细胞电生理学与膜片钳技术资料

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膜片钳实验与技术

膜片钳实验与技术
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单击输入目录标题膜片钳实验原理膜片钳实验操作流程膜片钳实验数据分析膜片钳实验的应用实例
膜片钳实验的未来发展与挑战
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膜片钳实验原理
膜片钳技术的基本原理
膜片钳实验原理：通过玻璃微电极接触细胞膜，记录单一离子通道活动的电位变化，从而研究细胞膜离子通道的特性。
膜片钳实验操作步骤
准备实验器材：包括膜片钳放大器、微操纵器、微电极、
细胞夹持器等
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细胞贴片稳定：等待细胞贴片稳定后，进行下一步操作
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开启膜片钳放大器：开启放大器，调节放大器参数，确保记录到有效的膜电流信号
数据记录：记录膜电流信号，进行分析和处理
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新型膜片钳技术的研发，提高实验效率和准确性应用人工智能技术，实现自动化数据分析与处理结合其他技术手段，拓展膜片钳技术的应用领域持续优化膜片钳设备，降低实验成本，提高普及率
膜片钳实验在多学科交叉中的应用前景
神经科学领域：研究神经元电活动与行为之间的联系生理学领域：研究生物体的生理功能和机制药理学领域：研究药物对细胞膜通道的影响和作用机制生物医学工程领域：开发新型膜片钳技术，提高实验的灵敏度和特异性
膜片钳技术的特点：高灵敏度、高分辨率和高时间分辨率，能够记录单个离子通道的活动。
膜片钳技术的应用范围：研究细胞膜离子通道的生理功能、药理作用和药物作用机制等。
膜片钳实验的影响因素：电极内液的成分、温度、细胞内外的离子浓度和 pH值等。
膜片钳实验的应用范围
神经科学：研究神经细胞的电生理特性药理学：药物对膜通道的影响生理学：研究生物膜的离子通道功能病理学：研究疾病状态下膜通道的异常变化

膜片钳技术讲座幻灯

1. 膜片钳技术简介

1976 年德国马普生物物理化学研究所 Neher 和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patch clamp techniques）。 1980 年 Sigworth 等获得 10-100GΩ 的高阻封接（Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善， 1983 年 10 月，《Single-Channel Recording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。

内向电流（Inward current）从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+ ）电流或从
细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。

外向电流（Outward current）
从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细
胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。
3. 膜片钳系统中的电阻
膜电阻（Membrane resistance, Rm）指脂质双分子层的跨膜电阻，反映离子是否容易穿透细胞膜。在细胞膜离子通道关闭时， Rm很大，可达几百MΩ。不同于膜电容，各种细胞的Rm 变异较大。膜输入阻抗（Membrane input resistance, Rin）对 Rm 的测量是通过对膜输入阻抗的测量间接得到的。给细胞膜施加一系列刺激方波，测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin 。注意要在形成全细胞记录时测定，在形成高阻封接时， Rin =Rseal。

南京药理学膜片钳电生理技术原理

南京药理学膜片钳电生理技术原理
南京药理学膜片钳电生理技术是一种电生理研究技术，主要用于研究神经细胞或肌细胞的离子通道、离子泵等生理学特征。

该技术通过精细的电极制备和膜片吸附技术，可以在微小范围内对细胞膜上的离子通道做直接测量，从而探测细胞膜电位和电流。

该技术的原理是在一条微细的玻璃电极制成的药理学膜片上吸附悬浮的细胞，使细胞的膜紧贴于药理学膜片的通道上。

然后使用电生理技术进行实验，测量当细胞膜上某个离子通道开放时，离子的电流就会通过药理学膜片钳的电极进入记录器中，从而获得离子通道的电流、电位等信息。

同时，通过改变细胞膜上的离子浓度或加入药物，可以研究离子通道的特性，如激动、抑制、选择性等方面的生理学特征。

南京药理学膜片钳电生理技术在研究神经和肌肉等细胞膜上离子通道的生理学特征方面具有广泛的应用，如研究钙离子、钠离子、钾离子等离子通道的生理学特征，探索离子通道的结构及其功能解析等方面。

膜片钳技术概述

角出，目的也是为了减少震动。
2）屏蔽罩：用铜丝网制成，防止周围环境的杂散点场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。有的膜片钳实验所测试的细胞或某种物质是光敏感的，或者膜片钳实验是与光学测量联合进行测需要采取光屏蔽，则屏蔽罩的外壁用黑色布遮盖或在暗室里操作以减少强光的干扰。
2、光学部分
倒置显微镜优点：具有较好的视觉效果便于将玻璃微电极与细胞的顶部接处。具有较好的机械稳定性。
荧光染料Fu ra-2 可被紫外光激发发射出荧光, 它可选择性地结合钙离子, 而与钙离子结合的Fu ra-2 越多, 以相同紫外光激发出的荧光就越弱, 因此可根据荧光强度的变化计算出单位体积中钙离子浓度的变化。具体过程为: 在做全细胞记录之前, 以孵育或经电极扩散的方法使荧光染料Fu ra-2 进入细胞, 然后对该细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多种指标变化情况进行观测,并分析这些变化间的相互关系。
电极电容Cp极小，只有几各pF，相应的电路时间常数甚小，因而对于Cp瞬态补偿称为快电容补偿，细胞膜电容的值约为1µF／cm2，由于此时的充电电流需要流经串联电阻Rs（Rs 的值约为几个兆欧），时间常数较大，故Cm 的补偿称为慢电容补偿。此外，串联电阻Rs因跨接在Cp和Cm之间，当有电流经过时，将产生可观的压降，如当Rs＝5MΩ ，I＝2mA时，可导致钳制电位误差达10mV；消除这种误差的
3、电子部件：包括膜片钳放大器、刺激器、示
波器及记录系统。膜片钳放大器：
是膜片钳实验中一个核心仪器，通过它把生物电信号放大。从原理来说，膜片钳放大器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种典型的结构，但是相比较而言，后者降低了噪声，所以特别适用超低噪声的单通道记录。

膜片钳技术及其应用

细胞信号转导的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单个离子通道的活动，从而提供关于细胞膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的情况下进行实验，不会对细胞造成严重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时监测，从而了解离子通道的动态变化，有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外灌流液
用于放大细胞膜电信号，提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动，以便在细胞膜上定位和进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的稳定，并排除干扰实验的物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子通道的关系。

上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤

上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤
一、技术原理
膜片钳电生理学是一种利用膜片平板钳技术来研究细胞内电位
变化和影响细胞内电位的因素的技术。

它可以报道细胞内电位的变化情况，探索细胞的内源性和外源性电位协调机制，研究细胞内电位的调节机制，进而研究细胞内信号转导的机制。

二、实验步骤
1. 膜片制备
（1）将管测仪清洗干净，加入约5ml测定液；
（2）以低浓度药剂去除细胞内的Chloride离子等离子混合物，准备独立的Chloride离子作为探针；
（3）用手注入细胞膜片，将药剂和Chloride离子完全混合；
（4）用滤纸将药剂Wash掉，每次100ul，用重力将它们从滤纸上吸附下来；
（5）将除在管中的细胞膜片送入实验箱中，将其安装在膜片平板钳中；
（6）将管测仪的开关打开，按照软件的指示准备好实验。

2. 测量
（1）定时对每个膜片进行测量，以获取膜片电流的变化；
（2）记录细胞内电位的变化情况；
（3）观察膜片电流在不同条件下的变化趋势。

3. 数据处理
（1）将测量的数据记录在Excel表中；
（2）按照分析要求，对原始的测量数据进行处理；
（3）计算出每个膜片的平均电位和标准差，并将结果可视化；
（4）根据测量的电位，探究细胞内的电位调节机制。

4. 实验结果分析
根据实验结果，进行定量分析，研究细胞内电位的变化、比较不同药剂对电位变化的影响，以及探究细胞内信号转导的机制。

福州细胞生物学膜片钳原理及步骤

福州细胞生物学膜片钳原理及步骤
福州细胞生物学膜片钳是一种用于研究细胞膜电生理学的实验技术。

它的原理是利用玻璃微管制成的膜片钳，将细胞膜钳住，形成一个微小的电容器，然后通过电极对细胞膜进行电刺激，记录细胞膜电位变化，从而研究细胞膜的离子通道和转运蛋白等功能。

福州细胞生物学膜片钳的步骤如下：
1. 制备膜片钳。

将玻璃微管拉制成细长的管状，然后用火烧制成一个小孔，形成一个膜片钳。

制备好的膜片钳需要经过精细的调试，以确保其能够稳定地夹住细胞膜。

2. 培养细胞。

选择需要研究的细胞，进行培养和处理。

通常需要将细胞培养在培养皿中，使其生长到一定密度和状态。

3. 制备细胞悬液。

将培养好的细胞用生理盐水等缓冲液洗涤，然后用胰酶等酶类消化剂将细胞分离成单个细胞，制备成细胞悬液。

4. 夹住细胞膜。

将制备好的膜片钳放置在细胞悬液中，调整其位置和角度，使其夹住一个单个的细胞膜。

夹住细胞膜的过程需要非常小心和精细，以避免损伤细胞膜。

5. 记录细胞膜电位变化。

将电极插入细胞悬液中，接触到细胞膜上的电极点，然后进行电刺激，记录细胞膜电位变化。

通过改变电刺激的强度和频率，可以研究细胞膜的离子通道和转运蛋白等功能。

福州细胞生物学膜片钳技术具有高灵敏度、高分辨率和高可控性等优点，可以用于研究细胞膜的离子通道、转运蛋白、受体和信号转导等功能，对于深入理解细胞生物学和生理学等领域具有重要意义。

膜片钳电生理

膜片钳电生理
膜片钳电生理是一种用于研究膜电位和离子通道功能的实验技术。

它可以通过将玻璃或石英毛细管与细胞膜相接触，并创建一个控制环境以测量和控制细胞膜电位的微小电流。

该技术通常用于研究神经元、心肌细胞或其他细胞类型的电生理特性。

它可以测量膜电位的变化，或者通过应用不同的电压或药物来观察离子通道的活性和性质。

膜片钳电生理可以提供关于细胞膜电位和离子通道的详细信息，包括离子通道的开放概率、离子通道的电流特性以及膜电位的稳定性。

这对理解细胞膜在神经传导和心肌收缩等生理过程中的作用非常重要。

然而，膜片钳电生理需要高度技术化的实验操作和专业知识。

它需要使用复杂的实验设备，并且对实验环境和细胞样本的处理要求非常严格。

因此，它通常是由经验丰富的研究人员在专门的实验室中进行的。

膜片钳

优点细胞吸附模式
缺点
不破坏细胞的完电流小，分辨率地，整性, 内环境保持对技术要求高，难正常。度较大
内膜向外模式可以分别观察化
学因素对细胞膜内侧面和外侧面外膜向外模式结构的影响。
由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子
全细胞模式
电流大，信噪比好，可以改变细胞内容物
只能用于直径小于 3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。
膜片钳技术的原理

膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴
电压钳：1.双电极电压钳该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。 2.单电级电压钳膜片钳
膜片钳技术
膜片钳：用玻璃微电极尖端与细胞膜封接，封接的微区称为膜片，并外接钳制电压将膜片钳位，总称膜片钳。关于钳字

膜片钳技术的原理

一、电压钳位细胞膜上的电流
离子通道电流膜电容充放电电流（消除）用微电极将膜电压钳制到新的数值上，保持一段时间不变使膜电容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期，测得的跨膜电流可以认为来自于离子通道电流。

谢谢
外膜向外式

在全细胞模式状态下将电极向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起，此时膜内面对电极内液，膜外接触的是灌流液。可在改变细胞外液的情况下记录单通道电流。
全细胞式

在细胞贴附式状态下增加负压吸引或者给予电压脉冲刺激 (zapping)，使电极尖端膜片在管口内破裂，即形成全细胞记录模式。此时电极内液与细胞内液相通成为和细胞内电极记录同样的状态，不仅能记录一个整体细胞产生的电活动，并且通过电极进行膜电位固定，也可记录到全细胞膜离子电流。这种方式可研究直径小于20μm 以下的小细胞的电活动；也可在电流钳制 (current clamp)下测定细胞内电位。

心脏电生理技术基础(膜片钳)

操作技术要求较高；对细胞的侵入性较大。
膜片钳实验操作技巧
准备工作
细胞处理
操作步骤
准备好玻璃微电极、电极填充
获取目标细胞，如心肌细胞或
将玻璃微电极进入细胞膜，形
液和录音设备。
神经元，进行培养和处理。
成一个密封，调整电极位置，
记录和分析电流。
结论和展望
膜片钳是研究心脏电活动和细胞膜离子通道的重要工具。随着技术的进步，
膜片钳的应用范围将进一步扩大，为心脏病、神经科学和药物研发等领域提
供更多的研究突破。
膜片钳的分类
全细胞膜片钳
内外膜片钳
通过破坏细胞膜，将膜片与细胞内外连接，可
只破坏细胞膜的一侧，可以选择性地记录细胞
以记录到细胞内外的完整电活动。
内或细胞外的电活动。
斜膜片钳
差分膜片钳
将膜片与细胞膜倾斜连接，可以记录到细胞内
通过使用两个膜片钳同时记录细胞内外的离子
部的离子通道电流。
通道电流，可以获得更精确的记录。
心脏细胞的电活动和离子通道功能。
变化，帮助研究神经传递机制。
药物筛选和研发
基因工程研究
膜片钳可以用来评估潜在药物对离子通道的作用，
通过记录细胞膜上的电活动，可以研究基因工程对
帮助药物筛选和研发。
细胞功能的影响。膜片钳的优源自点1优点高分辨率记录细胞膜上的离子电流；可以精确地控制实验条件。
2
缺点
膜片钳的工作原理
膜片钳使用一根玻璃微电极将电极进入细胞膜，形成一个密封。通过施加负压，使电极与细胞膜贴合，形成一
个高阻抗的接触。然后，通过改变电极与细胞膜之间的电位差，可以测量细胞膜上的离子电流。
研究应用举例
心脏细胞的离子通道研究

Patchclamp膜片钳实验学习资料

Patch clamp膜片钳实验学习资料Patch clamp膜片钳实验学习资料2011-06-03 10：26历史1976~1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术(patch clamp technique)为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化.两位科学家1991年荣获诺贝尔生理或医学奖.膜片钳技术是经微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，其值可小到pA(10-12A)量级，是一种典型的低噪声测量技术.应当注意，为测量膜通道电流，必须将膜钳制于某一固定的电位上.理论生物电信号测量基础电路中，基本组成元件为电阻器(R)、电感器(L)和电容器(C).在生物系统中，电流的值很微弱(pA,10-12A~nA,10-9A).当细胞膜Na+通道开放时，一毫秒有104Na+跨膜，相当于1.6pA.生物测量电路中存在两种导电机构(电子和离子)，需特制的电极和导电液体作为二者导电的接口.生物体中的电阻器和电容器等元件，可用欧姆定律描述，但呈严重非线性特性时，用曲线描述.几个基本定律：欧姆定律：电流I流经一电阻R时，将在其两端产生电位差V=IR基尔霍夫电流定律(KCL)：电路中，任何时刻，对任一节点，所以支路电流的代数和恒等于零.基尔霍夫电压定律(KVL)：电路中，任何时刻，沿任一回路内所有支路或元件电压的代数和等于零.电导器：电导是电导器对电流导电性能的电学量，用符号G表示，单位为西门子(S).而电阻是电路中电阻器对电流呈现阻力的电学量，用符号R表示，单位为欧姆(W).这两个电学量具有互补意义，互为倒数，即G=1/R.一个无穷大的电阻，其电导为零.电容器：电容是储存电荷的电容器的电学量，用符号C表示，单位为法拉(F).电容器的电容量与极板面积成正比，与极板之间的距离成反比，还与绝缘层的介电性质有关.当电容器两极板之间施加电压V时，则所存储的电荷Q=CV(单位：C-法拉，V-伏特，Q-库仑).细胞膜的电容常表示为每单位面积的电容量(比电容)，几乎所有的脂质双分子层约有1mF/cm2的电容量.在电容器两端外接电压时，两极板之间将产生电场.细胞膜厚度约为10nm，若电压为100mv，则在膜产生很大的电场强度105V/cm.可被电压门控型离子通道的敏感机构所检测.细胞膜电路参数特征表述：脂质双分子层的介电特性可用电容C表示，离子通道则用电导G表示.可兴奋细胞膜的等效电路：根据基尔霍夫电流定律(KCL)，可有Im=ic+Ii=Cm(dVm/dt)+(Vm-Er)/Rm=Cm(dVm/dt)+Gm(Vm-Er)其中，Vm-膜电位(V)；Im-总膜电流；ic-电容电流；Ii-离子通道电流(A/cm2)；Rm-膜的比电阻(W/cm2)；Gm-膜的比电导(S/cm2)；Cm-膜的比电容(F/cm2)；Er-静息电位，但某一离子形成Ii时，则Er被平衡电位Ei(对应于离子i)所替代.可见，离子电流Ii取决于总的膜电导Gm与驱动力(势)(Vm-Er)的乘积.一般来说，细胞膜的离子电流是单个电流之和，即Ii=INa+Ik+ICl+×.每种离子产生的电流分量如INa=GNa(Vm-ENa).微电极与导电溶液微电极是生物测量中的传感器.从导电角度来看，某些含水的离子溶液，如血液，胞浆及海水均遵守欧姆定律.电流由两种离子运载，即阳离子和阴离子.当电流流过细胞膜离子通道时，选择性由一部分离子运载.电极上的电子与溶液中的离子进行变换可能会出现误差.常用电极为银/氯化银电极.细胞膜离子通道分类电压门控通道：膜受体门控通道：胞内第二信使激活的通道：通道电流的记录模式(recording configuration)细胞贴附式：用于单通道记录全细胞记录式：研究胞内第二信使时有着特殊的优势(但破膜后细胞变形，影响记录结果，可用穿孔膜片钳技术)膜外朝外式：用于单通道记录膜内朝外式：用于单通道记录膜片钳实验系统的组成机械部件：防震工作台，屏蔽罩，仪器设备架光学部件：显微镜，视频监视器，单色光系统电子部件：膜片钳放大器，刺激器，数据采集设备，计算机系统微操纵器：机械式，机电式，液压式玻璃微电极工艺玻璃毛坯管：有软玻璃(苏打玻璃，电石玻璃)和硬玻璃(硼硅玻璃，铝硅玻璃，石英玻璃)之分.软玻璃熔点低，易抛光，但1KHz的电导率是膜片记录的主要热噪声源(有较大的介电松弛特性)硬玻璃拉制后有较窄的末梢(较高的电阻)；硼硅和硅硅玻璃有较好的噪声和介电松弛特性；石英玻璃特别适用于低噪声记录，但需激光源拉制.玻璃微电极拉制工艺：垂直式拉制仪，水平拉制仪电极熔锻仪和优化处理：一是为减小电极内部与溶液之间的电容(电极末梢数微米涂敷疏水材料硅酮树脂，以阻止液膜上爬)；二是为了对电极尖端作优化处理(热抛光使电极尖端光滑，以提高封接成功率).电极流灌：为防止灰尘污染，置有盖容器内并需2~3小时内使用；电极内液充灌前最好用滤纸过滤.电极夹持器：可用甲醇清洗保持清洁浴池电极：浴池电极应该有一个稳定的电极电位并且不扰乱浴液成分.通常裸露的Ag/AgCl丝作为一种良好的浴池电极.然而Ag+仅能为某些细胞所承受，需用琼脂盐桥改善.技术膜片钳的工作模式(operating mode)电压钳模式(voltage clamp,VC)：电流钳模式(current clamp,CC)：用已知恒定的或者时变的电流作用于细胞，测量作用电流引起的膜电位的变化.实验前准备工作细胞活性状态：活细胞寿命比较短溶液准备：一般来说，浴液模仿自然的胞外环境，电极内液取代细胞溶质(胞液).胞外用浴液以公升为单位存放于冰箱，胞内用液以小容量(5~10ml)为单位冻存，实验前解冻.必须注意pH值和渗透压，亦需过滤.某些实验前的短时间内，需要向小容积(100~500ml)的电极充灌液中补加冻存物(如ATP,GTP,荧光染料，多种第二信使等)到一个Eppendorf管.实验步骤：两个重要环节高阻封接：电极与细胞膜形成封接的过程，可用示波器来观测当对电极施加一脉冲电压时的电极电流.在电极未入液前，可观测到一平坦的电流波形，混杂有电极和夹持器的杂散电容所形成的瞬态电流；当电极入液后，2mV的脉冲将产生1mA的电流通过约2MW的电极.当电极趋近细胞膜，并形成吉欧封接，将进一步增加电极电阻和减小电极电流.为证实吉欧封接的形成，可增加放大器的增益，观察到除脉冲电压的首尾两端电容性脉冲尖端电流外，电流波形仍呈平坦状.数据记录：以全细胞记录为例吸破膜片：负压或高电压脉冲参数补偿：从电路角度观察，当施加脉冲电压时，电极入口处因电极电容，入口电阻和膜电容的存在，构成一个较复杂的RC网络.当外加测试脉冲电压或命令电压时，将产生瞬态电流响应，严重干扰预期的测试结果.因此实验记录之前需要进行参数补偿，以获得实际的结果.为了消除这些参数的瞬态影响，膜片钳放大器均设有补偿电路.快电容补偿：电极电容Cp极小，仅几个pF，相应的电路时间常数很小，故对于Cp瞬态补偿称之.慢电容补偿：细胞膜电容约为1mF/cm2，此时的充电电流需流经串联电阻Rs(约几MW)，时间常数较大(约100mS)，故Cm的补偿称为慢电容补偿.串联电阻补偿：串联电阻跨接于Cp与Cm之间，当有电流经过时，产生可观的压降(如Rs=5MW，Ip=2mA，其导致钳制电位误差达10mV).因此需要消除这种误差的电路措施.数据记录：设置适当的放大器的带宽注意事项溶液：浴池和电极溶液渗透压和pH值；浴液中的二价离子具有屏蔽表面膜电荷的作用；许多有机化合物不易溶于水；氯离子Cl-是水溶液和Ag/AgCl丝电极之间的主要电荷传递离子(电子导电和离子导电的接口作用)；失调电压(放大器的失调电压，电极电位，液结电位等)；电极流灌液补加ATP等以维持细胞信号转导或某些离子电流的衰减；来自于容器，注射器，管子，针具及非高纯度化学试剂的污染.电极：电极本身的AgCl涂层受损；电极与生理盐水之间的电位问题(电极有气泡?电极与探头虚接?浴池电极未接通等)数据采集：存在问题有泄漏校正，保持电位的选择和刺激方案，采样频率的正确选择和滤波器设置.应用单通道电流记录技术细胞贴附式记录模式：细胞贴附式是最早使用的记录模式.由于单通道电流非常微弱，因此抑制噪声非常重要.膜片钳系统中的噪声成分除电子仪器噪声，电极噪声外，尚有封接噪声.因此高阻封接或吉欧封接是技术关键.为实现高阻封接，必须注意：细胞膜表面光洁，浴液干净无杂质和灰尘污染；电极材料宜用硬质玻璃，最好抛光并涂硅酮树脂以改良介电特性，降低噪声；具体封接技术经验非常重要(电极尖粘污灰尘；电极仅用一次；酶处理细胞浴液表面残渣；电极内液含Ca2+，则必须用HEPES缓冲液，以防止其与磷酸盐形成结晶；低渗透的(10%)电极溶液比较容易形成高阻封接).离体膜片的单通道电流记录在细胞贴附式记录模式基础上，派生出的膜外朝外式和膜内朝外式，因只剩下一个微小而独立的膜片，故称之为离体膜片(cell-free patch).此时细胞内，外环境均可人工控制，自由地对膜片上的单一离子通道进行调控和实验研究.离子通道的辨识可以通过门控机制，药物激活或阻塞来辨识.单一离子电流的记录数据所有的离子通道的开放和关闭处于一种随机和突变性的状态.也就是说，通道在导通和非导通两种状态下随机变化，其开放(关闭)概率由跨膜电压或配体结合所控制.从数学观点来看，这种特性是非确定的，不能用确切的明显的数学方程来描述.而只有用随机分析方法来处理(阈值检测法；直方图-幅度直方图和开关持续时间直方图).全细胞记录技术基本实验步骤：进行全细胞记录(whole-cell recording,WCR)时，电极内液应是低Ca2+的.电极尖端与细胞膜接触并形成吉欧封接使膜吸穿后，电极电位随即变为负值.将幅值几毫伏的阶跃电压通过电极作用于细胞膜，立即出现电容暂态响应.调节C-fast以消除电极电容(快电容)引起的暂态误差.对电极内腔施加一脉冲负压，直到细胞膜封接区吸破，以至电流大增，噪声也加大.进行膜电容补偿.一旦WCR模式形成之后，可将微电极稍微提升以减轻对细胞的压力.WCR实验可持续至少1小时而无衰变现象.若细胞紧贴培养皿，移开微电极时，有可能形成膜外朝外式.可以开拓应用：1.此方法对所选定细胞产生最少的膜损伤，而达到改变细胞内液目的；2.仅需更换微电极对某一细胞进行连续的不同内液的全细胞记录；3.借助此方法可以在一个实验中获得宏观的和单通道的数据.全细胞记录模式中的电极充灌：标准的电极内液：pH缓冲液(10mMHEPES，调节pH2.4)；Ca缓冲液(10mM EGTA+1mM Ca，给定Cai 10nM)；MgATP(~2mM；使ATP酶保持活性)；自由Mg2+(~1mM，在许多胞液过程中，作为一种辅助因子)；GTP(~0.1mM)用于涉及研究G蛋白的实验.ATP和GTP是不稳定的.电极内液含有核苷酸时应将其保持在冰冻状态，实验过程中，融化了液体必须置于冰块上.对于长程记录(30min)，应使用ATP再生式系统，以避免ATP在电极中衰减.细胞通常含有谷胱甘肽，K+和Na+通道的失活依赖于电极内液的氧化还原电位，应当灌注5mM谷胱甘肽以防止产生异常现象.谷氨酸盐，MOPS和羟乙磺酸盐可替代胞内标准阴离子(Cl-)以保持负平衡电位.F-也可作为胞内阴离子，也穿透Cl-可通透的通道.F-优于Cl-地方在于形成封接和记录的稳定性.F-与Al3+形成AlF4，它是一种G蛋白有效激活剂；F-也是一种Ca2+缓冲剂，干涉Ca依赖性过程.因此对于涉及G蛋白和胞内信使的过程，使用F-是不合适的.穿孔膜片钳技术：为克服某未知因子进入电极而使细胞功能被冲洗的缺点，在细胞贴附模式下，应用穿孔剂而形成穿孔膜片钳(perforated patch clamp).胞内的关键扩散分子不能跨越膜上生成的孔道以避免冲洗现象的发生.常用穿孔剂：制霉菌素(Nystatin)和两性霉素(Amphotericin B)Nystatin是一种多烯抗生素类药物.Nystatin孔道具有特殊的性质.Nystatin对细胞封接的抑制作用(封接时电极尖端不能有穿孔剂).Nystatin不溶于水，对光线敏感(溶液必须进行超声处理和光屏蔽).全细胞记录技术的应用：离子通道宏观性质的分析(离子通道的性质和分类-电压门控通道，膜受体激活通道，配体门控通道，胞内第二信使激活通道等)；离子通道微观性质分析(单一离子通道活动的测定，离子通道的构造，分布和机能分布等)；膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究；胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测；组织切片的全细胞记录；植物细胞的电生理研究.重要概念小结：全细胞记录技术是四种记录模式中应用最广泛的一种.建立全细胞模式的电路模型，可以对其功能进行电学分析，包括暂态分析，其时间常数近似为t=RsCm.对于复杂的神经细胞分析，可以采用分段建模的概念来解决.在全细胞记录模式中，电极内液与胞液之间的物质扩散与平衡，同样可以用分段建模的化学方法来分析.穿孔膜片钳是全细胞记录的派生模式，可以防止细胞内物质的流失而影响其功能.脑切片膜片钳技术优点：无需酶处理；应用高分辨率的记录技术在可分辨的神经元进行试验(组织结构相对完整)；可与其它方法结合(胞内离子荧光测量，常规荧光成像，共聚焦激光扫描成象，多光子激光扫描成像)脑切片脑切片的制备与维护断头开颅切脑区置冰冷充氧盐水(1min)组织冷却(10min)修剪组织粘贴到切片台，并冰液覆盖振动切片(60~400mm,10min)切片孵育(备用(25℃以下，10h以内)，实验用(32~37℃孵育约30min))(也可37℃孵育约30min 后转入25℃备用)脑组织的不同部位制备切片原则-保持神经元活性和树突不受损伤；依据所要研究的神经细胞确定切片的定位方向动物的品种与年龄新生动物-颅骨软，方便快速取出脑组织；脑组织小，置入冰冷生理盐水冷却快成年动物-脑组织坚韧，对缺氧敏感；组织髓鞘质多易致切片损伤脑切片膜片钳记录技术仪器设备样品器皿，记录腔，铂金丝，显微镜(差分干涉对比度显微镜DIC differential interference contrast或亮场光学显微镜BFO bright-field optics)(采用长波长的红外线可提高分辨率)电极内液和外液的配制标准电极外液：(mM,NaCl 125,KCl 2.5,CaCl2 2,MgCl2 1,NaH2PO4 1.25,NaHCO3 26,葡萄糖20)标准电极内液：依据实验目的(mM,KCl 140,MgCl2 2,CaCl2 1,EGTA 10,ATP 2,HEPES 10)切片上神经元和神经蚀质细胞的辨识视觉辨识：浅表细胞-显微镜下直接辨识；深层细胞-IR-DIC显微镜观察(也局限于4-0~50mm)荧光染料标记：染料从全细胞记录微电极注入；也可细胞浴液渗入.记录前的准备工作细胞清洗：对较深在的细胞，可用流体冲洗方法.选择细胞：好的细胞表面光滑，对比度好.记录用电极：电极相对细长以避免与物镜相触.电极阻值过大难于破膜，入口电阻(串联电阻Rs)大，也限制电极内液与细胞内部之间的物质交换.几种记录模式举例细胞贴附式：全细胞记录：膜外朝外式：双电极记录：脑切片膜片钳技术与其它方法的结合常规成像技术紫外光源(UV)照射到切片的某一区域.细胞载入荧光染料(Fura-2)后，其反射光特性发生变化.检测器可用CCD摄像机或光电倍增管PMT，均可测量细胞内钙离子浓度，荧光强度与钙通道电流.CCD的优点在于可以获得被测细胞(神经元)各个部分的图像.共聚焦成像技术激光源激发试样中的钙离子染料(Fura-2)，其反射的荧光被检测.因激发光和荧光反射光在一特定的平面聚焦(共聚焦平面).因试样中的荧光仅为一薄的光学平面被检测(薄层光学断层)，提高了空间分辨率，优于常规的荧光成像技术.多光子成像与常规荧光成像技术相比，提高三维分辨率；与菜聚焦成像相比，不依赖于特殊的光学设计，着眼于荧光染料的激发方式(激光源类型，波长).二-光子成像：由于激发光的波长较长，因而其散射和被吸收的概率很低；散射光子稀少以致其激发只限于一局部的焦点容积内.由于无需抑制聚焦平面以外的信息，所有的荧光光子都位于目镜之下并形成图像信息.多光子成像的优点：避免了紫外光照射对细胞的损伤(因低能量的激发波长在试样内狭窄聚焦平面内照射)；减少了染料光漂白和细胞的光中毒损伤(因染料仅在试样的小范围内受照射)；成像范围大(因激光波长大，穿透较深，可在样品深处收集图像信息).重要概念小结脑切片膜片钳技术是研究脑科学，特别是神经科学的重要方法.脑切片是从动物的脑区直接取出切割，其厚度可达500mm，常用的以200~300mm为宜.操作过程中，必须保持切片的活性.脑组织的结构复杂，为分清神经元的胞体，树突，突触等形态，以便于记录电极封接和记录，需要使用若干方法进行辨识(视觉辨识，荧光染料标记等).与单细胞记录类似，脑切片膜片钳记录也有细胞贴附式，全细胞，膜外朝外式等.膜片钳与成像技术结合可以得到更深入全面的信息(常规荧光成像，共聚焦激光扫描成像和多光子激光扫描成像).转自电生理网站。

杭州神经生物学膜片钳电生理技术原理

杭州神经生物学膜片钳电生理技术原理
杭州神经生物学膜片钳电生理技术原理
一、概述
膜片钳电生理技术是一种用于检测神经元功能的有效技术，它可以记录神经元细胞内的电位变化，从而获得神经细胞活动的定量信息。

膜片钳电生理技术可以在培养皿内对神经元进行长时间观察，以及在体内对神经元的活动机理进行研究。

膜片钳电生理技术通过把膜片钳电极插入细胞的膜片中，电生理技术可以实现对神经元功能的定量化研究。

膜片钳电极可以准确地测量因果物质和电解质释放而引起的膜片内电位变化的大小，从而可以提高细胞膜膜反应的准确性。

它为神经细胞活动的研究提供了可靠的定量信息，也是目前研究神经通路和药物作用的重要工具。

二、工作原理
膜片钳电生理技术是一种定量的技术，通常用于实验室中的神经生物学研究，可以检测细胞的多种活动指标，可以在实验室中研究神经通路和药物作用的机制。

膜片钳电生理技术是利用膜片钳电极插入神经细胞膜的特点，来检测神经元细胞内膜电位的变化。

膜片钳电极可以非常精确地检测因果物质和电解质释放而产生的膜内电位变化，比如神经元细胞内的乙酰胆碱，胆碱能，神经肽和突触可塑性的变化。

膜片钳电生理技术的原理是将膜片钳电极插入神经细胞膜中，电位变化会被膜片钳电极的两端传递给记录仪，由记录仪转换为电信号，
记录仪会对这些转换的电信号做记录，最后就可以实时记录神经细胞内膜变化的电压。

通过膜片钳电生理技术，可以准确地检测到神经元细胞内的膜电位变化情况，从而给出神经元细胞活动的定量信息，帮助研究者深入研究神经元细胞的活动机理。

培训学习资料-膜片钳技术-2022年学习资料

Patch Clamp 1976 ve-sonras1-a0.-10
第一次记录：-1.M-11
·1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH0-的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接 Giga-seal,大大降低了记录时的噪声，实-现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电-流的突破。-12
第一次记录：-A-改进：千兆欧G2封接-13
1981年Hamil1和Neher等对该技术进行了改-进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，-从而使该技更趋完善，具有1pA的电流灵-敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分-辨率。-14
1983年10月-《Single--Channel Recording.》-一书问世，奠定了膜片钳技术的里碑。-Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出-贡献，荣获1991年诺贝尔奖。-15
THE PATCH-CLAMP TECHNIQUE-Erwin Neher-Bert Sakmann-Ge many-1991 Nobel Laureates-gigaseal'-pipet-pipette-hum n hair-cell-16
Single-Channel-Recording-1983年10月第一版-Edited by Bert S kmann and Erwin Neher-KSingle-Channel Recording-封面
Isolated neuronal-cell body-maintained in-culture-Cel body-Patch pipette-patch-clamp-technique-for recordi g-electrical activity-DEET-50μm-Ejection

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膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。
由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面积仅约1μｍ2,离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少 , 可以忽略 , 也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略 , 那么 , 只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。
• 为研究化学门控性通道性质，我国学者秦达意采用 oil-gate concentration jump method ，配合膜片钳记录和分析离子通道在各种化学条件下的开放与关闭以及激活与失活的动态过程。
选择性（selectivity）门控性（gating）
研究技术：
膜片钳技术和分子克隆技术
通道蛋白——离子通道
• 配体门控通道阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体
乙酰胆碱受体
通道蛋白——离子通道
• 电压门控通道：钾、钠、钙离子通道
电压门控钾离子通道
通道蛋白——离子通道
磷脂双层的屏蔽作用
Na-K 泵
离子的跨膜分布
[K+]o << [K+]i [Na+]o >> [Na+]i
离子通道
(ion channels)
离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。
特性：通透性（permeation）
穿孔囊泡膜外面向外模式
(perforated vesicle outside-out mode)
• 穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜片断端融合封闭而成）。如果条件较好，此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有比较接近正常的细胞内信号传递条件和代谢条件的基础上，可能记录到膜外面向外模式的单一离子通道。
Patch clamp-whole cell
细胞吸附膜片 (cell-attached patch mode)
• 一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电流进行记录的模式。优点是不破坏细胞的完整性, 内环境保持正常。缺点是不能人为直接地控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电位。即使在浴液中加入刺激物质，也不能到达与电极内液接触的膜片的细胞外面。但是，如果膜片离子通道对浴液中的刺激物有反应，则可以说明这种刺激物是经过某些细胞内第二信使的介导间接地起作用。
• 1992 年，在脑片膜片钳技术上，美国 Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性膜电位的变化规律。
• 1993年，德国的Dodt和Sakmann合作，利用红外电视显微镜监视，使得膜片钳记录不但能够在神经元胞体及其树突上进行，而且可同时在这两个不同的部位作膜片钳记录。
• 环核苷酸门控通道气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 • 机械门控通道一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 • 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
•
History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage
• • • •
clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞的运动，并提出了“通道”的概念。 1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模型（简称H-H模型），荣获诺贝尔医学/生理学奖。 1976年，Neher和Sakmann建立膜片钳(Patch clamp) 技术。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。 1991年， Neher和Sakmann的膜片钳技术荣获诺贝尔医学/生理学奖。
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位； 1969 年，又证实 N － M 接触后的 Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。 • 1976 年，德国的 Neher 和 Sakmann 发明 Patch Clamp （膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。 • 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了10~100 GΩ的高阻封接(giga seal) ，大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。
cell electrophysiology & patch clamp techniques
1991 Nobel基金会的颁奖评语：
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学
电生理学研究简史：
• 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 • 1825年，Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有电流存在。 • 1912年，Bridge 确定了AP的“全或无” 现象。同年， Oxford 提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel 奖。
The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991)
Erwin Neher 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fü r Biophysikalische Chemie, Goettingen, Federal Republic of Germany
组织切片膜片钳技术（Slice patch）
• 过去认为，膜片钳只能在培养细胞或酶解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表面比较光滑，才能够形成高阻封接，但缺点是组织的正常三维结构被破坏，并且对神经中枢内突触特有的传递机能的研究无法展开。于是，一些学者建立了组织切片膜片钳技术（ Slice patch ），就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用
3、离子通道药理学
细胞电生理学
Electrophysiology
离子、离子通道
细胞兴奋
生物电信号
测量
细胞生理学
细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动
膜的“流动镶嵌模型”
细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al . 1946年）
外面向外膜片 (outside-out patch)
• 在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。
开放细胞吸附膜内面向外模式
（open cell-attached inside-out mode）
• 1937 年， Hodgkin 和 Huxley 在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获 1963 年 Nobel奖。 • 1946 年，凌宁和 Gerard 创造拉制出尖端直径小于 1μm 的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。 • Voltage clamp （电压钳技术）由 Cole 和 Marmont 发明，并很快由 Hodgkin 和 Huxley 完善，真正开始了定量研究，建立了 H － H 模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
• 将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。
穿孔膜片模式（perforated patch mode）
• 为克服全细胞模式的胞质渗漏问题， Horn 和 Marty 将与离子亲和的制霉菌素（或二性霉素Ｂ）经膜片微电极灌流到含类甾醇的细胞膜片上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。因为此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。
内面向外膜片 (inside-out patch)
• 在细胞吸附模式高阻封接形成后 ,将微管电极提起 ,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。但是，由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现rundown （或run-up）现象。
b. 1942
膜片钳技术
• 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流，从而了解离子运输、信号传递等信息。