠杆菌，实践证明，它能够表达多种可溶的且具有生物活性的蛋白质。
总之，随着研究的不断深入，枯草杆菌蛋白分泌机制将得到更清楚的认识。
相信在不久的将来影响枯草杆菌表达系统发展的问题会很好地被解决。
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